高效液相色谱.docx

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高效液相色谱

第三章高效液相色谱（HPLC）

HPLC是在传统的柱色谱的基础上，引入了气相色谱的理论和技术，并加以改进而发展起来的，它与传统柱色谱的不同之处在于应用了颗粒很小的填充剂（＜40μm）,新型填充剂的不断涌现和完善是HPLC实现的前提。

由于填充剂颗粒很小，所以,又配备了高压输液泵，以加快流动相的线速，从而达到加快分析速度的目的，而且，HPLC的分离速度，自动化程度及检测灵敏度均高于柱色谱。

一、HPLC的特点

⒈分离效能高，灵敏度高，重复性好。

⒉分析对象广泛，特别适用于不挥发、热不稳定样品的分离，约80%的有机物可不经化学改性直接用高效液相色谱分离（GC只有20%）HPLC用于高分子领域即GPC.

⒊可与其他仪器连用，适用于制备分离（∵HPLC收集流出组分比GC方便）

⒋流动相选择范围大（单一溶剂、混合溶剂、梯度淋洗等）为控制和改善分离效果提供了新的选择性因素。

⒌由于HPLC中填料颗粒非常细（以求获得高的柱效），柱内压降大，进口压力也高，∴必须采用高压输液泵。

⒍柱外效应大，不可忽略，必须采用很细的连接管。

二、基本原理

　　ＨＰＬＣ的基本原理与ＧＣ基本上相同，如塔板理论中的ｎ、Ｈ、Ｒ、α等概念仍然适用于ＨＰＬＣ，且ＨＰＬＣ中速率理论仍然可用Ａ、Ｂ、Ｃ三项来表示，崐但由于在ＨＰＬＣ中填料粒度对柱的影响非常大，若固定相相同，填充也十分良好，而只是填料颗粒不同的柱子，其Ｈ－u曲线不相同，因而无法从这些粒度不同的柱子上获得数据，得出有重要意义的结论。

同样，比较不同流动相流速下获得的数据也发生了困难。

可见，塔板高度主要是粒度的函数。

为了比较不同粒度下的柱效，所以要采用某些无量纲的参数。

1、折合参数

为了比较不同粒度下的柱效而引入的无量纲参数。

⑴折合高度

　　　　　h是单位粒度所贡献的塔板高度　　　　

dp──粒度H──塔板高度　

⑵折合流速

u──流动相线速u'──组分分子扩散至颗粒孔穴内的线速

Dm──溶剂在流动相中的扩散系数

⑶折合柱长

L──柱长;dp──粒度

l表示在长度为L的柱子内,从上到下能垂直排列的载体颗粒数。

2、液相色谱速率理论方程

h──折合板高v──折合流速

A、B、C均为常数，含意与ＧＣ中VanDeemter方程中的A、B、C相似,在液相色谱中，A、B、C的典型值为A=1,B=2,C=0.1。

　　若以logh对logv作图,则得到h～v的对数曲线,它也是由三个独立的函数图象加合而成：

∵采用了折合参数，对于不同粒度的填料,可以得到相同的h～ν对数曲线。

由h～ν对数曲线的形状及位置的变更，可以判断柱效的高低及其变化情况,若曲线比较平坦,且最低点过高,则表明该柱可能由于填装不良而导致A值过大,若在高折合流速区,曲线上升过于陡峭,则表明固定相的传质阻力太大,传质速度太慢,即C值过大,需改用传质快的固定相（如全多孔型固定相传质就比表面多孔型固定相传质阻力大）。

3.操作条件最佳化

　　操作条件最佳化是指分离效果，分析时间及操作压力三者之间的最佳组合。

⑴μ对Ｐ（柱操作压力）及H/μ（柱高速性能指标,即流动相流过一块塔板所需的时间）的影响:

如图所示,当μ很小时,随着u↑，H/u↓，分析速度加快；

　　当μ增加到一定程度时，u进一步↑，H/u不再

急剧↑,此时,u为最佳。

若u＞u最佳，u↑时，H/u↓

很慢,且P↑。

所以,u应选择在一定的范围。

否则,一

味强调高的分析速度,就要增加柱压。

⑵dp对操作条件的影响：

　　由ｈ～v对数图知，当v＝3时,h最小,柱效最高。

　　可见，dp↓,则v↓;dp↑,则v↑;

dp过大或过小都对v或h有不利影响。

　　　　最佳粒度

　　Dm──溶质在流动相中的扩散系数

t0──非滞留组分的流出时间（即流动相线速）

l──折合柱长

在实际工作中,所使用的固定相的粒度不会恰好等于最佳值,这时应权衡n（塔板数）、△p（柱压降）、t0（分析时间）三个参数,考滤究竟牺牲哪个参数最为合理,选择合适的流速。

三者的制约关系见Ｐ25图２－３。

具体实例见Ｐ２５例２－１。

三、仪器装置

1、泵：

　　由于柱子中填充剂的颗粒很小，所以液体流过的速度很慢，为了使淋洗液的速度达到要求，必须使用高压泵（一般为往复泵，Ｐ30）并使用阻尼装置以减少脉冲，造成平稳的流量。

2、梯度腔：

　　用于梯度淋洗。

梯度淋洗就是将两种或两种以上极性不同的溶剂，随着淋洗时间的改变使之按一定的比例混合，以连续改变淋洗液的极性，使被分离组分的相对保留值改变，以提高分离效果和加快分离速度。

梯度洗脱十分类似于ＧＣ中的程序升温。

两者主要目的都是为了使各组分在最佳k'值（分配比，一种保留值的表示方法）下流出柱子，使某些保留时间过小而十分拥挤、甚至重叠的组分，或保留时间过长而峰形扁平的组分获得良好的分离。

不同的只是在ＧＣ中，程序升温是通过改变柱温而使K'值改变，而在ＨＰＬＣ中，梯度淋洗则是通过改变流动相组成来改变k'。

　　梯度淋洗包括浓度梯度、极性梯度、离子强度梯度和ＰＨ梯度等。

例：

梯度淋洗与等梯度淋洗分离效果的比较

3、色谱柱：

　　一般由不锈钢制成，要求内壁十分平滑。

柱子的长度一般不超过25cm,内径0.4～0.5cm。

⑴填料：

　　①ＬＳＣ填充剂：

　　ａ）薄壳型小球（表面多孔型固定相）

　　优点：

　　机械强度好，装柱容易（干装法），透过性好，死时间小。

　　由于孔浅，传质阻力小，梯度淋洗时，孔内外流动相成分能迅速达到平衡。

　　缺点：

　　最大样品允许量小（∵多孔层厚度小）。

　　ｂ）全多孔型固定相（粒度为5～10μm的硅胶、氧化铝、分子筛等）：

　　优点：

　　粒度更小，孔仍然较浅，传质速率仍然较快，柱效高，仍然适合于梯度淋洗（孔内外流动相成分易达平衡）。

　　全多孔型固定相的最大样品允许量是表面多孔型的5倍，即全多孔型固定相的容量大，适宜于痕量分析。

　　缺点：

　　此种固定相的渗透性低于表面多孔型，因而需要更高的操作压力，另外，装柱不如表面多孔型方便（需用匀浆法）。

　　②ＬＬＣ填允剂：

　　ａ）涂浸担体固定液（在上述吸附剂外涂一层固定液，但种类不及ＧＣ固定液多），分离效能较高，最适合同系物的分离。

　　缺点：

　　易随溶剂流失（为了防止固定液流失，可采用柱前加预饱和柱，且淋洗液亦以固定液充分饱和，但这样又给组分鉴定带来了一定的困难）。

∴涂浸担体固定液这种固定液的应用受到了很大的限制。

目前，ＨＰＬＣ中的固定相更多地采用化学键合固定相。

　　ｂ）化学键合固定相：

　　通过化学反应将有机固定液键合到硅胶载体表面，不随溶剂流失，并且具有出色的色谱性能，目前已得到广泛的应用（约80％以上的ＨＰＬＣ填料是化学键合固崐定相）。

例如ＯＤＳ键合固定相、ＣＮ键合固定相。

⑵流动相：

　　ＨＰＬＣ中流动相对分离起着至关重要的作用。

当柱子和样品给定后，能否正确选择流动相，直接影响着组分的分离。

我们将在后面专门讨论ＨＰＬＣ中的流动相。

4.检测器：

⑴紫外检测器：

　　通用，灵敏度高，线性范围宽，结构简单。

但不适合于不吸收紫外光的样品及可吸收紫外

光的溶剂。

⑵示差折光检测器：

　　通用，只要求样品与淋洗液的折光率有一

定差值。

但不适合梯度淋洗。

⑶萤光检测器：

　　灵敏度高，适合于检测有萤光的物质，但

不通用。

∵不是所有的有机物在检测条件下都

可产生萤光。

四、ＨＰＬＣ中的流动相

1、在选择流动相时须依次考滤：

溶剂的物理性能─→溶剂强度─→溶剂的选择性

　　①根据溶剂的各种物理性能，将不适合的溶剂排除，如粘度，ＵＶ吸收性能等。

　　②选择适当的溶剂强度，使样品组分的k'值处于合适的范围。

例如：

　　　对于两个组分的样品：

2≤k'≤5

对于多个组分的样品：

0.5≤k'≤20（或1≤k'≤10）

　　③改进溶剂的选择性，使组分的相对保留值符合要求（使α足够大），以获得良好的分离。

2、溶剂强度与溶剂极性参数（在分配色谱中）

　　溶剂强度──溶剂将组分从色谱柱上洗脱下来的能力。

对于给定组分：

　　　　用溶剂强度大的淋洗液时，组分的k'小,tR短；

　　　　用溶剂强度小的淋洗液时，组分的k'大,tR长。

　　溶剂极性参数Ｐ'──极性越强的溶剂，Ｐ'越大。

混合溶剂的极性参数是纯溶剂极性参数的算术平均值：

　　　　　Ｐab'＝ФaＰa'＋ФbＰb'

Ｐa'──a溶剂的极性参数Фa──a溶剂在混合溶剂中的体积分数

Ｐb'──b溶剂的极性参数Фb──b溶剂在混合溶剂中的体积分数

在ＬＬＣ（分配色谱。

主要是化学键合固定相，涂浸担体固定液因固定液易流失而较少使用）Ｐ'能比较准确地衡量分配色谱中的溶剂强度，Ｐ'随不同的色谱体系而异：

　　ａ）正相色谱──流动相极性小于固定相极性。

　　在正相色谱中：

Ｐ'越大的溶剂，其溶剂强度越大。

　　　　极性较弱的组分，在流动相中的溶解度较大，k'小，先出峰。

　　　　极性较强的组分，在流动相中的溶解度较小，k'大，后出峰。

　　ｂ）反相色谱──流动相极性大于固定相极性。

　　在反相色谱中：

Ｐ'越大的溶剂，其溶剂强度越小。

　　　　　极性较弱的组分，在固定相中的溶解度较大，k'大，后出峰。

　　　　　极性较强的组分，在固定相中的溶解度较大，k'小，先出峰。

3、溶剂的分类（改变流动相选择性的依据）

　　选择溶剂强度合适的流动相，可以使样品中组分的k'值处于合适的范围，加上色谱柱有足够的理论塔板数，就能使大多数样品实现良好的分离。

但是在某些情况下，仍会发生两个或多个色谱峰严重重叠的现象。

遇到这种情况，就要考滤改变流动相的选择性。

改变流动相选择性的一般做法是改变流动相的组成，但维持溶剂强度不变。

　　目前，用途流动相的溶剂繁多，若盲目地选择溶剂，往往使流动相选择性变化不大，例如：

用丙醇代替甲醇，溶剂的选择性变化很小（∵因为它们是同系物，都是质子给予体）。

若用乙醚代替甲醇，溶剂的选择性将会发生很大的变化（∵乙醚是质子接受体）。

　　为了反映出各种溶剂分别作为质子接受体、质子给予体和偶极相互作用时，相对能力的大小，可用选择性参数Ｘe、Ｘd、Ｘn表示溶剂与代表性组分乙醇、二氧六环、硝基甲烷的作用力大小：

　　Ｘe值大的溶剂，与质子给予体作用力大；

　　Ｘd值大的溶剂，与质子接受体作用力大；

　　Ｘn值大的溶剂，与大偶极矩组分作用力大；

人们在大量实验数据研究的基础上，给出了75种普通溶剂的Ｘe、Ｘd、Ｘn值,用等边三角形的三条边来代表Ｘe、Ｘd、Ｘn三个参数,如Ｐ40图2-13所示。

仔细观察这些点就会发现官能团或化学性质相似的溶剂（即选择性相似的溶剂）集中在一个小区域内，即落入图2-13中的圆圈内（有极个别点例外），将每个圆圈内的溶剂归成一组，几十种溶剂就分为八组，每组用罗马数字表示（即用罗马数字代表溶剂的选择性组别）。

　　八组溶剂列于Ｐ40表2-5中。

每组溶剂代表一类选择性。

如Ⅰ组内溶剂醚、胺等是良好的质子接受体，它们与能够给出质子的组分如酸、酚等的作用力大，而Ⅵ组溶剂如硝基化合物、腈、砜类等与偶极矩大的组分之间作用力大，Ⅷ组溶剂是良好的质子给予体，如氯仿、酚、烷醇等，它们与碱性组分如胺类等的作用力大。

4、溶剂的选择性（上图的使用）

对于给定的分离问题，为了寻找一种最佳溶剂，必须分别考滤溶剂的极性Ｐ'或ε°和选择性参数。

首先，考滤Ｐ'或ε°使k'值至最佳范围（1～10）,接着就要考滤选择性,即选择一种Ｐ'值相同而Ｘi不同的溶剂。

要达到此目的，必须从其它溶剂组中寻找合适的溶剂，若仍在同一组内寻找，就不可能使选择性有明显的改进。

　　例：

用正相色谱分离一样品，用20%（V/V）氯仿-己烷作流动相时,溶剂强度合适,但分离情况不好,此时,混合溶剂的Ｐ'值为:

Ｐ'ab＝ΦaＰ'a+ΦbＰ'b＝　0.8×0.01+0.2×0.41＝0.83

为了实现良好的分离,必须改变溶剂的选择性,即使溶剂所在图2-13中的位置发生较大的改变。

查表2-5，氯仿属于Ⅷ组，∴要寻找远离Ⅷ组的溶剂组，其溶剂的选择性一定与氯仿有较大的差别，如Ⅰ组和Ⅴ组（见图2-13），然后从表2-5中查得二氯甲烷、氯乙烯属于Ⅴ组，因此用二氯甲烷代替氯仿。

此时二氯甲烷与正己烷的具体配比为：

　　　ΦaＰ'a+ΦbＰ'b＝　ΦaＰ'a+ΦcＰ'c

Φc≈Φb（Ｐ'b／Ｐ'c）＝0.2×（4.1／3.1）＝0.265

即用26%（V/V）的二氯甲烷-正己烷。

这种新的混合溶剂的Ｐ'并未改变：

　　　　　Ｐ'＝0.265×3.1+0.74×0.01＝0.82

　　假如用26%（V/V）的二氯甲烷-正己烷作流动相，其选择性仍不满意，可再从Ⅰ组中选溶剂，如三乙胺或乙醚等，配成混合溶剂进行实验，直到满意为止。

　　由于非极性溶剂与组分分子间的作用力远小于极性溶剂与组分分子间的作用力，因此，改变非极性溶剂对改进选择性见效不大。

但是，如果样品中的组分是一些折光率有较大差别的非极性化合物，这说明它们的色散作用力有差别，此时，若选用折光率不同的另一种非极性溶剂，可使溶剂的选择性改进。

5、吸附色谱中的溶剂强度与溶剂强度参数

　　在ＬＳＣ中，不用溶剂极性参数Ｐ'而用溶剂强度参数ε°来表示溶剂强度。

ε°越大的溶剂,其溶剂强度越大,洗脱能力越强。

对纯溶剂：

溶剂强度随溶剂的极性↑而↑。

　　对混合溶剂：

在ＬＳＣ中，混合溶剂的ε°不随溶剂组成的改变呈线性变化，如图所示。

可见：

　　①与ε°与Ｂ（极性溶剂）的含量不成线性

关系，除非Ｂ的含量很小或Ａ（非极性溶剂）与Ｂ的洗脱强度相差较小（如正戊烷和氯仿）。

　　②Ｂ的含量对ε°的影响特别大，对于两种洗脱强度相差大的溶剂更为显著。

③配制同一洗脱强度的混合溶剂，可采用多种不同的配方。

　　LSC中的溶剂强度可根据如下方法确定：

Ａ.　查Ｐ36表2-3,粗略确定ε°值，再在Ｐ37图2-12上找到合适的ε°处做垂线,可得到几种候选的混合二元溶剂。

　　Ｂ.　用TLC来探索溶剂体系（∵组分在TLC和LSC中的保留机理基本一样），一般情况下，LSC中所采用的流动相的极性应略小于TLC中流动相的极性。

五、LSC

　　LSC中的固定相多为硅胶或氧化铝，其保留机理与TLC基本一样，即在固定相表面发生了两种竞争作用：

①组分分子和流动相分子对吸附剂表面活性中心的竞争；②各类组分分子对活性中心的竞争。

　　对极性弱的组分，不被吸附剂强烈吸附，易洗脱，k'较小，先流出；

　　对极性强的组分，易被吸附剂强烈吸附，不易洗脱，k'较大，后流出。

　　显然，若样品中的组分含有极性不同的取代基或含有数目不等的极性基团，则k'相差大，易分离。

　　LSC取适合于分离可溶于有机溶剂的样品，它特别容易分离官能团数目不同的化合物及异构体。

样品极性可从非极性到中等极性，如多核芳烃、脂肪、油类、水溶性和脂溶性维生素、植物色素等。

　　LSC不适宜于强极性或离子型的样品，也不大适用于同系物的分离。

（∵每增加一个－CH2－，k'值变化不大）

　　LSC中溶剂的选择，可根据Ｐ36所述，进行选择。

六、键合相色谱

1、为了克服LLC中固定液易流失的缺点，出现了化学键合固定相。

化学键合固定相就是通过化学反应将固定液键合到载体表面。

采用化学键合固定相的色谱方法，就是键合相色谱。

其特点为：

　　①化学键合固定相非常稳定，在使用过程中不流失；

　　②适宜于梯度洗脱；

　　③特别适合于k'值范围很宽的样品；

　　④根据样品的不同，可以采用正相色谱或反相色谱分离法。

2、正相键合相色谱

采用极性键合固定相、非极性流动相。

适合于分离中等极性的样品。

　　固定相：

将氨基、氰基、羟基或其它极性基团键合到硅胶载体上，其中氰基键合相更为常见。

　　流动相：

由正庚烷、正己烷等加上少量极性溶剂组成。

3、反相键合相色谱

采用非极性键合固定相、极性流动相。

　　固定相：

将C8、C18等非极性基团键合到硅胶载体上,其中C18键合硅胶用得崐最多，称为ODS固定相。

　　流动相：

极性较大，如水、水－甲醇、水－乙腈、水－THF等。

　　反相键合相色谱适合于分离极性较大的组分的分离，也可以分离同系物或稠环芳烃和多环芳烃（因每增加一个－CH2－或苯基,k'的变化较大）。

反相健合相色谱的应用特别广泛,它实际上已经成为液体色谱的一种标准分离方法。

　　例１　血浆中双氢氯噻嗪的分析

　　通过血浆中药物残留量的分析：

①了解人体对药物的吸收情况，如三种补锌剂葡萄糖酸锌、草酸锌、硫酸锌，只有葡萄糖酸锌最易被吸收；②根据血浆中药物残留量的分析还可确定给药方法如服药时间间隔及每次服用量等。

　　例２　纤维素水解产物的分离

　　样品处理：

　　　　　　　　H+／H2O调pH值过滤极性键合相色谱

　　纤维素样品───→　─────→　───→　─────────→

　　例３　PTH氨基酸的反相键合相梯度分离（PTH为苯基海硫因酸，见胶片）

例４　加人工甜味剂的软饮料的分析

　　在例４的流动相中加入乙酸实际上是使用了离子抑制技术，以使苯甲酸出峰对称。

4、离子抑制法

　　用反相键合相色谱法分离某些弱酸性样品（如十二烷酸）时，会产生十分显著的拖尾。

在流动相乙腈－水中加入少量乙酸后，就可得到对称的色谱峰。

这是由于乙酸的加入抑制了十二烷酸的离解，使它以游离酸的形式在固定相上分离，从而获得良好的峰形。

　　对于在水溶液中能够离解的弱酸或弱碱性样品，在反相键合相色谱中，通过调节流动相的PH值，抑制它们的离解，从而提高柱效，得到对称的色谱峰。

这种方法称为离子抑制法。

　　能否采用离子抑制法，决定于组分的PKa值。

　　对于弱酸：

PKa值的范围为3.0≤ＰＫa≤7;

　　对于弱碱：

PKa值的范围为7.0≤ＰＫa≤8.0。

　　对于PKa＜3的酸或PKa＞8的碱,一般不采用离子抑制技术。

因为当2＞PH＞8时,往往会使键合固定相受到破坏,同时,不锈钢柱子也会受到腐蚀。

　　对于PKa＜3的酸或PKa＞8的碱,可采用离子对色谱法进行分离。

七、离子对色谱

　　离子对色谱亦有正相离子对色谱和反相离子对色谱之分。

目前，反相离子对色谱更为流行。

所以我们在这里主要介绍反相离子对色谱法。

1、原理：

　　有一色谱体系，固定相为非极性的（如ODS键合相），流动相为水溶液，并在其中加入一种电荷与被分离组分离子相反的离子B＋（对离子，平衡离子）。

由于静电引力，B＋与带负电荷的组分离子生成离子对（有疏水性）。

离子对的生成可表示为：

A－水相＋B＋水相　＝　A－B＋有机相

　　由于离子对具有疏水性,因而被非极性固定相（即有机相）提取，组分离子的性质不同，它与平衡离子B＋形成离子对A－B＋的能力大小不同，并且形成的离子对A－B＋的疏水性亦不同，从而导致各组分离子在固定相中的滞留时间不同，到达检测器的时间亦不同。

这就是离子对色谱法的基本原理。

2、常见离子对：

（见Ｐ43）

　　　季铵盐用于有机酸；

　　　叔胺用于磺酸盐；

　　　烷基与芳基磺酸盐或硫酸盐用于有机碱；

　　　苦味酸用于有机胺（高选择性，因苦味酸有强酸性）。

3、影响保留值的因素

⑴在反相离子对色谱中，组分离子的保留值受离子对A－B＋的疏水性和平衡崐离子的浓度所控制：

　　　离子对疏水性越强，在疏水性固定相上的溶解度越大，保留值越大；

　　　离子对疏水性越弱，在疏水性固定相上的溶解度越小，保留值越小。

⑵平衡离子B＋的浓度越大，越有利于A－B＋的形成，使k'↑,保留值越大。

⑶流动相的PH值：

PH值对分离影响很大而且复杂，原则上应将流动相PH值调节到能够使不同的组分都有合适的离解度，过高或过低的PH值都使k'↓。

4、应用举例

　　一般来说，离子对色谱常被用于分析极性样品，如碱、离子型化合物及带有多个可电离的基团的化合物。

　　例1　水溶性维生素的分离（P43）

　　例2　染料及中间体的分离

　　染料及中间体中含有磺酸基、羧基等可电离基团，适合于用离子对色谱分离。

崐　　

色谱条件：

　　柱子：

12×0.5cm,Partisil10（7μm）

流动相:

1%1631的丙醇/水（30/70V）溶液

温度:

室温

检测器:

UV检测器

样品:

γ酸、j酸、二羟基j酸、二j酸

八、离子交换色谱法（IEC）

　　IEC在60～70年代曾被认为是分离和分析蛋白质、氨基酸混合物的最有力的工具和方法，但现在许多这方面的工作也可由离子对色谱（IPC）来完成。

IEC的另一个经典的应用领域是分离和分析原子能工业中镧系元素和锕系元素。

现代IEC除了上述两个重要用途外，还可用来分析能以离子状态存在的有机酸（HA）和有机碱（B）。

1.原理

　　离子交换色谱法是基于样品离子X与平衡离子Y与固定相上的基体离子R（也称交换离子）之间的离子交换作用而实现的：

　　　　　　　　　　　　　　　　　交换

　　　阴离子交换：

　Ｘ－＋Ｒ＋Ｙ－

Ｙ－＋Ｒ＋Ｘ－

　　　　　　　　　　　　　　　　　洗脱

　　　　　　　　　　　　　　　　　交换

　　　阳离子交换：

　Ｘ＋＋Ｒ－Ｙ＋

Ｙ＋＋Ｒ－Ｘ+

　　　　　　　　　　　　　　　　洗脱

　　例如，在阳离子交换色谱中，样品离子Ｘ＋与平衡离子Ｙ＋争夺交换剂上的基体离子Ｒ－，对Ｒ－亲合力大的Ｘ＋（即交换能力大的Ｘ＋），容易交换到离子交换剂上，保留较强，不易被流动相洗脱下来，从柱上洗脱较晚；对Ｒ－亲合力小的Ｘ＋（即交换能力小的Ｘ＋），不容易交换到离子交换剂上，保留较弱，容易被流动相洗脱下来，从柱上洗脱较早。

　　由于Ｘi（被分离组分）的结构不同，它们对Ｒ的亲合力也不同，从而在柱上的保留值不同，最后得以分开。

2、ＩＥＣ的固定相：

　　Ａ.　全多孔型离子交换剂：

将－SO3-、-NR3+Cl-（强酸性、强碱性，较常用）或-COOH、-NH2（弱酸性、弱减性，不常用）引入交联苯乙烯。

其溶胀体积随PH、流动相不同而变化。

　　Ｂ.　表面多孔型离子交换剂：

将薄薄一层离子交换剂用物理或化学方法包覆在玻璃珠或硅胶载体上，如图所示：

　　表面多孔型离子交换剂具有刚性好，透过性好，易装柱，不随流动相改变而变化等优点。

3、流动相:

无机盐或有机盐的缓冲溶液（水为溶剂）。

流动相的PH值、离子强度、平衡离子的种类和浓度、以及加入流动相的有机溶剂均对分离产生影响。

见Ｐ47～48。

4、应用举例：

　　　阳离子交换色谱分离氨基酸

九、大小排阻色谱（ＳＥＣ）

　　ＳＥＣ又称为ＧＰＣ，专门适用于分离分子量有较大差别的样品，在高分子科学中有详细的介绍。

十、ＨＰＬＣ中各种分离方式的选择

1、水溶性样品:

2、非水溶性样品:

十一、ＨＰＬＣ的应用

1、定量：

　　类似于GC中的定量分析，所依据的较准方法也分为外标法和内标法，其中内标法中内标物的选择亦与GC中相同或相似。

2、定性：

　　⑴利用保留值定性；

　　⑵收集流分，进行IR、NMR等鉴定。

　　例：

胶乳中表面活性剂的分离

A：

RC6H3（SO3）OC6H4SO3Na;

B：

RC6H4