新产共轭亚油酸植物乳杆菌的筛选及发酵工艺研究.docx

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新产共轭亚油酸植物乳杆菌的筛选及发酵工艺研究

微生物的菌种选育  

2011-08-0609:

19:

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南山人著

 《南山人书法》

       这本来是给烟酒生上课 用的材料，可是，后来我才发现，他们不学一顾，为何呢？

原来，这些海子都是找不着工作，然后来混文凭，企图再找工作的，真是老鹅呀！

这是一个理性的社会了，学位疯狂的年代已经过去了，除了公务员、事业编制要国考外，其他的需要人干活的部门已经非常务实了，不论你什么学位，关键是经验，也就是解决问题的能力 。

    只要本科就够了，余下就是1-3年经验，没有经验剥蚀也没有用。

一群老鹅，不知道上学干吗的，还上什么学？

真还不如检破烂呢！

    因为，没有用了，这些东西也许真的没有用了，于是，我挂在我的墙上，但愿有用的人用。

优良的微生物菌种是发酵工业的基础和关键，要使发酵工业产品的种类、产量和质量有较大的改善，首先必须选育性能优良的生产菌种。

理想的工业发酵菌种应达到哪些要求呢？

①遗传性状稳定；

②生长速度快，不易被噬菌体等异种微生物污染；

⑧目标产物的产量尽可能接近理论转化率；

④目标产物最好能分泌到胞外，以降低产物抑制并利于产物分离；

⑤尽可能减少产物类似物的产量，以提高目标产物的产量及于产物分离；

⑥培养基成分简单、来源广、价格低廉；

⑦对温度、pH、离子强度、剪切力等环境因素不敏感；

⑨对溶氧的要求低，便于培养及降低能耗。

菌种选育主要有哪些方法呢？

（1）自然选育（菌种自然变异）；

（2）人为引起的菌种遗传变异或基因重组（如诱变育种、杂交育种、原生质体融合和基因工程等技术）。

第二类方法在微生物的菌种选育工作中占据主导地位。

但是，无论何种选育技术，前提条件是从自然界获得相应的原始菌种。

第一节  从自然界中获得新菌种

     自然界中微生物资源极其丰富，土壤、水、空气、动植物及其腐败残骸都是微生物的主要栖居和生长繁殖场所。

由于新的微生物菌种需要从自然生态环境中混杂的微生物群中挑选出来，因此必须要有快速而准确的新种分离和筛选方法。

这就是长说的“挖土”工程。

调查研究并充分查阅资料

             ↓

   设计试验方案

             ↓ 确定采样的生态环境

          采样

             ↓确定特定的增殖条件

      增殖培养

              ↓ 确定定性或半定量的快速检测方法

      纯种分离

            ↓

     原种斜面

        ↓确定发酵的基本条件

        ↓         初筛（快速检测或一菌株1摇瓶培养测定）

    筛选        复筛（一菌株3～5摇瓶）结合初步的工艺条件      

        ↓        再复筛                            

较优菌株斜面（3～5菌株）

      ↓      生产性能试验

 性能鉴定   毒性试验

       ↓      菌种鉴定

 菌种保藏及作为进一步育种的出发菌株

    图1   典型的微生物采样和筛选方法

1.1 采样

采样应根据筛选的目的、微生物分布情况、菌种的主要特征及其生态关系等因素，确定具体的时间、环境和目标物。

（1）菜园和耕作层土壤是有机质较多的土层，常以细菌和放线菌为主；

（2）果园树根土层中，酵母菌含量较高；

（3）动植物残体及霉腐土层中，分布着较多的霉菌。

（4）豆科植物根系土中，往往存在根瘤菌；

（5）河流湖泊的淤泥中能分离到产甲烷菌；

（6）油田和炼油厂周围土层中常见分解石油的微生物等；

（7）各种水体中可筛选具有光合作用能力的微生物及兼性或专性厌氧微生物；

（8）海洋、温泉、碱水湖泊、沙漠、盐碱地等可筛选极端微生物。

（9）污垢环境可分离分解污染物的微生物。

采土样地点选好后，那就开始动手了，怎么取样呢？

一般取多少样呢？

先用小铲子去除表土，取离地面5～15cm处的土样几克，盛于预先灭菌的牛皮纸袋中扎紧，并标明时间、地点和环境等情况，以备查考。

  采样时候需要注意的是什么呢?

（1）所有的用具要灭菌，既铲子、牛皮纸袋灭菌才能用，减少杂菌干扰；

（2）季节、表面的植被、温湿、通风情况、养分、水分、酸碱度和光照等都会影响土壤中的微生物分布，故在采土样时应予以重视。

大量调查显示，各种污染物，甚至一些剧毒的污染物都有可能在环境中找到对应的微生物。

据资料显示，目前人们如已经分离到了能分解剧毒物氰和腈化物的微生物有诺卡氏菌、腐皮镰孢霉、木霉、假单胞菌、无色杆菌和产碱菌等14个属，共计49个种。

  污染源附近的土壤、水体、污泥、污水往往是对各类污染物具降解或转化能力的细菌、放线菌或真菌等微生物理想的采样地点。

中国海域面积辽阔，人们只知道吃海鲜、捞石油，可有多少人知道海洋中有多少生命，就极端微生物的数量就可能吓死人了，淘海去吧！

具有高度责任感和环保人士，希望动起手来，不要空谈环保理论，一方面帮助监督个经济实体的排污状况，另一方面开展分解污染物的微生物调研工作，并真正将其用于环境保护工作 .  

1.2 增殖

在采集的样品中，一般待分离的菌种在数量上并不占优势，为提高分离的效率，使所需菌种的数量相对增加，这种方法称为增殖培养或富集培养。

目的是使天然样品中的劣势菌转变为人工环境中的优势菌，便于将它们从样品中分离。

增殖的方法：

（1）投其所好。

如分离分解纤维素的微生物，就要在分离培养基中加入纤维素等物质；

（2）抗其所抗。

在培养基中加入所能抗的物质，比如有些微生物能抗乙醇、乳酸，就在培养基中加入相关成分。

1.3 纯化

增殖培养过程中设置了许多限制因素，但并不能获得微生物的纯种，其他微生物并没有死去，只是数量相对减少了，一旦遇到适宜条件就会快速生长繁殖。

鉴于此，为了获得某一特定的微生物菌种，增殖后得到的微生物必须进行微生物的纯化——纯培养。

如何纯化微生物呢？

常用的纯化菌种方法很多，从纯化水平来看，可以分成两个档次:

（1）“菌落纯”的水平；

（2）单细胞或单孢子分离水平。

（1）“菌落纯”的水平

 从“种”的水平来说是纯的，操作起来容易的多。

需要注意的是培养基的选择，要针对需要分离的对象选取特定的培养基。

同时注意培养的条件选择。

好的设计是成功的一大半、一搭伴。

在实验室里采用的方法：

（A）划线分离法；（B）涂布分离法；（C）稀释分离法。

（A）划线分离法——简便而快速，即用接种针挑取微生物样品在固体培养基表面划线，适当条件下培养后，获得单菌落；

（B）涂布分离法——用涂布器蘸取培养液在固体培养基表面均匀涂布或先将少量培养液滴在固体培养基表面，再用涂布器在固体培养基表面均匀涂布；

 第一次从酸奶中分离乳酸菌

 第一次分离的乳酸菌显微镜检查，乳酸菌是混合菌种。

进一步再用特殊的方法对菌落进行涂布分离培养。

 第二次分离后，得到纯的链球菌。

 第二次分离后，得到纯的德氏乳杆菌。

（C）稀释分离法——将降至60℃左右的固体培养基与少量培养液（事先在培养液中加入无菌的玻璃珠搅拌打散细胞团，再经过滤处理，效果更佳。

）混匀后，再浇注成平板以获取单菌落。

所获得的单菌落更加分散均匀，获得纯种的机率较大。

（2）单细胞或单孢子分离法

它可达到细胞纯即“菌株纯”的水平，技术操作起来也不难，知识需要耐心和一定艺术技巧而已，当然效果会出人意外的惊的心扑哧、噗嗤的狂跳，绝对有蹦极的刺激。

具体操作的方法很多，最简便的方法——利用培养皿或凹玻片等分离小室进行细胞分离，也可以利用复杂的显微操作装置进行单细胞挑取；如果遇到不长孢子的丝状菌则可用无菌小刀切取菌落边缘疏稀的菌丝尖端进行分离移植，也可用无菌毛细管插入菌丝尖端，以获取单细胞。

在具体的工作中，究竟采取哪种方法，应视微生物的实际情况和实验条件而定。

为了提高分离筛选工作的效率，除增殖培养时应控制增殖条件外，在纯种分离时，也应控制适宜的培养条件，并选用特异的检出方法和筛选方案。

1.4 性能鉴定

菌种性能测定包括菌株的毒性试验和生产性能测定。

若毒性大而且无法排除者应予以淘汰。

尽管在菌种纯化中能获得大量的目标菌株，它们都具备一些共性，但只有经过进一步的生产性能测定，才能确定哪些菌株更符合生产要求。

直接从自然界分离得到的菌株为野生型菌株。

事实上，从自然界直接获得的野生型菌种往往低产甚至不产所需的产物，只有经过进一步的人工改造才能真正用于工业发酵生产。

所以，常将这些自然界中直接获得的新菌株称为进一步育种工作的原始菌株或出发菌株。