实验一蛋白质的沉淀与凝固.docx

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实验一蛋白质的沉淀与凝固

Ⅱ实验内容

实验一蛋白质的沉淀与凝固

蛋白质溶液是一稳固的亲水性溶胶液，其稳固的因素有二：

一是蛋白质胶粒上的电荷使之彼此排斥，不易凝集成团；二是胶粒表面的水化膜，它使胶粒与水融洽相依，又在胶粒之间起了隔离作用。

若是上述两种稳固蛋白质溶液的因素被破坏，蛋白质将于溶液中沉淀析出。

促使蛋白质沉淀的因素很多，大致可分为两类：

第一类是可逆的沉淀反映。

这时蛋白质的空间构象未受到专门大改变，除去沉淀因素后，能够从头溶解，例如盐析和低温乙醇沉淀蛋白。

第二类是不可逆的沉淀反映，重金属盐类或生物碱试剂沉淀蛋白后，由于蛋白质结构发生重大改变，所以再也不溶于水中。

不可逆的蛋白质沉淀多表示蛋白质已经变性。

变性的蛋白质在等电点周围加热时，蛋白质分子间彼此盘绕而变成坚实的凝块。

一、蛋白质的盐析

[原理]

高浓度的盐离子可与蛋白质胶粒争夺水化膜，同时盐又是强电解质，可抑制蛋白质的解离。

因此用高浓度的中性盐，使蛋白质带电量减少，水化膜破坏而从溶液中沉淀出来。

盐析沉淀蛋白一般不引发蛋白变性，故常常利用于分离各类天然蛋白质。

由于蛋白质的组成及性质不同，所以盐析时所需中性盐的浓度也不相同。

例如半饱和的硫酸铵沉出球蛋白，饱和的硫酸铵则沉出清蛋白。

[操作]

1.取一试管，加入3ml5%蛋白质溶液及3ml饱和硫酸铵溶液，摇匀静止数分钟后观察现象。

2.将试管内容物过滤，加硫酸铵粉末于滤液中，使达饱和状态，摇匀后观察现象。

（注意固体硫酸铵若加到过饱和则有结晶析出，勿与蛋白质沉淀混淆。

）

3.取上项浑浊液1ml，加水2ml，观察是不是复容。

二.乙醇沉淀蛋白质

[原理]

乙醇是脱水剂，可与蛋白质争夺水化膜；另外，加入乙醇可使水的介电常数变小，蛋白质解离度降低，带电量减少。

故加入乙醇能破坏蛋白质的胶体性质而使蛋白质沉淀。

用此法在低温下操作可使沉出的蛋白质维持其理化特性及其生物学活性，但室温中乙醇与蛋白质接触较久后，可使之变性，形成不可逆的沉淀。

[操作]

1.取试管4支，标出1、2、3、4号码，按下表操作

试剂

1

2

3

4

5%蛋白质溶液（ml）

1

1

1

-

1%乙酸（滴）

-

1-2

-

-

95%乙醇（ml）

-

-

-

2

2.将3管及4管置冰水中，放置5分钟，然后将第4管的冰乙醇倒入第3管中（此步最好在冰水中进行），混匀，同时向第1及第2管中各加入未冰浴的乙醇2ml混匀，观察各管的沉淀情形并当即向第1、2及3管中各加入蒸馏水10ml，混匀，比较各管转变并解释之。

三.重金属盐沉淀蛋白

[原理]

在溶液的PH值大于蛋白质的等电点时，带负电荷的蛋白质与重金属离子（Ca2+、Hg2+、Ag1+、Pb2+等）结合成盐而沉淀。

[操作]

取试管4支，按下表操作。

试剂（滴）

1

2

3

4

5%蛋白质溶液

5

5

5

5

1%乙酸

-

-

10

10

10g/L硫酸铜

3

-

3

-

30g/L硝酸银

-

3

-

3

混合均匀，比较各管浑浊程度并解释之。

四.生物碱试剂沉淀蛋白

[原理]

能沉淀生物碱（或植物碱）或与其产生颜色反映的物质称为生物碱试剂，如鞣酸、苦味酸、磷钨酸等。

在溶液的PH值小于蛋白质的等电点时，带正电荷的蛋白质与生物碱试剂的负离子结合成盐而沉淀。

[操作]

取试管3支，按下表操作。

试剂

1

2

3

5%蛋白质溶液（ml）

1

1

1

1%乙酸（滴）

10

10

10

苦味酸溶液（滴）

数滴

-

-

鞣酸溶液（滴）

-

数滴

-

三氯乙酸溶液（滴）

-

-

数滴

混合均匀，比较各管浑浊程度并解释之。

五.蛋白质的加热凝固

[原理]

蛋白质在其等电点周围加热，即发生变性凝固，在加热进程中，随着蛋白质变性作用的深化，使已变性的蛋白质分子间凝聚成凝胶状的蛋白块。

但应注意，当蛋白质溶液远离等电点而带有很多同种电荷时，加热虽可使其变性，但因同种电荷的排斥作用并非发生凝固现象。

[操作]

取试管4支，按下表操作

试剂

1

2

3

4

5%蛋白质溶液（ml）

2

2

2

2

1%乙酸（滴）

-

1-2

-

-

10%乙酸（ml）

-

-

-

100g/LNaOH（ml）

-

-

-

混匀后各管别离加热，观察有否沉淀析出及沉淀析出的多少、快慢并解释之。

。

另外在第2管加热蛋白沉出后再加入5ml蒸馏水，观察是不是复溶，为什麽？

[试剂]

1．5%蛋白溶液：

掏出鸡蛋清用蒸馏水稀释5倍，搅匀后用纱布过滤。

2．饱和硫酸铵溶液。

3．硫酸铵结晶粉末。

4．95%乙醇。

5．1%乙酸和10%乙酸。

6．30g/L硝酸银溶液。

7．10g/L硫酸铜溶液。

8．100g/L氢氧化钠溶液。

9．苦味酸饱和溶液及鞣酸饱和溶液。

10．100g/L三氯乙酸溶液。

（李素婷）

实验三微量凯氏定氮法

[原理]

蛋白质样品与浓硫酸共热时，分解出氮、二氧化碳和水，而氮转变成氨，氨与硫酸结合生成硫酸铵，再与纳氏试剂显色，与标准液比较，可求其含氮量。

如测血清蛋白，可将总氮量减去非蛋白氮量，再乘以即得蛋白质量。

[操作]

1．取血清或血浆，以%NaCl溶液稀释至10ml（稀释50倍）

2．取消化管1支，加入稀释血清，50%硫酸,玻璃珠1枚，在电炉上消化。

3．当出现白雾并充满消化管时，消化管口加玻盖，再继续消化3分钟左右，冷却，加3%H2O21~2滴，再消化至出现白雾，加盖，继续消化至无色透明，完全冷却后加蒸馏水至，再加纳氏试剂至25ml，混匀，与标准管比色。

4．标准管制备：

取硫酸铵标准液（应用液）制备标准曲线，以蒸馏水作空白调零，500nm波长比色。

5．标准曲线制备：

取硫酸铵标准液（应用液）制备标准曲线，取5支干净试管操作如下

试剂（ml）

1

2

3

4

5

标准硫酸铵应用液

-

18NH2SO4

蒸馏水

混匀，各管加奈氏试剂ml,以第1管为空白，用500nm波长比色得各管光密度值，以浓度为横坐标，测得各管光密度为纵坐标，作一标准曲线。

6．测得测定管的光密度值，于标准曲线上查出含氮量。

[计算]

蛋白质g%=含氮量⨯⨯100

[试剂]

1．50%硫酸

2.18N硫酸溶液：

取比重的分析纯浓硫酸50毫升慢慢加到50毫升蒸馏水中。

3.3%H2O2

4.%NaCl

5.奈氏试剂：

奈氏试剂贮存液：

于500毫升锥形瓶内加入碘化钾150克，碘110克及蒸馏水100毫升和纯汞150克，振摇到碘色将变时（约15分钟），混合液发生高热，将锥型瓶放入冷水内继续振摇至棕红色的碘转变成带绿色的碘化钾汞溶液时为止。

将上清液倾入2000毫升的量筒中，用蒸馏水洗涤瓶内壁及瓶内沉淀物数次，将洗液一并倾入量筒中，加蒸馏水至2000毫升。

奈氏试剂应用液：

取10%氢氧化钠溶液700毫升，加入奈氏贮存液150毫升，摇匀，用蒸馏水稀释到1000毫升。

如浑浊，可静止留宿，取上请液备用。

6．硫酸胺标准贮存液：

（1毫升=1毫克氮）

取分析纯硫酸铵置烤箱中110oC，干燥半小时，掏出置干燥器内待其冷却，准确称取干燥的硫酸铵克，置1000毫升量瓶中，加蒸馏水300毫升使之溶解，加纯浓硫酸1毫升，再加蒸馏水至刻度。

（NH4）2SO4分子量；其氮占28。

故：

﹕28=﹕X

X=1

即克硫酸铵中含氮1克

7．硫酸铵标准应用液：

取硫酸铵标准贮存液毫升，于100毫升容量瓶中，加纯硫酸毫升，以蒸馏水稀释至刻度，于带磨口玻璃瓶中保留。

（周晓慧）

实验四双缩尿法测定蛋白质含量

[原理]

凡含有两个以上肽键的化合物在碱性溶液中能与硫酸铜作用生成紫色或紫红色的复合物，这一反映称为双缩尿反映。

蛋白质含有肽键，因此一切蛋白质都可与双缩尿试剂发生颜色反映，且颜色的深浅与蛋白质浓度成正比，经与一样处置的标准蛋白溶液相较，即可求出样品中的蛋白质含量。

[操作]

1.标准曲线的制备

取6支试管按下表配成不同浓度的标准蛋白液

试剂

1

2

3

4

5

6

标准蛋白溶液（10mg/ml）

生理盐水（ml）

双缩脲试剂（ml）

蛋白浓度（mg/ml）

混匀后，于37℃水浴中保温15分钟，在520nm波长下比色，以第一管调零，测得各管的光密度。

以各管的光密度值为纵坐标，以蛋白质浓度为横坐标，绘制标准曲线。

2.样品测定

取待测蛋白样品，加生理盐水，再加双缩脲试剂，于37℃水浴中保温15分钟，测其光密度，查标准曲线即可得出样品中的蛋白质含量。

[试剂]

1．10g/L标准蛋白溶液：

准确称取经凯式定氮法校正的结晶牛血清蛋白或人血清蛋白10g，用生理盐水配成浓度为10mg/ml。

2．双缩尿试剂：

称取CuSO4•5H2O、蒸馏水100ml加热助溶。

另取酒石酸钾钠10g、碘化钾5g，溶于500毫升蒸馏水中，再加200g/LNaOH300ml混合，然后将硫酸铜溶液倾入，加蒸馏水至1000ml。

3.生理盐水

（周晓慧）

实验五改良酚试剂法测定蛋白质含量

[原理]

蛋白质中所含酪氨酸和色氨酸等残基能在碱性条件下与酚试剂之磷钼酸、磷钨酸作用产生蓝色化合物，其颜色深浅与蛋白质含量成正比。

利用蓝色深浅与蛋白质浓度成正比的关系可绘制标准曲线，测定样品中蛋白质含量。

[操作]

（一）制作标准曲线

1．取试管6支别离编号，按下表加入试剂：

试剂（ml）

1

2

3

4

5

6

标准蛋白溶液（1mg/ml）

生理盐水

试剂A

混匀后置于50︒C水浴10分钟，冷却后各管加入试剂B，室温放置10分钟，各管加入试剂C3ml，当即混匀，置37︒C水浴箱恒温10分钟。

冷却后以1号管为空白，在分光光度计上以波长650nm比色，读取光密度值。

2.以各标准样品蛋白质浓度为横坐标，各管光密度值为纵坐标作标准曲线。

（二）样品测定

取试管2支，按下表加入试剂

试剂（ml）

测定管

空白管

稀释的待测样品

-

生理盐水

-

试剂A

混匀后在50︒C水浴箱中保温10分钟，掏出冷却后，两管各加试剂B，室温放置10分钟，再各加试剂C3ml，当即混匀，置37︒C水浴箱保温10分钟，冷却后在分光光度计上以波长650nm比色读取光密度值。

[结果与计算]

按照测定管光密度值查标准曲线，由标准曲线计算样品蛋白质含量。

[注意事项]

1.测定蛋白质的浓度应在～ml范围。

2.各管加酚试剂必需快速，并当即摇匀，不该出现混浊。

[试剂]

1.标准蛋白溶液：

称量干燥的人血清白蛋白（BSA）或丙种球蛋白10mg，用生理盐水配制成1mg/ml的标准蛋白溶液。

2．试剂A：

2g酒石酸钾钠及100gNa2CO3溶于500ml1mol/LNaOH中，用蒸馏水稀至1000ml。

3．试剂B：

2g酒石酸钾钠及1gCuSO4⋅5H2O别离溶解于少量水中，混合后加蒸馏水至90ml，再加10ml1mol/LNaOH即成。

4．试剂C：

（1）市售的酚试剂，用1mol/LNaOH滴定相当于mol/LHCl，按1﹕10稀释即可。

（2）称取Na2WO4⋅2H2O100g及Na2MoO4⋅2H2O25g溶于700ml蒸馏水中，加入85%H3PO450ml，浓HCl100ml混匀后，置圆底烧瓶中回流10小时，加入硫酸锂（Li2SO4⋅H2O）150g、蒸馏水50ml及浓溴水数滴，继续煮沸15分钟去溴，冷却后稀释至1000ml，过滤，溶液应为金黄色，置棕色瓶中保留，使历时稀释至1mol/L。

（周晓慧）

实验六紫外分光光度法测定蛋白质含量

[原理]

蛋白质在280nm处的特征性吸收峰，是由于其中所含有的芳香族氨基酸：

酪氨酸、色氨酸、苯丙氨酸所引发的，其光密度和蛋白质的浓度呈线性关系，可用于蛋白质的定量。

对于一样浓度的不同蛋白质，若是酪氨酸、色氨酸及苯丙氨酸含量不同，其光密度值也不同，选用标准蛋白质时必需注意。

若样品中含有其它具有紫外吸收的杂质，如核酸、核苷酸等，可产生较大的误差，故应作适当的校正。

蛋白质样品中含有核酸时，混杂的核酸在280nm处也有吸收，对此法有必然的影响。

因此，一般情形下在测定A280的同时，测定A260，计算A280/A260的比值。

若是A280/A260≥，可忽略不计核酸的影响，A280/A260<时，需按下列公式计算蛋白质的浓度：

蛋白质浓度（mg/ml）=[操作]

1．标准曲线的制备：

取试管8支按下表加入试剂

试剂（ml）

1

2

3

4

5

6

7

8

标准蛋白液（1mg/ml）

%NaCl溶液

蛋白浓度（mg/ml）

混匀，选波长280nm，用1cm石英比色杯，第一管为空白，别离测定各管溶液光密度值。

以蛋白浓度为横坐标，光密度值为纵坐标，绘制标准曲线。

2．样品测定：

将待测的蛋白样品用%NaCl溶液稀释，使其浓度在蛋白标准曲线范围之内，混匀后按上述方式测定光密度值，查标准曲线，得出样品的蛋白浓度。

[试剂]

1.标准蛋白液：

准确称取结晶牛血清白蛋白（精准）用%NaCl溶液配置成1mg/ml的溶液（需用凯氏定氮法校正）。

2.%NaCl溶液。

（周晓慧）

实验七凝胶过滤层析分离血红蛋白与硫酸铜

[原理]

血红蛋白（分子量64500）与铜溶液混合物，通过葡聚糖凝胶G-25层析柱，以蒸馏水为洗脱剂，进行分离大分子的血红蛋白和小分子的硫酸铜。

[操作]

1．凝胶的预备：

葡聚糖凝胶G-251g，置于锥形瓶中，加蒸馏水30ml，于滚水浴中煮沸2小时（或在室温放置6小时），待冷却至室温时装柱。

2．装柱：

在层析管底部填少量玻璃棉，关闭玻管的出口。

然后自顶部缓缓加入葡聚糖凝胶G-25悬液。

待底部凝胶沉积1～2cm时，打开出口。

当凝胶上升至距柱顶3cm时即可。

3．样品的制备：

（1）血红蛋白的制备：

取草酸钾抗凝血2ml于离心管中，3000转/分离心5分钟，弃去上清液，再用生理盐水洗血细胞两次。

将血细胞用5倍体积蒸馏水稀释。

（2）铜溶液的制备：

将硫酸铜溶解于10ml热蒸馏水中，冷却后稀释到15ml。

另取柠檬酸钠及碳酸钠（Na2CO3·H2O）10g，加水60ml，加热使之溶解，冷却后稀释到85ml。

以后把硫酸铜溶液缓缓倾入柠檬酸钠-碳酸钠溶液中。

（3）取血红蛋白稀释液、铜溶液按2：

3体积混合，作为样品。

4．加样：

（1）将层析柱出口打开，使床表面的蒸馏水流出，直到床面正好露出，再关闭出口。

（2）用小滴管将样品（约）沿柱内壁缓缓地加于床面上，然后打开流出口，使样品进入床内，直到床面从头露出。

（3）用上述方式加入约2ml蒸馏水。

当快要流干时，反复加入多量蒸馏水，进行洗脱，直至红蓝两条带分开为止。

[试剂]

1．葡聚糖凝胶G-25。

2．草酸钾。

3．生理盐水。

4．硫酸铜。

5．柠檬酸钠。

6．碳酸钠。

（王鲁华）

实验八凝胶过滤层析分离血红蛋白与鱼精蛋白

[原理]

本实验利用交联葡聚糖凝胶（SephadexG-50）将血红蛋白（红色，分子量为64500）与二硝基氟苯-鱼精蛋白，从混合液中分开。

由于它们的分子量及颜色的不同，能够观察到血红蛋白洗脱较快，而鱼精蛋白洗脱较慢。

[操作]

1．凝胶的制备

称取SephadexG-501g，置于锥形瓶中，加蒸馏水30ml，于滚水浴中煮沸1小时（此为加热法溶胀，如在室温溶胀，需浸泡3小时），掏出冷却至室温后再行装柱。

2．装柱

取直径～，长度17～20cm的层析管，在底部填砂芯或少量玻璃棉，装上带有螺旋夹和细玻管的橡皮管，垂直置于铁架上，柱中先加入少量水，充满细玻璃管，并残留部份水于层析管下部，以排除层析柱底部及细玻管内的气泡。

然后关闭玻管的出口，边轻轻搅拌以蒸馏水稀释的葡聚糖凝胶悬浮液，边将其自层析管顶部缓缓加入，待底部凝胶沉积1～2cm时，再打开出口，一面继续加凝胶，待凝胶上升至距玻管顶3cm左右即可停止，最后以蒸馏水平衡凝胶柱。

加入凝胶时速度应均匀，并使凝胶均匀下沉，以避免层析床分层，同时避免柱内有气泡。

如层析床凝胶表面不平整，可在凝胶表面用细玻棒轻轻搅动，再让凝胶自然沉降，使表面平整。

3．样品的制备

（1）血红蛋白（Hb）溶液的制备：

取草酸钾抗凝血2ml于离心管中，以2500r/min离心5分钟，弃去上层血浆，用％NaCl5ml洗血细胞，重复三次，每次要把血球搅起，以3500r/min离心5分钟后尽可能弃去上清液。

加蒸馏水5ml，充分混匀，放冰箱留宿使沉淀的血球充分溶血，备用。

（2）DNP-鱼精蛋白的制备：

称取鱼精蛋白，溶于10％NaHCO3溶液中（现在该蛋白质溶液pH应在～左右）。

另取二硝基氟苯，溶于微热的95％乙醇3ml中，待其充分溶解后，当即倾入上述蛋白质溶液中。

将此管置于滚水浴中，煮沸5分钟，冷却后加2倍体积的95％乙醇，可见黄色的DNP-鱼精蛋白沉淀。

离心5分钟，弃去上清液，沉淀用95％乙醇洗2次，所得沉淀用1ml蒸馏水溶解，即为DNP-鱼精蛋白溶液，备用。

（3）取血红蛋白稀释液，加DNP-鱼精蛋白溶液，充分混匀，此混合液即为样品溶液。

4．加样

加样时先将层析管出口打开，使床表面蒸馏水流出，直到床面正好露出，用下口较大的滴管，将上述样品（约）缓缓沿层析柱内壁小心地加于床表面，注意尽可能不使床面搅动，然后打开出口，使样品进入床内，直到床面从头露出，重复上法加1～2倍于样品体积的蒸馏水，如此可使样品的稀释最小，而样品又完全进入床内。

当少量蒸馏水快要流干时，加入蒸馏水使其充满层析柱上面空间，开始洗脱。

5．洗脱与搜集

反复加入蒸馏水洗脱，调节出口处螺旋夹，使洗脱速度在～／分左右（约10～15滴／分）洗脱时可观察到黄、红两条区带逐渐分开，当红色的血红蛋白区带抵达玻管下端时，用带刻度的离心管搜集流出液，直至红色液全数流出为止，待测。

再换以另一离心管，搜集黄色的DNP-鱼精蛋白洗脱液，直至黄色液全数洗出为止，此液可回收从头利用。

[结果与计算]

取一试管吸取前述血红蛋白液，加蒸馏水至5ml作为标准管（上柱前液），取搜集的血红蛋白液加蒸馏水至5ml。

以蒸馏水为对照，测得标准管及搜集管液体在540nm波优势的光密度值，按下列公式计算血红蛋白的回收率。

血红蛋白回收率（％）＝洗脱搜集液光密度值／上柱前液光密度值×100％

[试剂]

1．SephadexG-50

2．草酸钾抗凝血液

3．％NaCl

4．鱼精蛋白

5．10％NaHCO3

6．2，4-二硝基氟苯

7．95％乙醇

（王鲁华）

实验九血清蛋白醋酸纤维薄膜电泳

[原理]

血浆中的各类蛋白质，它们的等电点都在以下，如将它们置于的缓冲液中电泳时，它们都解离成负离子，向正极移动。

在同一pH溶液中，由于各类蛋白质所带电荷的数量不同和分子大小不同，因此它们在电场中的移动速度也有不同，利用这种性质能够把各类蛋白质分开。

醋酸纤维薄膜作为电泳支持物具有电渗小、分离速度快，区带清楚、操作简便等长处。

醋酸纤维薄膜电泳可将血清蛋白分为白蛋白及α1-球蛋白、α2-球蛋白、β-球蛋白γ-球蛋白等5条区带。

固定染色以后，不仅可看到清楚的色带，并可将各带染料溶于碱溶液中进行定量测定，从而计算出血清中各类蛋白质的组成比。

[操作]

1．预备与点样：

（1）将薄膜切成2×8cm的小条，在薄膜无光泽面距—端处用铅笔画一横线，表示点样位置。

（2）将薄膜无光泽面向下，浸入巴比妥缓冲液中（缓冲液盛于培育皿中）。

（3）将充分渗透（指膜上没有白色斑痕）的膜条掏出，用滤纸吸去多余的缓冲液，把膜条两头各贴于两块玻片上使点样线驾空。

（4）吸取少量血清滴于普通玻璃板上，用X光片或加样器的钢口蘸取样品，平直印于膜上，待血清全数渗入膜内，移开点样器。

2．电泳：

将点样后的膜条置于电泳槽架上，放置时无光泽面（即点样面）向下，点样端置于阴极。

槽架上四层纱布怍桥垫，膜条与纱布需贴紧，待平衡5分钟后通电，调节电压至90V，或电流为～cm宽，通电1小时左右关闭电源。

3．染色：

通电完毕后用镊子将薄膜掏出，直接浸于盛有氨基黑10B的染色液中，染5分钟掏出，第一用自来水冲洗一下，然后当即浸入盛有漂洗液的培育皿中，反复漂洗数次，直至背景变白为止。

用滤纸吸干薄膜。

4．定量：

（1）取试管6支，编好号码，别离加入L氢氧化钠4ml。

（2）剪开薄膜上各条蛋白色带，另于空白部位剪—平均六小的薄牵，别离浸入上述试管内，不时摇动，使蓝色洗出。

（3）约半小时后，用分光光度计进行比色，在650nm波长下读取各管的光密度，用空白薄膜条洗出液为空白对照。

[计算]

光密度总和T=A+α1+α2+β+γ

各部份蛋白质的组成比为：

白蛋白=A/T；α1球蛋白=α1/T：

依次类推。

[临床意义]

1．正常值：

白蛋白为～；α1球蛋白为0．04～；α2球蛋白为0．07～；β球蛋白为～；γ球蛋白为～

2．肝硬化时，白蛋白显著降低，γ球蛋白升高2～3倍。

肾病综合征时，白蛋白降低，α二、β球蛋白升高。

[试剂]

1.巴比妥缓冲液（）：

巴比妥钠、巴比妥、蒸馏水加热溶解后再加水至1000ml（离子强度）。

2，氨基黑10B染色液：

氨基黑10B、甲醇50ml、冰醋酸10ml、蒸馏水40ml。

3．漂洗液：

95%乙醇45ml、冰醋酸5ml、蒸馏水50ml。

4．LNaOH。

（王文勇）

实验十一血清γ-球蛋白的分离、纯化及鉴定

[原理]

为了研究蛋白质的性质、结构及功能，第一要从大分子体系中分离纯化这种蛋白质，而且须维持天然蛋白质原有的结构与生物学活性（即不变性）是比较复杂的，蛋白质分离主如果利用各类蛋白质性质的不同，尤其是蛋白质在不同酸、碱环境中的性质和电学性质的不同。

分离蛋白质常常利用的方式有：

盐析、层析、超离心、超过滤等，按照目的要求不同，可别离采用这些方式或几种方式配合利用。

本实验以分离纯化血清γ-球蛋白为例，介绍一种蛋白质的分离纯化方式。

进程包括：

盐析、离心分离、凝胶层析、离子互换层析纯化、浓缩和电泳鉴定等几个步骤。

（一）盐析法粗提蛋白质

血清中含有清蛋白和球蛋白（α-β-γ-、球蛋白），由于它们所带电荷不同，分子量不同，在高浓度盐溶液中溶解度不同，因此，可利用它们在中性盐溶液中（常常利用硫酸铵、硫酸钠等）溶解度的不同而进行沉淀分离，此法称为盐析法。

由于各类蛋白质分子的颗粒大小和亲水程度不同，故盐析所需的盐浓度不一，调节盐的浓度可使不同的蛋白质沉淀析出，达到分离目的。

本实验采用在血清中加入50%饱和度的硫酸铵，使球蛋白沉淀析出，清蛋白则仍溶解于溶液中，经离心分离取得沉淀部份，即为含有γ-球蛋白的粗制品。