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读书报告翻译

标题：

包含弗林蛋白酶裂解序列的重组蛋白e23sFv-TD-tBID对HER-2阳性肿瘤细胞的选择性毒性的研究

背景：

1.HER2，即人类表皮生长因子受体-2

2．HER2是一种膜表面结合酪氨酸激酶活性型受体。

其涉及转导通路。

该通路导致了细胞生长和分化。

3.它由原癌基因HER2/neu编码.

4.HER-2存在于乳腺癌上的抗原，是免疫疗法的靶点。

5.EGF家族配体无法激活HER-2

6.然而HER-2和ErbB受体家族的其他成员由单体转化为二聚体聚合可以激活其活性。

（EGFR属于ErbB受体家族的一种）

简介：

1.HER2/neu原癌基因编码了一个分子量在185kDa的跨膜糖蛋白，其属于生长因子受体家族，并且它本身带有酪氨酸激酶活性。

2.在25%到30%的原发性人类乳腺癌中都有HER2/neu的高表达，其也与预后差有关。

3.因为它在喜欢在肿瘤细胞表达，所以它是理想的以抗体为导向的靶点。

4.免疫毒素依靠其毒性的效能，通过特异性的配体锁定癌细胞达到杀死肿瘤细胞的作用。

5.目前另一种重组免疫毒素已成功地用于临床试验。

e23sFv-TD-tBID介绍

1．基于先前构建的免疫毒素e23sFv-PEA40，我们开发出一组重组免疫促凋亡分子。

其包括了抗-HER2单链可变区抗体片段（scFv）。

2.BID属于促凋亡Bcl-2蛋白家族，主要在线粒体水平参与了细胞凋亡的调控

3.Bid蛋白水解形成其截短形式tBID。

tBID是促凋亡活性的一个先决条件。

tBID可以促进凋亡因子的释放。

4.一个大小在10个残基的弗林蛋白酶裂解序列融合在抗体片段和tBID之间。

图片：

A代表：

重组免疫促凋亡分子e23sFv-TD-tBID。

N末端有HIS标签。

B：

表达重组蛋白的细菌SDS-PAGE分析。

C:

纯化后蛋白SDS-PAGE分析

D：

Westernblot分析。

重组蛋白的活性鉴定：

1.细胞ELISE：

A.HER2阳性SKBR3细胞和HER2受体阴性的人脐静脉内皮细胞（内皮细胞）接种于96孔板。

B.用含有6%牛血清白蛋白的PBS封闭后，加入纯化后的1μg/mLe23sFv-TDtBID孵育90min。

再用抗HIS单抗和辣根过氧化物酶抗鼠IgG孵育2次，每次1h。

在使用3,3'，5,5'-四甲基联苯胺后，在450nm处测其吸收峰。

C.通过检测线粒体膜电位损失评估促凋亡效果

1.体内抗肿瘤活性：

在雌性BALB/c裸鼠

（4-6周龄）右侧乳腺细胞接种5×106人

乳腺癌SK-BR-3脂肪。

用不同的治疗因子处理细胞：

e23sFv-TD-tBID（5mg/KG，在0,2,4,6,8天时处理），赫赛汀（10mg/kg,处理时间同上），紫杉类药物紫杉醇（15毫克/公斤，1-3天时处理），阿霉素（5mg/kg,1天），PBS作对照。

每周测定小鼠体重和肿瘤的大小两到三次。

结果：

图2：

A表示，细胞酶联免疫吸附实验中e23sFv-TD-tBID对HER2阴性细胞HUVEC和HER2阳性细胞SK-BR-3的实验结果。

B表示，各种HER2阳性的细胞，一种HER2阴性的细胞和重组抗体e23sFv-TD-tBID的特异性结合能力。

C表示，当加入抗HER2单抗时，重组蛋白的特异结合能力，这个实验旨在说明附加物tBID并没有改变e23sFv的结合特异性。

D表示，通过共聚焦显微镜观察到的SK-BR-3细胞中内化的重组免疫毒素（e23sFv-TD-tBID）。

小图a表示，在4摄氏度下孵育的情况，小图b表示，在37摄氏度下孵育的情况。

2.结果显示重组蛋白可以完全结合到所有5种HER2阳性细胞。

当加入HER2单抗后，这种互动可以被完全阻断，表面tBID并没有改变e23sFv的结合特异性。

图3：

A，流式细胞仪分析HER2的表达水平。

B，共聚焦显微镜分析e23sFv-TD-tBID对人类乳腺癌肿瘤细胞结合实验结果。

对照组用了同样带有HIS标签的蛋白作为对照。

这个实验表明，his标签没有影响重组抗体的特异性。

图4：

A，5种肿瘤细胞用重组蛋白处理48小时的剂量反应曲线（可以先不说这组实验说明各种肿瘤细胞HER2表面表达量和其对重组抗体敏感性的关联性。

）

B，诱导细胞凋亡评估

C，e23sFv-TD-tBID介导的细胞凋亡的特点是线粒体跨膜电位减少

D,Baf：

内涵体抑制物bafdec-RVKR-cmk：

弗林蛋白酶抑制物BFA：

蛋白质运输抑制剂bfa最后文章总结说：

内化的重组蛋白在被弗林蛋白酶裂解后直接转运至细胞质。

图5：

A，三组小鼠在用重组蛋白处理后其肿瘤生长有明显的抑制，在5或10mg/kg时生长几乎停止了。

B，在联合用其它药物治疗时，如阿霉素或紫杉醇，重组蛋白的抑制效果更好。

C，表示了e23sFv-TD-tBID，赫赛汀，或化疗处理的小鼠的存活时间要长于未处理小鼠

D，用e23sFv-TD-tBID，赫赛汀处理的小鼠的存活时间要长于用其它化疗药物处理的小鼠。

同时也能看出，5mg/kg重组蛋白和10mg/kg赫赛汀效果一样。

讨论

1，我们的长远目标是研制一种可用于癌症治疗的重组蛋白

2，e23sFv-TD-tBID由一个抗HER2的抗体和截短型BID组成，他们之间由弗林蛋白酶裂解序列连接，这样便加强了其杀伤细胞效果。

3，内吞体/溶酶体抑制剂和furin抑制剂可以显著降低e23sFv-TD-tBID的细胞毒性，但跨高尔基网络抑制剂对其无效。

表明e23sFv-TD-tBID在通过细胞质时通过内吞体/溶酶体处理加工，再被furin处理，而不是通过跨高尔基网络。

4，e23sFv-TD- tBID通过结合到细胞表面引发一系列复杂的步骤，包括内吞作用，水解，并进入靶细胞胞浆最后杀死细胞。

5，在细胞质中其具体过程是，被激活的tBID锚定在线粒体膜，从而导致不可逆转的线粒体损伤和细胞色素c的释放，诱导细胞凋亡。

注解:

弗林蛋白酶（Furin）是类似细菌枯草杆菌蛋白酶（subtilisin）和酵母Kexin的一种内切蛋白酶，在各种真核细胞中还发现了许多与Furin类似的同源物，这些同源物统称为前体蛋白转化酶，它们的共同特点是能切割前体蛋白，

促进前体蛋白获得生物活性。

Furin是一种由794个氨基酸组成的I型跨膜蛋白，Furin属于丝氨酸枯草杆菌蛋白酶超家族中前体蛋白转化酶家族成员。

Furin的另一种底物——胰岛素样生长因子1（insulin—likegrowthfactor一1，IGFl）在结肠、乳腺、肺以及前列腺肿瘤中被上调。

记下来！

Thesedatasuggestthatrecombinante23sFv-TD-tBIDhastherapeuticpotentialfor

HER2-positivetumorsandwarrantfurthertestingforclinicalapplications

HER2

　　原癌基因人类表皮生长因子受体2（humanepidermalgrowthfactorreceptor-2,HER2）基因,即c-erbB-2基因,定位于染色体17q12-21.32上,编码相对分子质量为185000的跨膜受体样蛋白,具有酪氨酸激酶活性[1]。

是重要的乳腺癌预后判断因子,HER2阳性（过表达或扩增）的乳腺癌,其临床特点和生物学行为有特殊表现,治疗模式也与其他类型的乳腺癌有很大的区别。

检测方法有免疫组化、FISH等。

目前已有针对该基因失活的药物---赫赛汀

HER2的表达增加

还观察到结肠，前列腺癌，肺癌，胃癌

癌症

BH3是什么：

？

凋亡相关蛋白中的Bcl-2家族是细胞凋亡的关键调节分子,由抗凋亡和促凋亡成员组成,这些成员之间通过相互协同作用调节了线粒体结构与功能的稳定性,从而在线粒体水平发挥着细胞凋亡的"开关"作用.抗凋亡成员大都分布于线粒体的外膜,与促凋亡成员的BH3结构域相互作用对细胞凋亡发挥抵抗作用

促凋亡成员则主要分布于细胞浆中,细胞接受死亡信号刺激后,促凋亡成员自身受到一系列的调节,如典型的Bax构象改变、BAD和Bik的磷酸化调节以及Bid和Bim的蛋白裂解效应等,使得促凋亡成员在凋亡信号的刺激下整合于线粒体外膜,最终导致线粒体通透转换孔的开放,进而释放包括细胞色素c、凋亡诱导因子、Smac等重要的凋亡因子,随后caspase被激活进而断裂重要的细胞内结构蛋白与功能分子,执行细胞凋亡.，一些仅含BH3结构域的促凋亡蛋白，如

BAD，Bik可以和抗凋亡蛋白Bcl-2结合的同时拮

抗了Bcl-2的抗凋亡作用，从而使得Bid和Bim可

以直接激活Bax

，导致Bax移位到线粒体并形成

同源二聚体蛋白通道，这种插入到线粒体外膜的

Bax通道足以促进细胞色素c的释放，接着导致

caspase的激活和细胞凋亡

tBID:

?

另外一种激活促凋亡蛋白的方式是促凋亡蛋白

的断裂，最好的例证便是，仅含有BH3结构域的

Bid对于死亡受体激活的应答中发挥了这种机制．

在此过程中，死亡受体激活了caspase-8，使得存

在于胞浆中的非活性的Bid断裂形成具有活性的

tBid，并转位到线粒体

断裂后的tBid向线粒体的转位增加了线粒体通透

性

流式AnnexinV/PI法：

以1:

4稀释bindingbuffer（50mLbuffer+150mL

蒸馏水），在稀释的buffer重悬细胞，并调整细胞

浓度2-×105/mL，取195μL细胞悬液加入5μL

AnnexinV-FITC,室温孵育10min,洗细胞n次后，

再重悬细胞于190μLbindingbuffer,加入10μLPI,

室温孵育10min,上流式细胞仪检测。

AnnexinV：