修改2附件2四川农业大学本科生科研兴趣培养计划项目申报书.docx
《修改2附件2四川农业大学本科生科研兴趣培养计划项目申报书.docx》由会员分享，可在线阅读，更多相关《修改2附件2四川农业大学本科生科研兴趣培养计划项目申报书.docx（9页珍藏版）》请在冰豆网上搜索。
修改2附件2四川农业大学本科生科研兴趣培养计划项目申报书
修改2附件2-四川农业大学本科生科研兴趣培养计划项目申报书
四川农业大学
本科生科研兴趣培养计划项目申报书
项目名称石斛对重金属胁迫的生理影响
项目负责人
学院风景园林学院
联系电话
申报日期2015.11.02
四川农业大学制表
项目名称
石斛对重金属胁迫的生理影响
起止时间
2015年11月至2016年11月
负责人
姓名
学号
年级
所在学院、专业
联系电话
E-mail
项目组成员
导师
姓名
职务/职称
通讯地址
电话
E-mail
一、立项依据（项目意义、现状分析等）
1.项目意义:
石斛为兰科石斛属的多年生附生草本。
它不仅是上好的中药材，而且观赏价值极高。
石斛是我国古文献中最早记载的兰科植物之一，早在2000多年以前《神农本草经》中就有关于石斛所谓记载，千年以来它一直和灵芝，人参，冬虫夏草等一样被列为上品中药。
据《本草备至》叙述，它对人体有驱解虚热，益精强阴等疗效【1】。
随着花卉产业的兴起，人们发现它有很高的观赏价值，因而归入洋兰的范畴，逐渐从草药圃跨进到大花园中去，成为当今非常时兴的新花。
石斛兰的花姿的确很美。
植株由肉茎构成，粗如中指，棒状丛生，叶如竹叶，对生于茎节两旁。
花葶从叶腋抽出，每葶有花七八朵，多的达20多朵，呈总状花序，每花6瓣，四面散开，中间的唇瓣略圆。
许多品种的瓣边均为紫色，瓣心为白色，也有少数品种为黄色、橙色。
迭鞘石斛（DendrobiumaurantiacumRchb.var.denneanum（Kerr.）Z.H.Tsi）是目前商品中较多的一种石斛，为兰科石斛属植物。
主要分布于我国四川、云南、广西等地，资源丰富，且易于人工栽培。
目前在四川的乐山、雅安、洪雅等地已广泛栽培，并已作为商品药材广泛流通于市场【2】。
该种在历代本草中未见记载，然而在现在药理研究中已经取得一定的进展，其抗肿瘤、降血糖等作用已得到证实，是有推广潜力的中草药品种。
在野生名贵石斛植物资源遭到严重破坏的今天，除了应该注意资源保护，还应对可以替代名贵石斛使用的常见石斛进行广泛的研究和开发利用，以达到可持续发展的目的【3】。
重金属指比重大于4或5的金属，约有45种，如铜、铅、锌、铁、钴、镍、钒、铌、钽、钛、锰、镉、汞、钨、钼、金、银等。
随着工农业的迅速发展，环境污染日益严重，特别是重金属在环境中的释放严重污染了土壤、水体和大气，并且可通过食物链进人生物体，危害人类健康，因此，重金属污染已成为世界性的重大环境问题。
重金属的来源有多种途径，除采矿区的尾矿、矿渣、冶炼、有毒气体的排放之外，还有城市垃圾、金属电镀、汽车尾气排放、工业企业向环境排放的“三废”、化工产品在农业中的不合理使用、农田的污水灌溉等等，这些途径都将导致环境的重金属污染【4】。
植物生长在有重金属污染的环境中，因受重金属的胁迫，植物与重金属接触界面首先受到影响，并且这种影响随着胁迫时间的延长和重金属浓度的升高，植物的损害也会逐渐增加【5】。
植物受重金属的伤害程度、伤害症状与重金属的种类关系密切。
通常植物在受到重金属污染时都会出现生长迟缓、植株矮小、根系伸长受抑制直至停止、叶片褪绿、出现褐斑等症状，严重时甚至导致植物死亡。
目前，据农业部环保监测系统调查发现，农作物污染超标面积占污染区农田面积的20%，其中，重金属超标占污染土壤和农作物的80%，尤其是镉铅汞铜及砷铬等最为突出【6】。
迭鞘石斛是目前商品中较多的一种石斛，在四川广泛栽培，在栽培的过程中起生长也容易受到土壤中重金属的影响。
因此为分析和避免药用石斛出现重金属的污染，本实验选用迭鞘石斛为研究材料，探寻其对重金属胁迫的生理响应。
2.研究现状分析：
迄今为止，报道四川有野生石斛12种，附生在树上或岩石上，分布几乎遍及全川.迭鞘石斛在四川省乐山市夹江县已广为栽培并供药用。
药理实验结果表明，迭鞘石斛多糖具有降血糖和抗肿瘤作用，是一种值得开发利用的降血糖植物多糖【7】。
研究迭鞘石斛对重金属胁迫的生理响应，可为探索石斛药用资源的合理利用，开发药用价值和保护名贵野生资源提供有效的帮助。
重金属污染已经成为环境生物学关注的焦点，当土壤中重金属离子超过植物对重金属离子的自净作用时，将对植物的生长发育产生不良的影响【8】。
重金属主要通过采矿、电镀、油漆等工业而排出，进而间接或直接地对植物造成危害。
目前，随着国内外多起重金属污染事件的不断涌现，重金属的污染问题越来越受到国内外专家学者的重视。
重金属作为植物生长的非必须元素，当其在植物体内积累达到一定量时，植物会出现毒害的情况，通常情况下，会出现植物的根、茎生长缓慢，叶片泛黄、卷曲、出现斑点、生长缓慢、植株矮小、产量和质量大幅度下降等生长发育不良的症状。
重金属金属被植物吸收后并不是全部向上部运输，其中大部分重金属离子仍然留在根内，主要与根内的蛋白质结合，形成稳定的螯合物并滞留在根部，一部分重金属向地上部位运输，根系表面吸收的重金属离子先横穿根的中柱，到达导管中，然后通过蒸腾作用输送到地上部位【9】。
重金属离子首先通过植物根茎的吸收进入植物体内，当达到一定量时，就会抑制植物根尖细胞的伸长并使细胞的木质化速度加快，导致根部变短变粗【10】。
根系活力是植物生长情况的一个指标，根系活力越高的植物，地下部分的活动越旺盛，就能源源不断的从土壤中吸收矿质元素，来供应地上部分的生长。
所以根系活力的测定很重要，一般采用的方法是氯化三苯基四氮唑法。
重金属在植物叶片中的影响主要是通过抑制植物的光合作用，重金属在叶片中积累到一定程度时会导致叶绿体及色素解体、增加化学猝灭并降低光合效率，重金属还会强烈抑制气孔开放【11】。
叶绿素含量是反映植物光合能力及营养状况的重要指标之一。
过氧化物酶广泛存在于植物体中，是植物体内重要的呼吸酶类，其活性的高低与酚类物质代谢及植物抗性密切相关。
重金属通过植物根系进入植物体内后会对其他离子的吸收运转造成一定的影响，导致植物体内的新陈代谢发生紊乱，对植物的生长造成影响【12】。
植物组织中的蛋白质有结构蛋白和可溶性蛋白，酶蛋白多为可溶性蛋白，测定可溶性蛋白含量在计算酶比活力和研究植物氨代谢中是十分必要的。
植物遭遇逆境胁迫或衰老过程中，由于自由基活性氧的积累引起膜质过氧化，产生膜质自由基，进一步诱发膜质连续过氧化并导致蛋白质交联变性，而引起细胞损伤或死亡。
丙二醛是膜脂过氧化的最终产物，通过其含量的测定可以了解膜质氧化伤害的程度，比较不同植物抗逆性的差异。
脯氨酸是植物体内最重要的渗透调节物质之一。
当植物遭遇干旱、盐碱、高温、低温、大气污染等逆境时，体内游离脯氨酸含量增高，抗性强的植物尤为显著。
因此，常以游离脯氨酸含量作为植物多种抗逆性的指标。
参考文献
【1】石斛是我国古文献中最早记载的兰科植物之一,XX文库；
【2】石斛论文：
迭鞘石斛中总多糖的含量测定，中国石斛网，2012-11-27
【3】池少铃等，迭鞘石斛的研究进展，中国科技论文在线。
【4】姚慧等，缓解植物重金属胁迫伤害的途径及其机理，浙江农业科学，2011
（1）：
144-147
【5】陈怀满.土壤-植物系统中的重金属污染[M].北京:
科学出版社，1996，1-14.
【6】钟秀明，武学萍，我国农田污染质量完全现状、问题及对策【J】，中国农业资源与区划，2007,28（5）；27-32；
【7】何涛等，四川石斛野生资源及其保护研究，应用与环境生活学报，2008,14（5）；710-715
【8】周焱,钱肖余,罗安程.土壤和植物中镉的污染及防治，1995，5（12）；19-21
【9】王慧忠,何翠屏，赵楠.镉对草坪植物生长特性及生物量的影响，2003-5；32-34.
【10】鲁如坤，熊礼明，时正元.关于土壤一作物生态系统中锅的研究.土壤,1992，24（3）；129-132.
【11】沙尔比亚·阿合尼亚孜.重金属对植物影响及其解决措施.新疆阿克苏，新疆阿克苏职业技术学院植物科：
现代农业科学，2009-5，16（5）；182-183.
【12】吴怡，曹旭，郭亚飞，邓天龙.重金属镉的分析方法研究进展，2010，17（10）；1-7.
二、项目方案（具体方案、实施计划、可行性分析）
本实验以兰科观赏植物迭鞘石斛为研究对象，通过对照试验，采用分光光度计等方法来测定迭鞘石斛受到重金属胁迫后根系活力、叶绿素、POD等生理指标的变化，以研究迭鞘石斛对重金属胁迫的生理响应，为综合开发利用迭鞘石斛提供理论依据。
1.具体方案：
取外观表现一致的供试材料，分别用0mg/kg,20mg/kg,40mg/kg,60mg/kg,80mg/kg,100mg/kg浓度的镉离子和铜离子进行处理。
一周后测定根系活力、叶绿素含量和POD含量，两周后测定游离脯氨酸含量、丙二酮含量和可溶性蛋白质含量。
1.1.样品根系活力的测定（TTC法）
1.1.1样品处理以及测定
取样品根系2条，置于小玻瓶中（3mLTTC+3mL磷缓冲液），37℃保温1h，取出根尖后吸干表面水分，放入无水研钵中加入5mL乙酸乙酯研磨提取TTF，用吸管吸取红色溶液于试管，定容至10mL。
以空白乙酸乙酯作参比，在分光光度计上测定样品在485nm波长下的吸光度。
1.1.2标曲制作
取1mg/ml的TTC1mL于50mL容量瓶中，加一勺保险粉和乙酸乙酯后剧烈震荡，使TTC充分还原为红色的TTF并溶于乙酸乙酯，然后用乙酸乙酯定容到容量瓶刻度线。
此时溶液中TTF的浓度为20ug/ml。
将上述TTF溶液稀释成系列浓度，取10mL容量瓶8个，分别编号，一次向各管加入TTF溶液0、2.00、4.00、8.00、10.00、12.00、12.00、14.00ug/mL，再加乙酸乙酯定容到刻度线。
以空白作参比在分光光度计上测定485nm下的吸光度，并绘制标准曲线。
根系活力（ug.TTF.根-1.h-1）=C*V/10*1
1.2.叶绿素含量测定（分光光度法）
用培养1周后的材料，取样品的第一片叶中段（2cm），量出中片宽，计算出叶片面积（cm2）。
叶片剪碎置于研钵中，加入少量石英砂和碳酸钙及8O%乙醇，研磨成匀浆状，过滤至25mL容量瓶，并用80%乙醇定容至25mL。
分别测定样品在663nm、645nm波长下的吸光度。
Chla（mg.cm-2）=（12.7OD663-2.69OD645）*（V/s*1000）
Chlb（mg.cm-2）=（22.9OD645-4.68OD663）*（V/s*1000）
Chl总含量（mg.cm-2）=（20.2OD645+8.02OD663）*（V/s*1000）
1.3.过氧化氢酶（POD）活性的测定（愈创木酚法）
过氧化物酶催化H2O2氧化酚类生成醌类化合物，此化合物进一步缩合或与其他分子缩合，产生颜色较深的产物。
以愈创酚为底物过氧化氢酶催化H2O2将愈创木酚氧化生成茶褐色产物，此产物在470nm波长处有最大吸收峰，故可通过测定470nm波长下的吸光度变化得知过氧化物酶的活性。
称取样品1.00g左右，加入20mmol/LKH2PO4溶液5ml，于钵体中研磨成匀浆，在3000r/min下离心10min,上清液转入25ml容量瓶中，残渣再用5ml溶液提KH2PO4取一次，合并两次上清液，定容，混匀，贮存于冷凉处备用。
取光径1cm比色杯2只，于一只中加入已混合的反应混合液3ml,KH2PO4溶液1ml，作为参比液；另一只中加入反应混合液3ml，酶液1ml,立即计时并置于分光光度计中。
在470nm下测定光密度，每隔一分钟读数一次，连续测30min，每次测定前重新用对照校准。
酶活力（0.01A470·min-1）={（A1-A2）/[（t2-t1）*0.01]}*D
酶的比活力（u·g-1）=酶活力（u）/样品重（g）
1.4.可溶性蛋白质含量的测定（考马斯亮蓝G-250法）
可溶性蛋白质与考马斯亮蓝反应生成青色产物，在595nm波长有最大吸收峰，其颜色的深浅与可溶性蛋白质含量呈正相关，可用分光光度法测定可溶性蛋白质的含量。
即蛋白质+考马斯亮蓝（褐）→蓝色物质。
1.4.1可溶性蛋白提取:
称取待测样品0.1g放入研体中,加入2ml蒸馏水研磨,用6ml蒸馏水分4次洗涤研体,洗涤液收集在同一离心管中,在4000r/min下离心10min,上清液转入10ml离心管中,以蒸馏水定容至10ml,摇匀后待测。
1.4.2可溶性蛋白含量测定:
吸取样品提取液1ml,放入具塞刻度试管中,加入5ml考马斯亮蓝G-250试剂,充分混合,放置2min后,在595nm波长处比色,记录吸光度值,以蒸馏水作为空白对照。
1.4.3结果计算:
通过标准曲线查得离心管中可溶性蛋白含量。
样品蛋白质含量（μg/g）=C×V/（a×W）。
其中,C为查标准曲线所得每管可溶性蛋白含量（μg）;V为提取液总体积（10ml）;a为测定所取提取液体积（1ml）;W为材料鲜重（0.1g）。
1.5.丙二醛（MDA）含量的测定（双组分光光度法）
MDA含量测定采用硫代巴比妥酸比色法。
称取待测植物样品0.3g,加入5%三氯乙酸溶液5ml,研磨后所得匀浆在3000r/min下离心10min,上清液存于4℃冰箱中备用。
分别于450、532、600nm波长处测定吸光值,参照对照计算MDA浓度,依照公式MDA含量（μmol/g）=C×A×V/（a×w）计算MDA含量。
1.6.脯氨酸含量的测定（酸性茚三酮比色法）
取7只试管，按下表数据配置溶液；把各试管摇匀后置于沸水浴保温15min，冷却至室温后再分光光度计下以515nm波长测定其分光度，并绘制标准曲线。
管号
0
1
2
3
4
5
6
脯氨酸浓度（ug/mL）
0
2
4
8
12
16
20
20ug/ml脯氨酸标准液（mL）
0
0.2
0.4
0.8
1.2
1.6
2.0
80%乙醇（mL）
2
1.8
1.6
1.2
0.8
0.4
0
冰醋酸（mL）
2
2
2
2
2
2
2
茚三酮（mL）
2
2
2
2
2
2
2
用培养了2周后的材料，取叶片0.5g左右，加石英砂和2mL左右的乙醇研磨成匀浆后转入大试管，80摄氏度保温20min。
再加入人造沸石和活性炭各一勺，震荡2min过滤，用乙醇定容至刻度线25mL。
取两只试管分别加入2mL滤液+2mL冰醋酸+2mL茚三酮，另一只加入2mL乙醇+2mL冰醋酸+2mL三酮做参比，沸水浴15min。
分光光度计下用515nm波长测定其分光度。
脯氨酸含量（ug.g-1Fw）=Cx*V/Fw.
2.实施计划
2015年11月-2015年12月
收集有关迭鞘石斛、重金属胁迫及植物对重金属胁迫的生理响应的相关资料，选择合适的试剂与方法。
2016年01月-2016年03月
探究迭鞘石斛石斛在四川的种质资源分布，选取合适的实验材料。
2016年04月-2016年05月
培育实验材料，并选取生长状况一致的实验材料，分组，定期喷洒不同浓度的重金属离子溶液。
2016年06月-2016年07月
测定迭鞘石斛的根系活力，叶绿素含量，POD等生理指标。
2016年08月-2016年09月
对所测数据进行整理分析，通过迭鞘石斛对重金属胁迫的生理响应，探究野生石斛所需的生长环境以及人工栽培迭鞘石斛在重金属方面所需注意的事项等。
2016年10月-2016年11月
结题，发表论文。
3.可行性分析
当前，人们对植物受重金属胁迫的生理响应的已经做了大量的研究工作，其中以农作物居多。
迭鞘石斛为附生草本，在我国传统医学中，石斛的药用历史悠久，具有滋阴清热、生津益胃、润肺止咳等功能，用于热病伤津、口干烦渴、病后虚热等多种病症。
现代药理学研究表明，石斛具有防治白内障、抗肿瘤、增强人体免疫力、降血糖、抗衰老和扩张血管等作用。
目前，对于迭鞘石斛的研究多为药理性的研究，常常忽略了其生长环境及生长状况。
迭鞘石斛在民间药用非常广泛，如果对其重金属胁迫进行研究，将会有利于在其使用过程中，避免重金属的污染，而使其进入人体。
研究迭鞘石斛重金属胁迫的生理响应，对迭鞘石斛的人工栽培乃至野生石斛资源的保护都具有重要意义。
三、预期研究成果（如鉴定、学术论文、获奖、申请专利、推广应用等）
（1）测定迭鞘石斛的各项生理指标；
（2）探究野生石斛所需的生长环境以及人工栽培迭鞘石斛在重金属方面所需注意的事项等。
（3）发表论文1篇
四、经费预算（如材料费、资料费、版面费、专利费等）
药品与试剂2500;
材料费500;
资料与论文发表1000。
导师意见：
签名：
年月日
学院推荐意见：
签名盖章：
年月日
学校评审意见：
负责人（签字）：
（公章）：
年月日
升级会员 