读书报告翻译.docx
《读书报告翻译.docx》由会员分享,可在线阅读,更多相关《读书报告翻译.docx(7页珍藏版)》请在冰豆网上搜索。
![读书报告翻译.docx](https://file1.bdocx.com/fileroot1/2023-5/24/1a349ae9-c414-45b6-9724-c9293fac6970/1a349ae9-c414-45b6-9724-c9293fac69701.gif)
读书报告翻译
标题:
包含弗林蛋白酶裂解序列的重组蛋白e23sFv-TD-tBID对HER-2阳性肿瘤细胞的选择性毒性的研究
背景:
1.HER2,即人类表皮生长因子受体-2
2.HER2是一种膜表面结合酪氨酸激酶活性型受体。
其涉及转导通路。
该通路导致了细胞生长和分化。
3.它由原癌基因HER2/neu编码.
4.HER-2存在于乳腺癌上的抗原,是免疫疗法的靶点。
5.EGF家族配体无法激活HER-2
6.然而HER-2和ErbB受体家族的其他成员由单体转化为二聚体聚合可以激活其活性。
(EGFR属于ErbB受体家族的一种)
简介:
1.HER2/neu原癌基因编码了一个分子量在185kDa的跨膜糖蛋白,其属于生长因子受体家族,并且它本身带有酪氨酸激酶活性。
2.在25%到30%的原发性人类乳腺癌中都有HER2/neu的高表达,其也与预后差有关。
3.因为它在喜欢在肿瘤细胞表达,所以它是理想的以抗体为导向的靶点。
4.免疫毒素依靠其毒性的效能,通过特异性的配体锁定癌细胞达到杀死肿瘤细胞的作用。
5.目前另一种重组免疫毒素已成功地用于临床试验。
e23sFv-TD-tBID介绍
1.基于先前构建的免疫毒素e23sFv-PEA40,我们开发出一组重组免疫促凋亡分子。
其包括了抗-HER2单链可变区抗体片段(scFv)。
2.BID属于促凋亡Bcl-2蛋白家族,主要在线粒体水平参与了细胞凋亡的调控
3.Bid蛋白水解形成其截短形式tBID。
tBID是促凋亡活性的一个先决条件。
tBID可以促进凋亡因子的释放。
4.一个大小在10个残基的弗林蛋白酶裂解序列融合在抗体片段和tBID之间。
图片:
A代表:
重组免疫促凋亡分子e23sFv-TD-tBID。
N末端有HIS标签。
B:
表达重组蛋白的细菌SDS-PAGE分析。
C:
纯化后蛋白SDS-PAGE分析
D:
Westernblot分析。
重组蛋白的活性鉴定:
1.细胞ELISE:
A.HER2阳性SKBR3细胞和HER2受体阴性的人脐静脉内皮细胞(内皮细胞)接种于96孔板。
B.用含有6%牛血清白蛋白的PBS封闭后,加入纯化后的1μg/mLe23sFv-TDtBID孵育90min。
再用抗HIS单抗和辣根过氧化物酶抗鼠IgG孵育2次,每次1h。
在使用3,3',5,5'-四甲基联苯胺后,在450nm处测其吸收峰。
C.通过检测线粒体膜电位损失评估促凋亡效果
1.体内抗肿瘤活性:
在雌性BALB/c裸鼠
(4-6周龄)右侧乳腺细胞接种5×106人
乳腺癌SK-BR-3脂肪。
用不同的治疗因子处理细胞:
e23sFv-TD-tBID(5mg/KG,在0,2,4,6,8天时处理),赫赛汀(10mg/kg,处理时间同上),紫杉类药物紫杉醇(15毫克/公斤,1-3天时处理),阿霉素(5mg/kg,1天),PBS作对照。
每周测定小鼠体重和肿瘤的大小两到三次。
结果:
图2:
A表示,细胞酶联免疫吸附实验中e23sFv-TD-tBID对HER2阴性细胞HUVEC和HER2阳性细胞SK-BR-3的实验结果。
B表示,各种HER2阳性的细胞,一种HER2阴性的细胞和重组抗体e23sFv-TD-tBID的特异性结合能力。
C表示,当加入抗HER2单抗时,重组蛋白的特异结合能力,这个实验旨在说明附加物tBID并没有改变e23sFv的结合特异性。
D表示,通过共聚焦显微镜观察到的SK-BR-3细胞中内化的重组免疫毒素(e23sFv-TD-tBID)。
小图a表示,在4摄氏度下孵育的情况,小图b表示,在37摄氏度下孵育的情况。
2.结果显示重组蛋白可以完全结合到所有5种HER2阳性细胞。
当加入HER2单抗后,这种互动可以被完全阻断,表面tBID并没有改变e23sFv的结合特异性。
图3:
A,流式细胞仪分析HER2的表达水平。
B,共聚焦显微镜分析e23sFv-TD-tBID对人类乳腺癌肿瘤细胞结合实验结果。
对照组用了同样带有HIS标签的蛋白作为对照。
这个实验表明,his标签没有影响重组抗体的特异性。
图4:
A,5种肿瘤细胞用重组蛋白处理48小时的剂量反应曲线(可以先不说这组实验说明各种肿瘤细胞HER2表面表达量和其对重组抗体敏感性的关联性。
)
B,诱导细胞凋亡评估
C,e23sFv-TD-tBID介导的细胞凋亡的特点是线粒体跨膜电位减少
D,Baf:
内涵体抑制物bafdec-RVKR-cmk:
弗林蛋白酶抑制物BFA:
蛋白质运输抑制剂bfa最后文章总结说:
内化的重组蛋白在被弗林蛋白酶裂解后直接转运至细胞质。
图5:
A,三组小鼠在用重组蛋白处理后其肿瘤生长有明显的抑制,在5或10mg/kg时生长几乎停止了。
B,在联合用其它药物治疗时,如阿霉素或紫杉醇,重组蛋白的抑制效果更好。
C,表示了e23sFv-TD-tBID,赫赛汀,或化疗处理的小鼠的存活时间要长于未处理小鼠
D,用e23sFv-TD-tBID,赫赛汀处理的小鼠的存活时间要长于用其它化疗药物处理的小鼠。
同时也能看出,5mg/kg重组蛋白和10mg/kg赫赛汀效果一样。
讨论
1,我们的长远目标是研制一种可用于癌症治疗的重组蛋白
2,e23sFv-TD-tBID由一个抗HER2的抗体和截短型BID组成,他们之间由弗林蛋白酶裂解序列连接,这样便加强了其杀伤细胞效果。
3,内吞体/溶酶体抑制剂和furin抑制剂可以显著降低e23sFv-TD-tBID的细胞毒性,但跨高尔基网络抑制剂对其无效。
表明e23sFv-TD-tBID在通过细胞质时通过内吞体/溶酶体处理加工,再被furin处理,而不是通过跨高尔基网络。
4,e23sFv-TD- tBID通过结合到细胞表面引发一系列复杂的步骤,包括内吞作用,水解,并进入靶细胞胞浆最后杀死细胞。
5,在细胞质中其具体过程是,被激活的tBID锚定在线粒体膜,从而导致不可逆转的线粒体损伤和细胞色素c的释放,诱导细胞凋亡。
注解:
弗林蛋白酶(Furin)是类似细菌枯草杆菌蛋白酶(subtilisin)和酵母Kexin的一种内切蛋白酶,在各种真核细胞中还发现了许多与Furin类似的同源物,这些同源物统称为前体蛋白转化酶,它们的共同特点是能切割前体蛋白,
促进前体蛋白获得生物活性。
Furin是一种由794个氨基酸组成的I型跨膜蛋白,Furin属于丝氨酸枯草杆菌蛋白酶超家族中前体蛋白转化酶家族成员。
Furin的另一种底物——胰岛素样生长因子1(insulin—likegrowthfactor一1,IGFl)在结肠、乳腺、肺以及前列腺肿瘤中被上调。
记下来!
Thesedatasuggestthatrecombinante23sFv-TD-tBIDhastherapeuticpotentialfor
HER2-positivetumorsandwarrantfurthertestingforclinicalapplications
HER2
原癌基因人类表皮生长因子受体2(humanepidermalgrowthfactorreceptor-2,HER2)基因,即c-erbB-2基因,定位于染色体17q12-21.32上,编码相对分子质量为185000的跨膜受体样蛋白,具有酪氨酸激酶活性[1]。
是重要的乳腺癌预后判断因子,HER2阳性(过表达或扩增)的乳腺癌,其临床特点和生物学行为有特殊表现,治疗模式也与其他类型的乳腺癌有很大的区别。
检测方法有免疫组化、FISH等。
目前已有针对该基因失活的药物---赫赛汀
HER2的表达增加
还观察到结肠,前列腺癌,肺癌,胃癌
癌症
BH3是什么:
?
凋亡相关蛋白中的Bcl-2家族是细胞凋亡的关键调节分子,由抗凋亡和促凋亡成员组成,这些成员之间通过相互协同作用调节了线粒体结构与功能的稳定性,从而在线粒体水平发挥着细胞凋亡的"开关"作用.抗凋亡成员大都分布于线粒体的外膜,与促凋亡成员的BH3结构域相互作用对细胞凋亡发挥抵抗作用
促凋亡成员则主要分布于细胞浆中,细胞接受死亡信号刺激后,促凋亡成员自身受到一系列的调节,如典型的Bax构象改变、BAD和Bik的磷酸化调节以及Bid和Bim的蛋白裂解效应等,使得促凋亡成员在凋亡信号的刺激下整合于线粒体外膜,最终导致线粒体通透转换孔的开放,进而释放包括细胞色素c、凋亡诱导因子、Smac等重要的凋亡因子,随后caspase被激活进而断裂重要的细胞内结构蛋白与功能分子,执行细胞凋亡.,一些仅含BH3结构域的促凋亡蛋白,如
BAD,Bik可以和抗凋亡蛋白Bcl-2结合的同时拮
抗了Bcl-2的抗凋亡作用,从而使得Bid和Bim可
以直接激活Bax
,导致Bax移位到线粒体并形成
同源二聚体蛋白通道,这种插入到线粒体外膜的
Bax通道足以促进细胞色素c的释放,接着导致
caspase的激活和细胞凋亡
tBID:
?
另外一种激活促凋亡蛋白的方式是促凋亡蛋白
的断裂,最好的例证便是,仅含有BH3结构域的
Bid对于死亡受体激活的应答中发挥了这种机制.
在此过程中,死亡受体激活了caspase-8,使得存
在于胞浆中的非活性的Bid断裂形成具有活性的
tBid,并转位到线粒体
断裂后的tBid向线粒体的转位增加了线粒体通透
性
流式AnnexinV/PI法:
以1:
4稀释bindingbuffer(50mLbuffer+150mL
蒸馏水),在稀释的buffer重悬细胞,并调整细胞
浓度2-×105/mL,取195μL细胞悬液加入5μL
AnnexinV-FITC,室温孵育10min,洗细胞n次后,
再重悬细胞于190μLbindingbuffer,加入10μLPI,
室温孵育10min,上流式细胞仪检测。
AnnexinV: