Northern Blot.docx
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NorthernBlot
NorthernBlot实验方案
一.探针准备—体外转录
1.RNA探针的制备
基本要求：
不被RNase污染。
（1）制备线性DNA模板
a.引物设计
采用ArrayDesigner4设计引物，在下游引物的5'端加上T7启动子序列（蓝色部分标示）。
如下例：
AGTAATTGGAATTACAGCTAGGCAGCAAGCGAATGAATCCCGATAAGCTGACTCACGTCAGTGATTCGGGTGAGTGAGTGCCGCTAACAACGCTGCAATTTCAAGTAAGAAGAGTGTTACCCAAAGTAATTGGAATTACAGCTAGGCAGCAAGCGAATGAATCCCGATAAGCTGACTCACGTCAGTGATTCGGGTGAGTGAGTGCCGCTAACAACGCTGCAATTTCAAGTAAGAAGGGTGTTACCCAAAGTAATTGGAATTACAGCTAGGCAGCAAGCGAATGAATCCCGATGAGCTGACTCACGTCAGTGATTCGGGTGAGTGAGTGCCGCTAACAACGCTGCAATTTCAAGTAAGAAG
Probe-F:
5'AGGCAGCAAGCGAATGAATC3'
probe-R:
5'AATTGTAATACGACTCACTATAGGGCGGCGTTGTTAGCGGCACTC3'
预期产物大小：
198bp
引物设计原则同一般引物设计原则。
ArrayDesigner4可自行评价引物质量，选取引物时选best即可。
b.探针模板的的制备。
以91001染色体为模板，PCR扩增获得探针模板。
普通琼脂糖凝胶电泳检测模板大小是否正确。
扩增产物的纯化：
产物用QIAquickPCRpurificationKit（QIAGEN）纯化。
纯化后用DEPC水溶解，测浓度。
—20℃冻存。
（2）体外转录反应制备探针（20µl）两种方法
方法一：
a.NTPs的配置：
10×NTPs：
ATP/GTP/CTP各5µl（100mM）
UTP3.25µl（100mM）
DMPC处理水31.75µl
充分混匀，-20℃保存。
3.5mMDIG-11-UTP：
10mMDIG-11-UTP7µl
DMPC处理水13µl
充分混匀，分装后，-70℃保存，避免反复冻融。
b.室温下洁净通风橱中，于0.2mlRNase-freeEP管中加入：
DMPC水
µl
模板DNA
µl（200ng）
10×NTPs
2µl（终浓度1mM）
DIG-11-UTP（3.5mM）
2µl（终浓度0.35mM）
5XTranscriptionbuffer
4µl
RiboLock™RNaseInhibitor（40u/µl）
1µl
T7RNAPolymerase（20u/µl）
1.5µl
总体积
20µl
混匀，37℃保温2hr。
方法二：
DMPC水
10.5µl
线性模板DNA
1.5µl（0.2µg）
DIGRNALabelingMIX（10×）
2µl
5XTranscriptionbuffer
4µl
T7RNAPolymerase（20u/µl）
2µl
总体积
20µl
混匀，37℃保温2hr。
反应完成后：
1.2U/µlDNaseI1µl消化30min，2µl0.2MEDTA,pH8.0终止反应。
2.加入30µlDEPC水，使总体积达到50µl。
加入1/10体积的5M乙酸铵（5µl）涡旋混匀和3倍体积冰预冷的无水乙醇（150µl），-20℃放置2hr或过夜，12,000rpm4℃离心15-20min，75%乙醇漂洗，空气干燥。
用50µlDEPC水溶解，并测纯度和浓度。
并向其中加入20URNaseInhibitor，5µl分装，-70℃保存。
（3）dPAGE检查探针质量
a.配10%的丙烯酰胺胶，胶配制方法见下节。
b.取1-2µl探针，加等体积RNAGelloadingbuffer（Ambion）,90℃加热5min,上样
c.电泳。
200V,30min.
d.染色。
配制50ml1×TBE，加入SYBR5µl，将胶放入其中，震荡，染色30Min.
e.凝胶成像系统观察结果。
结果：
纯的探针只有一条带。
二变性PAGE、转膜、交联和杂交
1、变性PAGE电泳
a.使用玻璃板面积为10×8cm2,胶厚度为1.5mm,在使用之前，用75%的乙醇清洗玻璃板、梳子一遍再浸泡在双蒸水中，再晾干。
玻璃板若脏了可泡酸处理。
b.准备10-15%的变性胶：
胶浓度的选择（根据不同分子量）1×TBE，8M尿素
胶半个小时可以凝，不要放置过夜，最好现配现用。
如要保存放层析柜，冰箱4℃的话尿素会析出。
5%
10%
10%
15%
20%
10×TBE（ml）
1
1
1.5
1
1
尿素（超纯）（g）
4.8
4.8
7.2
4.8
4.8
40%丙烯酰胺液（ml）
1.25
2.5
3.75
3.75
5
DEPC水（ml）
4
2.7
4
1.45
0.2
25%APS（µl）
21
21
31.5
21
21
TEMED（µl）
3.5
3.5
5.25
3.5
3.5
总体积
10ml
10ml
15ml
10ml
10ml
胶配制方法按上表进行。
根据插入梳子的深浅来调整RNA样品的量，15ml的胶量足够10×8×1.5mm体积使用。
伯乐1.0mm厚,15孔的体积为10×3×1.0mm（最大30µl），10孔的体积为10×5×1.0mm（50µl）；1.5mm厚,15孔的体积10×3×1.5mm（45µl），10孔的体积10×5×1.5mm（75µl）。
尿素溶解十分缓慢，55℃加热3min帮助溶解，温度越高聚合速度越快。
为了避免聚合速度过快，加热后应冷却到室温。
c.预电泳：
用微波炉预热电泳缓冲液到55℃,在200V预先电泳至少30min预热胶，使胶的温度保持45-55℃，千万别超过60℃，以去除多余的过硫酸铵。
d.RNA样品准备及上样：
在预电泳期间，从-60℃,冰箱中取出的75%乙醇保存的RNA离心,4°C,12000rpm,10-20min,倒掉上清。
吸干残液,用无核酸酶水溶解，并测浓度和纯度。
调整野生株与突变株的上样量一致，加入等体积RNAGelloadingbuffer（Ambion）。
将样品在90℃加热5min,并迅速置于冰上防止RNA复性。
上样前，用10ml注射器彻底冲洗加样孔以去除多余的尿素，否则尿素会沉积在孔的底部，会影响RNA样品的分辨力。
e.正式电泳：
200V继续电泳30-40min（胶长20V/cm），直至溴酚蓝到达胶底部。
注：
电泳会看到两条蓝色的带，最下面为溴酚蓝，往上为二甲苯青FF**。
其在变性聚丙烯酰胺胶中的电泳迁移速度参考宝生物商品目录。
2、转膜
转膜准备：
膜、滤纸、镊子、剪刀、无粉手套等。
a.切胶，剪6张MMwhatman滤纸和稍大于胶的膜，并将膜与6层滤纸在1×TBE电转缓冲液中浸湿。
b.用2张电转缓冲液浸湿的滤纸，放在阴极侧，滚动玻璃滴管并挤走气泡。
c.将胶置于1张滤纸，并一起转移到2张湿润的滤纸上面。
在BrightStar-PlusMembrane膜右上角切一小块作标记，将膜浸湿后覆盖在凝胶上（凹面为正），用玻璃滴管滚动挤走气泡。
d.将最后3张浸湿的滤纸依次置于膜上，并赶走气泡。
e.将电泳装置至于冰上或4℃冰箱,转膜电流可按每2mA/㎝2.对于小于1500nt的RNA，转膜时间可控制在30min.转膜时要注意电极方向。
3、紫外交联
转膜完成后放入1×TBE浸泡5—10s。
膜必须保持湿润，将膜及下面滤纸放入紫外交联炉，1200mJ交联2min，紫外交联完场后将膜放入1×TBE浸泡。
4、杂交
DIGEasyHyb杂交液不含甲酰胺，无毒性，只应用含DIG标记的探针。
杂交温度一般为65℃，实际温度依赖G+C含量及探针与靶基因的同源性。
a.预杂交：
在杂交炉中65℃预热杂交液（20ml/100cm膜²）。
Ambion杂交液需要预热，罗氏的常温保存。
在此温度下将膜用杂交液充分浸泡后，温和震荡孵育膜40min以上。
b.将预杂交的杂交液倒去。
将探针添加到新的预热的杂交液（3.5ml/100cm²膜）混合（探针终浓度为20-50ng/ml）。
将探针与杂交液的混合物充分覆盖膜，避免起泡。
起泡后易导致背景。
注意不要将高浓度的探针膜直接倒到膜上，否则会产生高背景。
在65℃孵育至少6h-过夜（12-16h），可提高灵敏度。
四洗膜及显影
1.洗脱和封闭和免疫检测
试剂
原始浓度
工作浓度
保存及稳定
用途
Washingbuffer
10×（使用前剧烈摇匀变牛奶色）
用双蒸水稀释到1×
15-25℃
去掉非特异性结合的抗体
Maleicacidbuffer
顺丁烯二酸
10×
用双蒸水稀释到1×
15-25℃
稀释封闭试剂
Blockingbuffer
10×（先摇匀后分装防止污染）
用1×Maleicacidbuffer稀释到1×
临用前配制
封闭非特异性结合的位点
Dectionbuffer
10×
用双蒸水稀释到1×
15-25℃
调整pH=9.5便于底物反应
在每次使用前将抗体10,000pm×5min离心。
用Blockingbuffer稀释到1:
20000—1:
50000,在4℃可稳定12h。
a.65ºC预热高严谨洗液；
b.低严谨洗液（2XSSC,0.1%SDS），室温洗一次，5min。
c.高严谨洗液（0.1XSSC,0.1%SDS），65ºC15min。
e.将膜在Washingbuffer浸泡1-5min.
f.在Blockingbuffer（100ml/100cm²膜）中孵育30min.
g.在Antibodysolution（20ml/100cm²膜）中孵育20min
h.在Washingbuffer（100ml/100cm²膜）洗2×15min.
i.在Dectionbuffer（20ml/100cm²膜）中平衡3min.
l.将印有核酸的尼龙膜那面朝上，加0.5-1mlCDP-Star均匀覆盖膜，孵育5min.
m.用滤纸将多余液体吸掉，用单层保鲜膜包裹，放在压片夹中。
注意不要让膜干燥，否则会引起高背景。
n.在暗室中取出柯达胶片压片，取出胶片在显影液中显影20s-1min，蒸馏水中洗膜5-8次；定影液中定影1min，观察结果，扫描图片。
【附注】
DIG检测试剂盒疑难问题及解决方案
一、灵敏度低或信号弱的问题及解决方案？
1.探针标记效率低：
2.膜的问题：
使用阳性尼龙膜
3.杂交：
增加标记探针的浓度，或减少洗涤时的严谨性
4.曝光时间：
增加曝光时间；使用高灵敏度的专用化学发光的Lumi-Film胶片，其他像KodakXAR也可。
二、高背景解决方案?
1.探针标记：
纯化的DNA或RNA在标记前用乙醇沉淀；确认探针对靶序列是特异性并跟其他载体无同源性；
2.膜：
推荐使用罗氏或经过验证的膜（pall）、Ambion膜
3.杂交：
使用CDP-Star发光底物，最好将DIG探针浓度稀释到（RNA20-50ng/ml）
另外在杂交过程中不要让膜干燥
4.检测过程：
将抗DIG-AP的酶的浓度到由原来的1:
20,000减少到1:
50,000，也不会减少酶检测的灵敏度。
增加洗脱和封闭的溶液的量和次数；膜上出现斑点可能是由于酶在膜上的凝集，需要将膜短暂离心后使用。
5.曝光时间：
缩短曝光时间，通常为15-60s。
6.预杂交时间太短：
低于30min
7.暴露时间过长：
化学显色法最佳的显色时间通常为1-30min.可以通过在不同时间、次数来得到最好的信噪比
8.探针中含有游离的核苷酸未能去除：
未参入的游离核苷酸，可导致高背景
9.杂交缓冲液没有完全溶解：
应将杂交液在68℃预热15-30min,使之完全溶解。
10.其他：
1）在膜上留有凝胶或丙烯酰胺残留物，可将膜在转移缓冲液中浸泡一下，或在洗脱阶段将时间由5min延长到15min。
2）膜未能充分接触洗脱或封闭等试剂；推荐使用扁平的托盘如装Tip头的盖子，strep-AP孵育后洗脱时间延长到15min。
3）直接将strep-AP加到膜上：
可导致高浓度的酶沉积到膜上产生高背景。
通过将strep-AP与封闭剂充分混匀后再加入可避免高背景。
推荐使用带刻度的离心管可上下颠倒用于稀释。
4）膜上过量的CDP-Star未吸干净：
将膜从托盘取出，置于滤纸上，用滤纸将膜印干去除多余的CDP-Star。
5）塑料薄膜出现折叠或凹痕:
最好使用单层薄膜。
6）滤纸应该充分浸泡使电流充分通过
三．DIG-11-UTP（25μl,10mM）;。
概述：
分子量为1106.7，分子式为
结构:
C43H61N4O22P3Li4
DIG-11-UTP是T7，SP6和T3聚合酶的作用底物，并能在体外转录反应中以35:
65比率来取代UTP。
线性DNA模板在体外以ATP,GTP,CTP,UTP和DIG-11-UTP为原料通过T7，SP6和T3聚合酶转录出对应的DIG标记的RNA探针。
存储:
-20℃可保存。
四、CDP-Star
存储：
2-8℃
CDP-Star是一种碱性磷酸酶的化学发光底物，通过产生可见光达到灵敏、快速检测生物分子，使X光片曝光显影。
CDP-Star可用于在液相或固相中的碱性磷酸酶。
特点：
灵敏度高（3μgRNA就可检测）比CSPD高10倍、快速（5min即可显影）。
五、杂交温度的优化
1.RAN探针：
在高温68℃，高AT含量或与靶基因出现多个误配的探针，可能杂交失败如果在此温度信号较弱，尽量减少杂交和洗脱温度至60℃.
2.DNA探针：
如果在42度有交叉反应（非特异性带），则增加温度到45-48℃.
3.寡核苷酸探针;有较低的Tm值，如果在37℃杂交信号弱或无信号,则用等量的2.5×SSC/7%SDS稀释杂交液,再回复到37-42℃杂交和洗脱。
六RNA沉淀
1.加0.1V的乙酸铵（终浓度为0.5M），涡旋混匀。
对于低浓度的样品，可加沉淀剂糖原（10-20μg/mL）或线性的聚丙烯酰胺（10-20μg/mL），要在乙醇添加之前加入。
2.加2.5V体积的无水乙醇，再次混匀，-20℃放置至少30min。
3.4℃×12000rpm15min，做好标记，沉淀RNA，在背向轴中心的离心管的后侧的底部形成可见的胶样沉淀。
RNA沉淀不会很紧的粘附在管底，因此要小心吸取上清液（不要倾注法），再见在室温短暂涡旋几秒以去除残余的乙醇液体，这种方式处理不需要在空气中干燥。
RNA储存：
1）长期储存：
乙醇沉淀后置于-80℃
2）甲酰胺保存：
等体积加
3）0.1mMEDTA,TE，溶液中二价阳离子能催化RNA链的裂解，EDTA,TE是螯合剂，能结合溶液中阳离子。
我们发现在含0.1mMEDTA的DEPC水保存的RNA在-80℃可保存2年而完整。
所用试剂的配制：
1.5M乙酸铵（分子量77）：
用60ml水溶解38.5g乙酸铵，用水定容至100ml。
过滤除菌后室温保存，不能高压灭菌。
2.0.2MEDTA（pH8.0）（分子量292.25）取2.92g溶于40mlDEPC处理水，用NaOH调pH8.0，高压灭菌。
3.低严谨洗膜液：
2×SSC，0.1%SDS
4.高严谨洗膜液：
0.1×SSC，0.1%SDS
5.20×SSC（NaCl3.0M,柠檬酸钠0.3M）
NaCl:
87.65g
柠檬酸三钠.2H2O（分子量为294.1）:
44.1g
用350mlDEPC水溶解以上成分，用几滴14NHCL调至7.0，用水定容到500ml并高压灭菌。
6.40%丙烯酰胺液（19:
1）:
配200ml，取76g丙烯酰胺，加双叉丙烯酰胺4g，用温热的去离子水溶解，用灭菌去离子水定容到200ml。
（棕色瓶避光保存4-8℃）
7.10×TBE（500ml）
Tris（分子量121.14,890mM）.54g
硼酸（分子量61.83,890mM）.27.5g
EDTA（分子量292.25,20mMpH8.0）2.92g
或0.5MEDTA溶液（pH8.0）40ml
向烧杯中加无菌去离子水400ml溶解以上成分，调pH8.0定容到500ml。
用时稀释10倍使用。
高压，室温保存
8.3M醋酸钠（分子量82.03，pH5.2）
用140mlDEPC处理的水溶解49.2g无水醋酸钠，用冰醋酸调pH5.2，用DEPC处理的水定容至200ml，再高压灭菌。
9.75%乙醇（DEPC处理的水配制）：
配制200ml。
方法：
取无水乙醇150ml,加入用DEPC处理的水50ml，即得75%乙醇（DEPC处理）
10.10%SDS.称取10gSDS放入100ml去离子水中溶解，过滤除菌，室温保存。
11.DEPC水：
1L水中加入1µlDEPC,室温震荡孵育至少30min,高压。
室温保存。
DEPC2-8°C保存。
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