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微生物

湖南杏林春药业有限公司GMP文件

微生物限度检查法操作规程

颁发部门：

GMP办公室

编号：

SOP/QC-031-00

页数：

第1页共15页

编制人

审核人

批准人

分发部门：

质管部

年月日

年月日

年月日

生效日期：

年月日

引用标准：

《中国药典2010年版一部》附录P107

1、目的

建立微生物限度检查法操作规程。

2、范围

微生物限度检查

3、职责

检验员。

4、内容

微生物限度检查法系检查非规定灭菌制剂及其原料、辅料受微生物污染程度的方法。

检查项目包括细菌数、霉菌素、酵母菌数及控制菌检查。

微生物限度检查应在环境洁净度10000级下的局部洁净度100级的单向流空气区域内进行。

检验全过程必须严格遵守无菌操作，防止再污染。

防止污染的措施不得影响供试品中微生物的检出。

单向流空气区域、工作台面及环境应定期按《医药工业洁净室（区）悬浮粒子、浮游菌和沉降菌的测试方法》的现行国家标准进行洁净度验证。

供试品检查时，如果使用了表面活性剂、中和剂或灭活剂，应证明其有效性及对微生物无毒性。

除另有规定外，本检查法中细菌及控制菌培养温度为30～35℃，霉菌、酵母菌培养温度为23～28℃。

检验结果以1g、1ml、10g、10ml或10cm2为单位报告。

特殊品种可以最小包装单位报告。

4.1检验量

检验量即一次试验所用的供试品（g、ml或cm2）。

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除另有规定外，一般供试品的检验量为10g或10ml；膜剂为100cm2；贵重药品、微量包装药品的检验量可以酌减。

要求检查沙门菌的供试品，其检验应增加20g或20ml（其中10g或10ml用于阳性对照）。

检验时，应从2个以上最小包装单位中抽取供试品，膜剂还不得少于4片。

一般应随机抽取不少于检验用量（两个以上最小包装单位）的3倍量供试品。

4.2供试液的制备

根据供试品的理化特性与生物学特性，采取适宜的方法制备供试液。

供试液制备若需加温时，应均匀加热，且温度不应超过45℃。

供试液从制备至加入检验用培养基，不得超过1小时。

除另有规定外，常用的供试液制备方法如下。

4.2.1液体供试品

取供试品10ml，加pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100ml，混匀，作为1：

10的供试液。

油剂可加入适量的无菌聚山梨酯80使供试品分散均匀。

水溶性液体制剂也可用混合的供试品原液作为供试液。

4.2.2固体、半固体或黏稠性供试品

取供试品10g，加pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100ml，用匀浆仪或其他适宜的方法，混匀，作为1：

10的供试液。

必要时加适量的无菌聚山梨酯80，并置水浴中适当加温使供试品分散均匀。

4.2.3需用特殊供试液制备方法的供试品

4.2.3.1非水溶性供试品

方法1取供试品5g（或5ml）,加入含溶化的（温度不超过45℃）5g司盘80、3g单硬脂酸甘油酯、10g聚山梨酯80无菌混合物的烧杯中，用无菌玻棒搅拌成团后，慢慢加入45℃左右的pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100ml，边加边搅拌，使供试品充分乳化，作为1：

20的供试液。

方法2取供试品10g，加至含20ml无菌十四烷酸异丙酯（制备方法：

采用薄膜过滤法过滤除菌。

选用孔径为0.22μm的脂溶性滤膜，在140℃干热灭菌2小时）和无菌玻璃珠的适宜容器中，必要时可增加十四烷酸异丙酯的用量，充分振摇，使供试品溶解。

然后加入45℃的pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液100ml，振摇5～10分钟，萃取，静置使油水明显分层，取其水层作为1：

10的供试液。

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4.2.3.2膜剂供试品

取供试品100cm2，剪碎，加pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液100ml（必要时可增加稀释液），浸泡，振摇，作为1：

10的供试液。

4.2.3.3肠溶及结肠溶制剂供试品

取供试品10g，加pH6.8无菌磷酸盐缓冲液（用于肠溶制剂）或pH7.6无菌磷酸盐缓冲液（用于结肠溶制剂）至100ml，置45℃水浴中，振摇，使溶解，作为1：

10的供试液。

4.2.3.4气雾剂、喷雾剂供试品

取规定量供试品，置冰冻室冷冻约1小时，取出，迅速消毒供试品开启部位，用无菌钢锥在该部位钻一小孔，放至室温，并轻轻转动容器，使抛射剂缓缓全部释出。

用无菌注射器吸出全部药液，加至适量的pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液（若含非水溶性成分，加适量的无菌聚山梨酯80）中，混匀，取相当于10g或10ml的供试品，再稀释成1：

10的供试液。

4.2.3.5贴膏剂供试品

取规定量供试品，去掉贴膏剂的保护层，放置在无菌玻璃或塑料片上，粘贴面朝上。

用适宜的无菌多空材料（如无菌纱布）覆盖贴剂的粘贴面以避免粘贴在一起。

然后将其置于适宜体积并含有表面活性剂（如聚山梨酯80或卵磷脂）的稀释剂中，用力振摇至少30分钟，制成供试液。

贴膏剂也可采用其它适宜的方法制备供试液。

4.2.3.6具抑菌活性的供试品

当供试品有抑菌活性时，采用下列方法进行处理，以消除供试液的抑菌活性，再依法检查。

常用的方法如下：

4.2.3.6.1培养基稀释法取规定量的供试液，至较大量的培养基中，使单位体积内的供试品含量减少，至不含抑菌作用。

测定细菌、霉菌及酵母菌的菌数时，取同稀释级的供试液2ml，每1ml供试液可等量分注多个平皿，倾注琼脂培养基，混匀，凝固，培养，计数。

每1ml供试液所注的平皿中生长的菌数之和即为1ml的菌落数，计算每1ml

供试液的平均菌落数，按平皿法计数规则报告菌数；控制菌检查时，可加大增菌培养基的用量。

4.2.3.6.2离心沉淀集菌法取一定量的供试液，以500转/分钟离心3分钟，取全部上清液混合，用于细菌检查。

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4.2.3.6.3薄膜过滤法见细菌、霉菌及酵母菌计数项下的“薄膜过滤法”。

4.2.3.6.4中和法凡含汞、砷或防腐剂等具有抑菌作用的供试品，可用适宜的中和剂或灭活剂消除其抑菌成分。

中和剂或灭活剂可加在所用的稀释液或培养基中。

4.3细菌、霉菌及酵母计数

4.3.1计数培养基的适用性检查

细菌、霉菌及酵母菌计数用的培养基应进行培养基的适用性检查，成品培养基、由脱水培养基或按处方配制的培养基均应检查。

4.3.1.1菌种试验用菌株的传代次数不得超过5代（从菌种保存中心获得的冷冻干燥菌种为第0代），并采用适宜的菌种保藏技术，以保证试验菌株的生物学特性。

大肠埃希菌（Escherichiacoli）［CMCC（B）44102］

金黄色葡萄球菌（Staphylococcusaureus）［CMCC（B）26003］

枯草芽孢杆菌（Bacillussubtilis）［CMCC（B）63501］

白色念珠菌（Candidaalbicans）[CMCC（F）98001]　

黑曲霉（Aspergillusniger）　[CMCC（F）98003]　

4.3.1.2菌液制备接种大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌的新鲜培养物至营养肉汤培养基中或营养琼脂培养基中上，培养18~24小时；接种白色念珠菌的新鲜培养物至改良马丁培养基中或改良马丁琼脂培养基上，培养24~48小时。

上述培养物用0.9%无菌氯化钠溶液制成每1ml含菌数为50~100cfu的菌悬液。

接种黑曲霉的新鲜培养物至改良马丁琼脂斜面培养基上，培养5~7天，加入3~5ml含0.05%（ml/ml）聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液，将孢子洗脱。

然后，采用适宜的方法吸出孢子悬液至无菌试管内，用含0.05%（ml/ml）聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液0.9%无菌氯化钠溶液制成每1ml含孢子数50~100cfu的孢子悬液。

菌液制备后若在室温下放置，应在2小时内使用；若保存在2～8℃，可在24小时内使用。

黑曲霉孢子悬液可保存在2～8℃，在验证过的贮存期内使用。

4.3.1.3适用性检查取大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌各50～100cfu，分别注入无菌平皿中，立即倾注营养琼脂培养基，每株试验菌平行制备2个平皿，混匀，凝固，置30～35℃培养48小时，计数；取白色念珠菌、黑曲霉各50～100cfu，分别注入无菌平皿中，立即倾注玫瑰红钠琼脂培养基，每株试验菌平行制备2个平皿，混匀，凝固，置23～28℃培养72小时，计数；取白色念珠菌50～100cfu，注入无菌

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平皿中，立即倾注酵母浸出粉胨葡萄糖琼脂培养基，平行制备2个平皿，混匀，凝固，置23～28℃培养72小时，计数。

同时，用相应的对照培养基替代被检培养基进行上述试验。

4.3.1.4结果判定若被检培养基上的菌落平均数不小于对照培养基上的菌落平均数的70%，且菌落形态大小与对照培养基上的菌落一致，判该培养基的适用性检查符合规定。

4.3.2计数方法的验证当建立产品的微生物限度检查法时，应进行细菌、霉菌及酵母菌计数方法的验证，以确认所采用的的方法适合于该产品的细菌、霉菌及酵母菌数的测定，若产品的组分或原检验条件发生改变可能影响检验结果时，计数方法应重新验证。

验证时，按供试液的制备和细菌、霉菌及酵母菌计数所规定的的方法及下列要求进行。

对各试验菌的回收率应逐一进行验证。

4.3.2.1菌种及菌液制备同计数培养基的适用性检查。

4.3.2.2验证方法验证试验至少应进行3次独立的平行试验，并分别计算各试验菌每次试验的回收率。

试验组平皿法计数时，取试验可能用的最低稀释级供试液1ml和50～100cfu试验菌，分别注入平皿中，立即倾注琼脂培养基，每株试验菌平行制备2个平皿，按平皿法测定其菌数。

薄膜过滤法计数时，取规定量试验可能用的最低稀释级供试液，过滤，冲洗，在最后一次的冲洗液中加入50～100cfu试验菌，过虑，按薄膜过滤法测定其菌数。

菌液组测定所加的试验菌数。

供试品对照组取规定量供试液，按菌落计数方法测定供试品本底菌数。

稀释剂对照组若供试液制备需要分散、乳化、中和、离心或薄膜过滤等特殊处理时，应增加稀释剂对照组，以考察供试液制备过程中微生物受影响的程度。

试验时，可用相应的稀释液替代供试品，加入试验菌，使最终菌浓度为每1ml供试液含50～100cfu，按试验组的供试液制备方法和菌落计数方法测定其菌数。

4.3.2.3结果判断在3次独立的平行试验中，稀释剂对照组的菌回收率（稀释剂对照组的平均菌落数占菌液组的平均菌落数的百分率）应均不低于70%。

若试验组的菌回收率（试验组的平均菌落数减去供试品对照组的平均菌落数的值占菌液组的平均菌落数的

SOP/QC-031-00　第6页共15页百分率）均不低于70%，照该供试液制备方法和计数法测定供试品的细菌、霉菌及酵母

菌数；若任一次试验中试验组的菌回收率低于70%，应采用培养基稀释法、离心沉淀集

菌法、薄膜过滤法、中和法（常见干扰物的中和剂或灭活方法见表1）等方法或联合使用这些方法消除供试品的抑菌活性，并重新进行方法验证。

表1常见干扰物的中和剂或灭活方法

干扰物

可选用的中和剂或灭活方法

戊二醛

酚类、乙醇、吸附物

醛类

季铵类化合物（QACs）、对羟基苯甲酸酯

汞类制剂

双胍类化合物

碘酒、洗必泰类

卤化物

乙二胺四乙酸（EDTA）

磺胺类

β-内酰胺类抗生素

亚硫酸氢钠

稀释法

稀释法、甘氨酸、硫代硫酸盐

卵磷脂、聚山梨酯

亚硫酸氢钠、巯基乙酸盐、硫代硫酸盐

卵磷脂

聚山梨酯

硫代硫酸盐

镁或钙离子

对氨基苯甲酸

β-内酰胺酶

若没有适宜的方法消除供试品的抑菌活性，那么验证试验中微生物回收的失败可看成是因供试品的抑菌活性引起的，同时表明该供试品不能被试验菌污染。

但是，供试品也可能仅对试验用菌株具有抑制作用，而对其他菌株没有抑制作用。

因此，根据供试品须符合的微生物限度标准和菌数报告规则，在不影响检验结果判断的前提下，应采用能使微生物生长的更高稀释级的供试液进行方法验证试验。

若验证试验符合要求，应以该稀释级供试液作为最低稀释级的供试液进行供试品检验。

计数方法验证时，采用上述方法若还存在一株或多株试验菌的回收率达不到要求，那么选择回收率最接近要求的方法和试验条件进行供试品的检验。

验证试验也可与供试品的细菌、霉菌及酵母菌计数同时进行。

4.3.3供试品检查

计数方法包括平皿法和薄膜过滤法。

检查时，按已验证的计数方法进行供试品的

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细菌、霉菌及酵母菌菌数的测定。

按计数方法的验证试验确认的程序进行供试液制备。

用稀释液稀释成1：

10、1：

102、1：

103等稀释级的供试液。

4.3.3.1平皿法

根据菌数报告规则取相应稀释级的供试液1ml，置直径90mm的无菌平皿中注入15～20ml温度不超过45℃的溶化的营养琼脂培养基或玫瑰红钠琼脂培养基或酵母浸出粉胨葡萄琼脂培养基，混匀，凝固，倒置培养。

每稀释级每种培养基至少制备2个平板。

4.3.3.1.1阴性对照试验取试验用的稀释液1ml，置无菌平皿中，注入培养基，凝固，倒置培养。

每种计数的培养基各制备2个平板，均不得有菌生长。

4.3.3.1.2培养和计数除另有规定外，细菌培养3天，霉菌、酵母菌培养5天，逐日观察菌落生长情况，点计菌落数，必要时可适当延长培养时间至7天进行菌落计数并报告。

菌落蔓延生长成片的平板不宜计数。

点计菌落数后，计算各稀释级供试液的平均菌落数，按菌数报告规则报告菌数。

若同稀释级两个平板的菌落平均数不小于15，则两个平板的菌落数不能相差1倍或以上。

一般营养琼脂培养基用于细菌计数；玫瑰红钠琼脂培养基用于霉菌及酵母菌计数；酵母浸出粉胨葡萄糖琼脂培养基用于酵母菌计数。

在特殊情况下，若营养琼脂培养基上长有霉菌和酵母菌、玫瑰红钠琼脂培养基上长有细菌，则应分别点计霉菌和酵母菌、细菌菌落数。

然后将营养琼脂培养基上的霉菌和酵母菌数或玫瑰红钠琼脂培养基上的细菌数，与玫瑰红钠琼脂培养基中的霉菌和酵母菌数或营养琼脂培养基中的细菌数进行比较，以菌落数较高的培养基中的菌数为计数结果。

含蜂蜜、王浆的液体制剂，用玫瑰红钠琼脂培养基测定霉菌数，用酵母浸出粉胨葡萄糖琼脂培养基测定酵母菌数，合并计数。

4.3.3.1.3菌数报告规则细菌、酵母菌宜选取平均菌落数小于300cfu、霉菌宜选取平均菌落数小于100cfu的稀释级，作为菌数报告（取两位有效数字）的依据，以最高的平均菌落数乘以稀释倍数的值报告1g、1ml、或10cm2供试品中所含的菌数。

如各稀释级的平板均无菌落生长，或仅最低稀释级的平板有菌落生长，但平均菌落

数小于1小时，以＜1乘以最低稀释倍数的值报告菌数。

4.3.3.2薄膜过滤法

采用薄膜过滤法，滤膜孔径不大于0.45um，直径一般为50mm。

若采用其他直径的

SOP/QC-031-00　第8页共15页滤膜，冲洗量应进行相应的调整。

选择滤膜材质时应保证供试品及其溶剂不影响微生物的充分被截留。

滤器及滤膜使用前应采用适宜的方法灭菌。

使用时，应保证滤膜在过滤前后的完整性。

水溶性供试液过滤前先将少量的冲洗液过滤以润湿滤膜。

油类供试品，其滤膜和过滤器在使用前应充分干燥。

为发挥滤膜的最大过滤效率，应注意保持供试品溶液及冲洗液覆盖整个滤膜表面。

供试液经薄膜过滤后，若需要用冲洗液冲洗滤膜，每张滤膜每次冲洗量为100ml。

总冲洗量不得过1000ml。

以避免滤膜上的微生物受损伤。

取相当于每张滤膜含1g、1ml或10cm2供试品的供试液，加至适量的稀释剂中，混匀，过滤。

若供试品每1g、1ml或10cm2所含的菌数较多时，可取适宜稀释级的供试液1ml进行试验。

用pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液或其他适宜的冲洗液冲洗滤膜，冲洗方法和冲洗量同“计数方法的验证”。

冲洗后取出滤膜，菌面朝上贴于营养琼脂培养基或玫瑰红钠培养基或酵母浸出粉胨葡萄糖琼脂培养基平板上培养。

每种培养基至少制备一张滤膜。

4.3.3.2.1阴性对照试验取试验用的稀释液1ml，照上述薄膜过滤法操作，作为阴性对照。

阴性对照不得有菌生长。

4.3.3.2.2培养和计数培养条件和计数方法同平皿法，每片滤膜上的菌落数应不超过100cfu。

4.3.3.2.3菌数报告规则以相当于1g、1ml或10cm2供试品的菌落数报告菌数；若滤膜上无菌生长，以＜1报告菌数（每张滤膜过滤1g、1ml或10cm2供试品），或＜1乘以稀释倍数的值报告菌数。

4.4控制菌检查

4.4.1控制菌检查用培养基的适用性检查

控制菌检查用的培养基应进行培养基的适用性检查，成品培养基、由脱水培养基或按处方配制的培养基均应检查。

4.4.1.1菌种对试验菌种的要求同计数培养基的适用性检查。

大肠埃希菌（Escherichiacoli）［CMCC（B）44102］

金黄色葡萄球菌（Staphylococcusaureus）［CMCC（B）26003］

乙型副伤寒沙门菌（SalmonellaparatyphiB）［CMCC（B）50094］

铜绿假单胞菌（Pseudomonasaeruginosa）［CMCC（B）10104］

生孢梭菌（Clostridiumsporogenes）[CMCC（B）64941]

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白色念珠菌（Candidaalbicans）[CMCC（F）98001]

4.4.1.2菌液制备接种大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、乙型副伤寒沙门菌、铜绿假单胞菌的新鲜培养物至营养肉汤培养基中或营养琼脂培养基上，生孢梭菌的新鲜培养物至硫乙醇酸盐流体培养基中，培养18～24小时；接种白色念珠菌的新鲜培养物至改良马丁培养基中或改良马丁琼脂培养基上，培养24～48小时。

用0.9%无菌氯化钠溶液制成每1ml含菌数为10~100cfu的菌悬液。

菌悬液在室温下放置应在2小时内使用，若保存在2～8℃可在24小时内使用。

4.4.1.3适用性检查控制菌检查用培养基的适用性检查项目包括促生长能力、抑制能力及指示能力的检查。

各培养基的检测项目及所用菌株见表2

表2控制菌检查用培养基的促生长能力、抑制能力及指示能力检查

控制菌检查

培养基

特性

实验菌株

铜绿假单胞菌

胆盐乳糖培养基

溴化十六烷基三甲铵琼脂培养基

绿脓菌素测定培养基

促生长能力

抑制能力

促生长能力

抑制能力

促生长能力+指示能力

铜绿假单胞菌

金黄色葡萄球菌

铜绿假单胞菌

大肠埃希菌

铜绿假单胞菌

金黄色葡萄球菌

亚碲酸盐肉汤培养基

卵黄氯化钠琼脂培养基或甘露醇氯化钠琼脂培养基

促生长能力

抑制能力

促生长能力+指示能力

抑制能力

金黄色葡萄球菌

大肠埃希菌

金黄色葡萄球菌

大肠埃希菌

4.4.1.3.1液体培养基促生长能力检查分别接种不大于100cfu的试验菌（表2）于被检培养基和对照培养基中，在相应控制菌检查规定的培养温度及最短培养时间下培养，与对照培养基管比较，被检培养基管试验菌应生长良好。

4.4.1.3.2固体培养基促生长能力检查取试验菌各0.1ml（含菌数50～100cfu）分别涂布于被检培养基和对照培养基平板上，在相应控制菌检查规定的培养温度及最短

培养时间下培养。

被检培养基与对照培养基上生长的菌落大小、形态特征应一致。

4.4.1.3.3培养基抑制能力检查接种不少于100cfu的试验菌（表2）于被检培

养基中，在相应控制菌检查规定的培养温度及最长培养时间下培养，试验菌应不得生长。

4.4.1.3.4固体培养基指示能力检查取试验菌各0.1ml（含菌数不大于100cfu）

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（表2）分别涂布于被检培养基和对照培养基平板上，在相应控制菌检查规定的培养温度及最短培养时间下培养。

被检培养基上试验菌生长的菌落大小、形态特征、指示剂反应情况等与对照培养基一致。

4.4.1.3.5液体培养基指示能力检查分别接种不大于100cfu的试验菌（表2）于被检培养基和对照培养基中，在相应控制菌检查规定的培养温度及最短培养时间下培养，与对照培养基管比较，被检培养基管试验菌生长情况、指示剂反应等应与对照培养基一致。

4.4.2控制菌检查方法的验证

当建立产品的微生物限度检查法时，应进行控制菌检查方法的验证，以确认所采用的方法适合于该产品的控制菌检查。

若产品的组分或原检验条件发生改变可能影响检验结果时，检查方法应重新验证。

验证时，依各品种项下微生物限度标准中规定检查的控制菌选择相应验证的菌株。

验证试验按供试液的制备和控制菌检查法的规定及下列要求进行。

4.4.2.1菌种及菌液制备同控制菌检查用培养基的适用性检查。

验证方法取规定量供试液及10~100cfu试验菌加入增菌培养基中，依相应控制菌检查法进行检查。

当采用薄膜过滤法时，取规定量供试液，过滤，冲洗，试验菌应加在最后一次冲洗液中，过滤后，注入增菌培养基或取出滤膜接入增菌培养基中。

4.4.2.2结果判断若上述试验检出试验菌，按此供试液制备法和控制菌检查法进行供试品的该控制菌检查；若未检查试验菌，应采用培养基稀释法、离心沉淀法、薄膜过滤法、中和法等方法或联合使用这些方法消除供试品的抑菌活性，并重新进行方法验证。

验证试验也可与供试品的控制菌检查同时进行。

4.4.3供试品检查

供试品的控制菌检查应按已验证的方法进行。

4.4.3.1阳性对照试验阳性对照试验方法同供试品的控制菌检查，对照菌的加菌

量为10~100cfu。

阳性对照试验应检出相应的控制菌。

4.4.3.2阴性对照试验取稀释液10ml照相应控制菌检查法检查，作为阴性对照。

阴性对照应无菌生长。

4.4.3.2.1铜绿假单胞菌（Pseudomonasaeruginosa）

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取供试液10ml（相当于供试品1g、1ml、10cm2），直接或处理后接种至适量（不少于100ml）的胆盐乳糖培养基中，培养18~24小时。

取上述培养物，划线接种于溴化十六烷基三甲铵琼脂培养基的平板上，培养18~24小时。

铜绿假单胞菌典型菌落呈扁平、无定形、周边扩散、表面湿润，灰白色，周围时有蓝绿色素扩散。

如平板上无菌落生长或生长的菌落与上述菌落形态特征不符，判供试品未检出铜绿假单胞菌。

如平板上的菌落与上述菌落形态特征相符或疑似，应挑选2~3个菌落，分别接种于营养琼脂培养基斜面上，培养18~24小时。

取斜面培养物进行革兰染色、镜检及氧化酶试验。

氧化酶试验取洁净滤纸片置于平皿内，用无菌玻棒取斜面培养物涂于滤纸片上，滴加新配置的1%二盐酸二甲基对苯二胺试液，在30秒内培养物呈粉红色并逐渐变为紫红色为氧化酶试验阳性，否则为阴性。

若斜面培养物为非革兰阴性无芽孢杆菌或氧化酶试验阴性，均判供试品未检出铜绿假单胞菌。

否则，应进行绿脓菌素试验。

绿脓菌素（Pyocyanin）试验取斜面培养物接种于PDP琼脂培养基斜面上，培养24小时，加三氯甲烷3~5ml至培养管中，搅碎培养基并充分振摇。

静置片刻，将三氯甲烷相移至另一试管中，加入1mol/l盐酸试液约1ml,振摇后，静置片刻，观察。

若盐酸容易呈粉红色，为绿脓菌素试验阳性，否则为阴性。

同时用未接种的PDP琼脂培养基斜面同法作阴性对照，阴性对照试验应呈阴性。

若上述疑似菌为革兰阴性杆菌、氧化酶试验阳性及绿脓菌素试验阳性，判供试品检出铜绿假单胞菌。

若上述疑似菌为革兰阴性杆菌、氧化酶试验阳性及绿脓菌素试验阴性，应继续进行适宜的生化试验，确