抗原多肽的设计偶联策略.docx

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抗原多肽的设计偶联策略

抗原多肽的设计、偶联策略

抗体是生命科学研究中不可或缺的工具之一，应用范围包括蛋白质表达检测和鉴定、蛋白质加工、蛋白质在细胞内的定位、免疫中和反响、蛋白质同源结构域研究、蛋白质纯化以及疾病的免疫诊断和治疗。

尽管抗体的制备过程不存在技术难点，但是抗原的选择以及所制备抗体的用途对能否获得一个优质高效的抗体至关重要。

以下将对抗原多肽的设计、偶联策略等逐一介绍.

抗原设计

首先选择适宜的多肽序列，明确最终产物的用途对选择序列非常重要。

如果仅仅需要生产针对蛋白质某个区域的特异抗体，比方研究蛋白质N端的前提物，我们就需要设计N末端的多肽抗原。

如果抗体的使用目的是识别修饰的氨基酸，如磷酸化的丝氨酸、苏氨酸或者酪氨酸，乙酰化赖氨酸等，就必须对多肽进行相应的修饰。

如果抗体最终用来识别自然状态下的蛋白质，对抗原的设计就要求更高。

一般情况下抗血清能够识别用来免疫的多肽序列，但是不一定识别蛋白质的折叠结构。

蛋白质的抗原决定簇一般由6－12个氨基酸构成，呈连续性或者非连续性序列。

连续性抗原决定簇由连续的氨基酸序列构成，而非连续抗原决定簇包括一组非连续氨基酸，这些氨基酸由于蛋白质的折叠而形成在空间上相互毗邻。

针对连续性抗原决定簇的抗体能够识别没有被埋藏在蛋白质内部的序列，而非连续性抗原的抗体能否识别抗原决定簇取决于用于抗体生产的多肽是否存在二级结构。

氨基酸序列的亲水性、表露性、柔韧性决定了多肽的抗原性。

许多水融性的自然状态下的蛋白质其亲水序列暴露在外测，而疏水性氨基酸序列包埋在内部。

抗体结合蛋白质外表的抗原决定簇，另外抗原决定簇柔韧性比拟高。

蛋白质的C末端经常暴露在外测并且有较高的柔韧性，因此经常被用来作为抗体生产的抗原。

但是如果C末端是跨膜蛋白质的膜内局部，该序列可能由于疏水性太强而不适合用来作为抗原。

同C末端序列类似，蛋白质的N末端序列也经常暴露在蛋白质的外表，同样为首选抗原序列。

预测蛋白特性〔例如亲水性、疏水性〕及二级结构〔例如α－螺旋，β－折叠，β－盘旋〕的一些算法有助于选择表露性较高，有抗原性的内部序列以用于抗体生成。

常见预测性算法有如下三种，Hopp及Woods所描述的亲水性曲线给蛋白序列中的每一个氨基分配一个平均亲水性值，对于一系列的相邻氨基，平均亲水性的最高点通常就位于抗原决定簇或在其附近。

Kyte及Doolittle所提出的另一算法略有不同，它主要是衡量蛋白序列的亲水性及疏水性趋势，该算法对于预测某蛋白的外部及内部区域非常有用。

蛋白的二级结构那么可以通过CHOU/FASMAN或LIM所提出的算法来预测。

表露性或易接近区常常和螺旋区或延展的二级结构区相邻。

并且，具有β－盘旋或双性螺旋特性的序列区也具有较好的抗原特性。

目前有许多商用软件包都使用了这些不同的算法，例如MacVectorTM，DNAStarTM及PC-GeneTM。

要想预测准确，不能只使用一种算法。

结合各种不同的预测方法来预测抗原性区域，可使成功率大大提高。

抗原性区域确定以后，接下来要确定多肽的长度。

关于选定多肽长度有两种不同的观点。

一种观点认为长的多肽〔20－40个氨基酸〕比拟好，因为长的多肽无疑会增加抗原基的数量。

另一种观点那么认为小的多肽更有效，使用小的多肽能保障所产生抗体的位点特异性。

但有一点是明确的，不管长度如何，所选多肽必须能够较容易地通过生化合成得到，并且能溶解到水溶性缓冲剂进行载体蛋白的耦联。

由于受副反响的影响较大，高于二十个氨基酸的多肽通常很难进行高纯度合成，并且常常会含有缺失性序列。

另一方面，太短的多肽〔<10个氨基酸〕那么会产生识别特异性很强的抗体，以至于无法识别整体蛋白，或亲和性很低。

因此综合考虑制备性抗原地多肽有效长度一般是10－20个氨基。

这种长度的多肽序列会最大程度的减小生化合成困难，具有一定的水溶性，也会具有一定程度的二级结构。

抗原准备－耦联方法

化学合成的多肽抗原是小分子，本身很难具有好的抗原性，只能诱导动物产生很弱的免疫反响，因而与载体蛋白耦联是很重要的。

载体蛋白含有很多抗原决定基，能够刺激T－帮助细胞，进而诱导B－细胞反响。

用于与多肽耦联的载体蛋白有多种，其中最常用的是keyholelimpethemacyanin（KLH）,牛血清白蛋白〔bovineserumalbumin，BSA〕,卵清蛋白〔ovalbumin，OVA〕和牛甲状腺球蛋白〔bovinethyroglobulin，THY）。

KLH具有更高的抗原性，是最为常用的多肽耦联载体。

BSA也常用来作为多肽载体，但由于BSA经常被用做检测试验的阻断剂而使得该方法生产的抗体在应用上存在着一定的局限性。

设计合成性多肽常常被忽略的一个方面是如何将多肽耦联到载体蛋白上。

例如，N－端序列需要通过C－端氨基酸耦联，而C－端序列那么需要通过N－端氨基酸耦联。

内部序列那么可以耦联到任何一端。

内部序列耦联的另一考量那么是将非共轭端酰基化或氨基化，因为原蛋白分子序列中不会含有带电荷的末端。

最常用的耦联方法都是基于自由氨基（alph-氨基或Lys）、sufhydryl（Cys）或羧基集团（Asp,Glu,或alpha-羧基）的存在。

所有的耦联方法都应该是通过羧基或氨基端残基将多肽耦联到载体蛋白上。

所选序列不能有多个残基都能参与所选耦联化学反响。

如果多个反响位点存在，可以考虑将多肽序列缩短，或者选择所有反响位点都位于一端的多肽。

对于内部序列通常会使用离所预测抗原位点较远的一端进行耦联，这样可以防止可能的屏蔽问题。

除非研究人员另做说明，我们通常使用EDC（1-ethyl-3-（3-dimethylaminopropyl）carbodiimidehydrochloride）或carbodiimide方法将多肽和载体进行耦联。

Carbodiimides能激活天冬酰胺酸及谷氨酸的侧链羧基集团及末端羧基集团，使之与主胺基发生耦联反响。

激活的多肽与载体蛋白混合而产生最终的共轭体。

如果载体蛋白先被激活，EDC方法那么通过N－末端alpha－氨基，或者，如果序列中有赖氨酸的话，那么可以通过赖氨酸的侧链氨基与载体蛋白耦联。

m-Maleimidobenzoyl-N-hydroxysuccinimide酯（MBS）是一种双性多肽耦联试剂，可以将多肽与载体蛋白通过半胱氨酸耦联。

耦联发生在半胱氨酸的硫醇基。

如果多肽序列中不包括半胱氨酸，可以将一个半胱氨酸加到多肽的N-端或C-端，以获得可控性更强的多肽与载体蛋白的耦联。

为了合成方便，我们建议将半胱氨酸加到多肽的N-末端。

戊二醛是一种双作用耦联试剂，可以将两个化合物通过氨基集团耦联在一起。

戊二醛能起到非常灵活的间隔多肽和载体蛋白的作用，时多肽能尽可能的暴露给免疫系统。

但是，戊二醛是一种反响性很强的化合物，可以和Cys,Tyr及His等氨基酸发生一定程度的反响。

反响后会形成结构很难预测的共轭体。

因此，如果多肽序列末端只含有一个单一的自由氨基时，戊二醛方法非常有用。

如果多肽含有多个自由氨基集团，会形成多聚合物，结构很难预测，尽管有很高的抗原性。

因为与BSA耦联的多肽刺激产生的抗血清也含有针对BSA的抗体，一次可能导致假阳性结果。

尽管KLH较大并有抗原行，但它在耦联过程中可能会沉淀，因而有时候会很难处理。

卵清蛋白〔OVA〕是另一种可以使用的载体蛋白。

当要检验抗体只是针对多肽而不是针对载体蛋白时，OVA时用作第二载体的很好选择。

当要将抗体抗载体蛋白的反响降到最低时，可以使用兔血清白蛋白做载体。

用RSA耦联体免疫过的兔子不太可能产生针对载体的抗体，因为RSA是兔子自身的蛋白。

如果注射动物不是兔子RSA那么不会被认为是自体蛋白。

免疫系统是对多肽－载体蛋白整体发生反响的，即免疫反响有一局部是针对耦联多肽，一局部是针对中间连接体，有一局部是针对载体蛋白。

当用ELISA做筛选时建议使用不同载体蛋白耦联的多肽聚合物。

如果ELISA是在非耦联多肽涂层的多孔板上做时那么没有必要这样做。

多抗原位点多肽

MAP体系代表着生成抗多肽抗体的另一种独特方式。

该体系基于一个小的无抗原性的多分枝赖氨酸核，在该赖氨酸核上同时并行合成了多个多肽。

其结果是形成了一个三维大分子，因为它有很高的多肽抗原比例，因而不再需要使用载体蛋白来诱导抗体反响。

每一个核分子可链接四个相同多肽。

理论上讲，与耦联到载体蛋白的单分子多肽相比，ＭＡＰ具有一定的优势，因为ＭＡＰ的赖氨酸核与多肽抗原相比显得很小。

这样抗原的浓度就会到达最高。

因而MAP体系具有很高的抗原性，与耦联到载体蛋白的单分子多肽相比，具有很高的有效抗原浓度。

有一点要指出的是，ＭＡＰ体系在合成是可能会有问题。

赖氨酸核的多分枝性允许多拷贝多肽的合成，但如果合成的多肽较长，位阻（现象）会成为问题，导致该多聚体的有些肽链臂丧失氨基，成为缺失性产品。

复合体的高分子量使质量控制措施〔质谱或分析性HPLC〕很难实行。

MAP的间接合成那么解决了分析问题。

间接合成时，多肽首先合成、纯化，并作质谱或HPLC分析。

合成的多肽抗原再通过Cys链接到赖氨酸核上。

动物选择

要生成好的抗体，必须选择与抗原源差异较大的动物。

要想获得最大的免疫反响，绝对不能让免疫动物对抗原产生‘自体识别’。

例如，要想生成抗人体蛋白的抗体，使用兔或老鼠比使用猴子要好。

对于非常保守的哺乳动物蛋白，使用鸟类动物〔如鸡〕效果较好。

动物免疫

我们通常使用弗氏佐剂〔Freund's〕与抗原进行混合。

第一次注射完全使用Freund's的免疫辅助剂。

辅助剂与抗原联合使用，可以提高免疫反响，从而用较少的疫苗可以产生较强的免疫反响。

佐剂可以使抗原缓慢释放，从而产生持续性刺激。

注射方式为多位点的皮下注射。

每只注射动物都要先收集免疫前血样，以用于和以后的免疫血样比拟。

所采集的血清样本含有不同的免疫型和亚型。

抗体保存

存储抗体溶液的最常见问题是细菌污染。

加0.1％的叠氮化钠保护剂那么可以防止污染。

如果您想长期保存血清，建议使用叠氮化钠。

抗体血清应在－20度保存。

抗体溶液不宜反复冻融，这样易导致抗体失活。

建议将血浆存储在－20度的季铵氯化物中。

在该温度下抗体可以稳定保存多年。

消过毒的血清或储存温度为－70度时那么不需要添加防腐剂。

当保存时间较长时，抗体溶液会产生一种不溶性的脂类成分。

该脂类成分可以通过离心去除。

如果脂类成分在水面上形成薄膜，只需将水溶液局部取出，并按上述方法保存即可。

参加叠氮化钠保护剂的抗体溶液如果形成脂类薄膜并不说明细菌污染。

当血清是用作细胞培养或体内研究时，那么不能加叠氮化钠。

抗体鉴定

检测抗多肽反响是否发生的最简单方法就是抗多肽ELISA。

有两种技术可以将多肽链接到ELISA板上。

第一种方法就是直接将多肽链接到盘上。

但如果链接氨基酸恰好是抗原决定簇的一局部，那么抗体无法和多肽进一步链接，这样产生假阴性结果的可能性增加。

第二种方法那么是先将多肽与载体蛋白耦合，然后将多肽－蛋白耦合体链接到ELISA盘上。

这种链接方法会使抗体－多肽的结合成功率提高，因为多肽不是直接嵌入盘膜，因而会更加暴露给抗体。

这种方法因而更可靠，可重复性更高。

需要注意的是，用于该方法的载体蛋白必须不同于用于免疫耦合的载体蛋白。

这样会防止血清中抗载体蛋白反响所导致的高背景反响。

当做血清检测时，另一点需要记住的是，由于免疫多肽与自然多肽结构上的差异，检测时的抗多肽反响与试剂的抗多肽反响可能是不同的。

任何检测，尤其是测定滴定量以决定收获点时，必须包括针对天然状态下蛋白的检测。

当然可以做针对天然状态下蛋白的ELISA；但由于血清在不同检测体系中表现会不一样，因此最好在血清被日常使用的体系中进行蛋白识别鉴定。

如果血清将用于免疫沉淀反响，就应该进行针对该反响的检测。

抗体纯化

如抗血清使用过程中出现很高的背景，可使用几种不同的方法对抗血清进行纯化。

非常重要的是首先必须确定背景是非特异性的，也就是说信号并非由抗血清对多肽的免疫反响造成的。

多肽竞争是用来研究这一现象的很好的方法。

硫酸氨沉淀

硫酸氨沉淀是从溶液中别离蛋白质的常用方法。

这是一种比拟原始，非特异性别离技术，可以用来别离大局部膜蛋白，免疫球蛋白会残留于溶液中。

在溶液中，蛋白质会通过暴露于外的极性和离子基团同水分子形成氢键。

参加象氨或硫酸根这样的小分子可以使蛋白质失去结合的水分子，从而使蛋白质从溶液中沉淀出来。

需要强调的是硫酸氨沉淀法难以得到高纯度的抗体。

其它大分子蛋白和混入絮状沉淀中的蛋白会造成对抗体的污染。

我们建议硫酸氨沉淀做为蛋白质纯化的一步，并采用其它方法对得到的蛋白质进行进一步纯化。

蛋白A/G结合法

A蛋白或G蛋白对IgG抗体Fc臂具有特异吸附，此特性可用于纯化IgG抗体。

蛋白A产于葡萄球菌〔Staphylococcusaureus〕。

它可以吸附两个IgG分子。

此吸附基于对Fc臂的特异性，不影响抗原吸附位点。

G蛋白产于G型链球菌〔GroupGstreptococci〕,G蛋白以同A蛋百类似的方式吸附IgG抗体的Fc臂。

对不同物种产生的IgG，A蛋白和G蛋白的吸附能力有一定的差异。

选用方法前应对其吸附能力进行检测。

比方，G蛋白适合羊IgG，但A蛋白不具有此特性。

A蛋白和G蛋白都没有对鸡IgG的吸附能力。

从A蛋白和G蛋白柱上洗脱抗体时，须非常小心，以免抗体变性。

免疫亲和纯化法

免疫亲和纯化法是用于从原血清中别离抗原特异性抗体的最长用方法。

同A蛋白和G蛋白不同，这种方法不能取得非特异性的Ig局部。

在此方法中，多肽抗原首先共价结合于别离柱上的固定相。

这样，多抗样品中对此多肽抗原有特异吸附的抗体将由于同抗原的吸附而留在别离柱上。

未能结合的抗体将从别离柱上首先被洗脱，进一步洗脱将得到特异性抗体。

用免疫亲和纯化法得到的抗体具有很高的特异性。

使用此方法时，会由于洗脱条件的选择，有时造成所别离抗体的失活。

所以，比拟提纯后样品同原血清的抗体活性非常重要。

常见问题

1．采集到的血清呈现红色，是什么原因造成的？

对使用有何影响？

如何去除？

红色是溶血造成的，也就是在血样采集处理过程中红细胞裂解，将血色素释放到抗血清中。

这在某些兔群中时有发生，尤其在较难放血的兔子中经常碰到。

没有理由担忧溶血会影响血清质量。

抗血清中含有血色素并不会影响抗血清的特性。

并且任何红细胞残留物经过血清处理中的标准离心步骤后都会被去掉。

如果需要，血色素可以通过以下方法去除：

往血清中参加45％（NH4）2SO4，在4摄氏度下搅拌两个小时。

然后将溶液离心，将外表漂浮物去除。

沉淀物可以在等量的水中再溶解，然后在所选的测试体系中进行同步检测。

如果抗多肽反响已经确定，那么可以通过亲和性纯化将非特异性局部去除。

值得注意的是，将抗体从柱子上洗脱所需要的条件有可能会使抗体变性，从而导致对蛋白的亲和性下降或消失。

因此我们建议，在大规模纯化血清前，可以先纯化一个测试样品。

原始血清比纯化的血清存储时间要长的多。

可以在需要的时候纯化一定的体积，这样作对抗体的保存较为稳妥。

用于纯化的亲和柱一经制备后，可以储存以备后用。

要进行亲和性纯化需要将多肽连接到层析树脂上。

应该选择什么样的活化亲和性树脂呢？

我们一般推荐使用NH2链接将多肽耦联到树脂柱上。

这种链接最稳定，可以选择NHS或CNBr活化树脂（PharmaciaBiotech）进行亲和柱的抗体耦联。

2．如何使用多肽亲和性树脂纯化抗血清？

在4oC将血清离心〔2000xg〕，以去除任何颗粒或红细胞；利用PBS或TBS〔pH7.4〕将血清按1:

1稀释，每毫升亲和树脂施用5毫升血清，流速不能超过1毫升/分钟，在280nm下测试吸光度。

将未结合的局部按2-5倍的比例重新过柱。

在4oC时耦联效率最高；收集未结合材料，利用浓缩装置〔>10kd〕进行浓缩，以备测试；利用氨基乙酸〔glycine〕进行洗脱〔pH1－2〕，在pH2.0时开始洗脱，在吸光度降到基线以下时收集洗脱液。

将洗脱液的pH降低0.5-1，直到已没有可检测到的抗体从柱上洗下来；收集从纯化柱上收集的各个局部，收集后通过参加1/10体积1MTris-HCl〔pH=8.0〕或pH8.0的洗脱液将其中和；将纯化的多肽进行ELISA分析，以决定具有最高亲和性的洗液局部。

将适当的抗体洗脱液浓缩至2-5mg/ml，混合50％甘油在－20oC下保存，或混合0.1%BSA在4oC下保存。

参加0.01%NaN3作为防腐剂。

3．看起来有些浑浊的血清是否还可以使用？

一般来讲，这不会是问题。

使用前可以用μm的过滤器去除血清中的小颗粒

Antigendesign&serapurification

Antibodiestosmallpeptideshavebecomeanessentialtoolinlifescienceresearch,withapplicationsincludinggeneproductdetectionandidentification,proteinprocessingstudies,diagnostictests,proteinlocalization,activesitedetermination,proteinhomologystudiesandproteinpurification.Whileitisquiteeasytogenerateanti-peptideantibodies,itisimportanttocarefullyconsidertheultimateusefortheantibodyandthesequenceusedtoensuresuccess.Thistechsheetwillbrieflyexplorepeptideselectionanddesign,couplingstrategy,andcarrierproteinswhichareimportantfactorsinanti-peptideantiserageneration.Serumpurificationwillalsobediscussed.Formorecompletecoverageofantigendesign,pleaserefertotheReferences1,2.

PeptideSelectionandDesign

Thefirststepintheprocessistheselectionoftheappropriatepeptidesequence.Atthissteptheultimateusefortheantibodymustbeconsidered.Iftheantibodyisneededtoprobeaspecificproteindomainthenthechoiceissimple.Forexample,ifoneisstudyingproteolyticprocessingofanN-terminalprecursor,antibodiesagainsttheN-terminalregionofinterestwouldberaised.Likewiseifthegoalistomonitorthephosphorylationstateofaspecificsequence,antibodiestothephosphorylatedsequencecanbeused.

Ifthegoalistoraiseantibodiesthatwillrecognizetheproteininitsnativestate,theproblembecomesmorecomplex.Anti-peptideantibodieswillalwaysrecognizethepeptide.However,thesameantibodymaynotrecognizethesequencewithinthefoldedintactprotein.Sequenceepitopesinproteinsgenerallyconsistof6-12aminoacidsandcanbeclassifiedascontinuousanddiscontinuous.Continuousepitopesarecomposedofacontiguoussequenceofaminoacidsinaprotein.Anti-peptideantibodieswillbindtothesetypesofepitopesinthenativeproteinprovidedthesequenceisnotburiedintheinterioroftheprotein.Discontinuousepitopesconsistofagroupofaminoacidsthatarenotcontiguousbutarebroughttogetherbyfoldingofthepeptidechainorbythejuxtapositionoftwoseparatepolypeptidechains.Anti-peptideantibodiesmayormaynotrecognizethisclassofepitopedependingonwhetherthepeptideusedforantiseragenerationhassecondarystructuresimilartotheepitopeand/oriftheproteinepitopehasenoughcontinuoussequencefortheantibodytobindwithaloweraffinity.

Whenexaminingaproteinsequenceforpotentialantigenicepitopes,itisimportanttochoosesequenceswhicharehydrophilic,surface-oriented,andflexible3.Mostnaturallyoccurringproteinsinaqueoussolutionshavetheirhydrophilicresiduesonthesurfaceandtheirhydrophobicresiduesburiedintheinterior.Antibodiesbindtoepitopesonthesurfaceofproteins.Additionally,ithasbeenshownthatepitopeshaveahighdegreeofmobility4.

BecausetheC-terminiofproteinsareoftenexposedandhaveahighdegreeofflexibilitytheyareusuallyagoodchoiceforgeneratinganti-peptideantibodiesdirectedaga