斜带石斑鱼肠道乳酸菌部分生物学特性研究.docx
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斜带石斑鱼肠道乳酸菌部分生物学特性研究
斜带石斑鱼肠道乳酸菌部分生物学特性研究
摘要:
体外检测了3株斜带石斑鱼（Epinepheluscoioids）肠道乳酸菌的产乳酸能力、抑菌活性、对高温、低pH值、高胆盐、人工胃液及人工肠液的耐受能力等，为海水鱼益生菌的开发提供理论依据．16SrＲNA基因测序分析表明，LS61、LS64、LS77菌株分别为植物乳杆菌（Lactobacillusplantarum）、肠膜明串珠菌（Leuconostocmesenteroides）、糊精乳杆菌（Lactobacillusdextrinicus）．3株菌摇瓶培养40h后发酵液中乳酸含量分别达到55.6、51.6、58.3mmol/dm3且发酵上清液对致病菌有较强的拮抗活性．耐受性实验结果表明，pH值为3.5、4.5的MＲS培养基对这3株菌存活影响较小;pH值为2.5的MＲS培养基对LS64、LS77的影响较大，而对LS61菌株的存活基本没有影响．这3株菌对不同pH值的人工胃液的耐受性与之相似，说明LS61菌株的pH值耐受性最好，其次是LS64菌株，LS77菌株最差．3株菌对高胆盐也有不同的耐受性，含1‰和2‰胆盐的MＲS培养基对3株菌的影响较小，而在3‰的胆盐处理4.5h后，LS64菌株的存活率仍保持在30.7%，LS61菌株的存活率为2．0%左右，LS77菌株的存活率接近1．0%．在4‰的胆盐含量下，LS61、LS64菌株的存活率仍高于1‰．同样，不同胆盐含量的人工肠液对这3株菌的影响与之相似．乳酸菌LS61、LS64菌株具有较强的产乳酸和抑菌能力，具有一定的pH值耐受性和较高的胆盐耐受性，可考虑作为潜在的益生菌株应用于水产健康养殖．
关键词:
海洋生物学;斜带石斑鱼;乳酸菌;抑菌活性;pH值;胆盐;益生菌
随着石斑鱼养殖的兴起和高速发展，在带来巨
大经济效益的同时也出现了一些问题．石斑鱼细菌
性疾病和寄生虫病害严重，抗生素等药物的频繁使
用导致致病菌耐药性的增强，解决这些问题就需要
探寻一种绿色的养殖模式，需要一种高效生态的方
法来控制细菌性病害．因此，许多科学家都期望利用
微生物之间的拮抗作用预防和治疗石斑鱼细菌性疾
病
［1-3］
．
乳酸菌作为益生菌已被广泛应用于人体的保健
医疗、健康和食品等多个方向．如Youn等（2012）用
流感病毒感染BALB/c小白鼠，发现活的乳酸菌对
增强免疫有显著效果，提高了小白鼠的存活率
［4］
．
Matsumoto等（2006）研究证实含乳酸菌的牛奶对
稳定人体肠道环境和微生物菌群具有积极作
用
［5］
．Burns等（2012）从奶酪中分离得到2株乳酸
菌，将其用于发酵奶酪，与不加乳酸菌的对照组进
行氨基酸含量、食品风味等进行比较，发现添加乳
酸菌发酵的奶酪中氨基酸含量和风味明显好于对
照组
［6］
．乳酸菌在畜禽养殖上的应用也取得了较
大进展，如Zhang等（2012）发现罗伊乳酸杆菌
（Lactobacillusreuteri）能提高患白痢雏鸡的存活
率
［7］
．此外，乳酸菌在水产养殖上的应用也取得了
一定成果，如刘倩等（2006）阐述了乳酸菌对提高
鱼类抗病力、生长速度和存活率的重要作用
［8］
;
Lara-Flores等（2003）发现将粪链球菌（Streptococ-
cusfaecium）和嗜酸乳杆菌（Lactobacillusacidophi-
lus）添加到饲料中投喂可以促进尼罗罗非鱼（Ore-
ochromisniloticus）鱼苗的生长，提高饲料利用率
等
［9］
;Suzer等（2008）研究发现，乳杆菌投喂处理
等显著提高金头雕（Sparusaurata）幼体的存活率、4期陈艳武，等:
斜带石斑鱼肠道乳酸菌部分生物学特性研究·531·
特定生长率和肠道酶活
［10］
．
尽管乳酸菌在水产养殖上应用的报道不少，但
是，由于缺乏真正适合水产动物的益生菌株，目前许
多水产上使用的益生菌分离自环境或者陆生动物，
这些益生菌往往因为无法在水产动物消化道存活而
不能发挥益生效果，因而限制了它们在水产养殖上
的应用．理想的益生菌应该来自动物自身胃肠
道
［11-13］
．此外，所选用的益生菌还必须能够耐胃肠
内强酸、高胆盐的环境，才能够在消化道内大量存
活、定植，发挥益生作用
［14-15］
．
本文通过分离斜带石斑鱼（Epinepheluscoioids）
肠道的乳酸菌，对其部分生物学特性，包括产乳酸的
能力、抑制病原指示菌的能力，以及耐受低pH值和
高浓度胆盐的能力等进行了研究，初步评价乳酸菌
作为益生菌应用于石斑鱼养殖的可能性．
1材料与方法
1.1菌株的分离与鉴定
1．1.1乳酸菌的分离纯化实验所用的斜带石斑
鱼购自厦门市大学路菜市场．取健康活泼的斜带
石斑鱼4尾，用75%（V/V）酒精棉球擦拭鱼体表
面，在紫外灭菌后的超净工作台中解剖胃肠道，取
消化道内容物和消化道粘膜用无菌生理盐水制备
成匀浆液，将匀浆液10倍梯度稀释至10
－4
．取原
液和各个梯度稀释液各100mm
3
分别涂布MＲS平
板，每个梯度设3个重复，平板置于28℃恒温培养
5d．挑取各种类型单菌落接种至MＲS平板上，多
次划线传代，直至镜检确认纯种．对单菌进行接触
酶实验，选取接触酶阴性的菌株进行16SrＲNA测
序鉴定．
1．1.2乳酸菌的鉴定利用细菌基因组DNA提取
试剂盒（上海赛百盛基因技术有限公司）提取细菌
基因组DNA．以细菌通用引物27f（5'-AGAGTT
TGATCCTGGCTCAG-3'）和1492r（5'-ACGGCT
ACCTTGTTACGACT-3'）扩增细菌16SrＲNA基因
片段．PCＲ反应条件:
94℃4min;94℃40s，55℃40s，
72℃1.5min，35个循环;72℃10min．用1.0%的琼
脂糖凝胶电泳检测16SrＲNA基因扩增产物，扩增
产物送上海英骏（Invitrogen）生物技术有限公司进
行纯化和测序，序列于GenBank网站上进行BLAST
比对分析．
1．1.3病原指示菌抑菌试验所用的指示菌哈维
氏弧菌（Vibrioharveyi）QBY3为本实验室分离自患
病斜带石斑鱼眼球部位，坎贝氏弧菌（Vibriocamp-
bellii）VH1为本实验室分离自患发光病南美白对
虾（Litopenaeusvannamei）体内
［16］
，嗜水气单胞菌
（Aeromonashydrophila）SHI为山东大学杜宗军老
师惠赠，实验证实3株菌对南美白对虾和斜带石
斑鱼均具有中等强度的致病性．指示菌均用216L
培养基培养．
1.2乳酸菌产酸能力的测定
将用液体MＲS培养基活化好的乳酸菌以5%
（V/V）的接种量接入新鲜的MＲS培养基中，摇瓶
培养，每隔4h取样测pH值和乳酸含量．乳酸含量
采用南京建成生物工程研究所的乳酸测定试剂盒
进行测定．
1.3发酵上清液抑菌实验
采用琼脂板打孔法进行抑菌实验．发酵上清
液的制备:
将用液体培养基活化好的乳酸菌以
5%的接种量接入新鲜的MＲS培养基中，摇瓶培
养48h，4℃条件下6300r/min离心20min，取
上清用0.22μm滤器过滤后进行抑菌试验．分别
用乳酸调MＲS液体培养基至与3株菌培养发酵
上清液相同的pH值，作为对照进行抑菌试验．分
别测定乳酸菌48h发酵上清液和对照液的抑菌
圈直径．
1.4温度对菌株存活的影响
在MＲS培养基中接入已活化好的菌种，初始浓
度保持在10
6
数量级，然后于28、40、60、80℃处理
0、0.5、1.5、3.0、4.5h，取样涂板计数，每个处理3
个重复．
1.5pH值对菌株存活的影响
试验设置了4个pH梯度处理:
1.5、2.5、3.5、
4.5．分别用1mol/dm
3
的HCl调节MＲS液体培养
基至上述pH值．把用液体MＲS培养基活化好的
LS61、LS64、LS77菌株以5%的接种量分别接种至
上述各pH梯度处理，28℃静置培养．在接种初始及
接种后0.5、1.5、3.0、4.5h取样涂板计数，每个处
理3个重复．
1.6胆盐含量对菌株存活的影响
试验设置了1‰、2‰、3‰、4‰（m/m）共4个
胆盐含量梯度处理组，分别用胆盐调节MＲS液体
培养基至上述浓度．把用液体MＲS培养基活化好
的LS61、LS64、LS77菌株以5%的接种量分别接种
上述各处理，28℃静置培养．在接种初始及接种后
0.5、1.5、3.0、4.5h取样涂板计数，每个处理3个
重复．
1.7菌株在人工胃液和人工肠液中的存活
人工胃液和人工肠液的配制参照文献［17］的
方法，人工胃液中含有1%（m/m）的胃蛋白酶，人工·532·应用海洋学学报32卷
肠液中含有1%（m/m）的胰蛋白酶．把用液体MＲS
培养基活化好的菌种以5%的接种量分别接种于上
述pH值为2.5、3.5、4.5的人工胃液中，28℃静置
培养，接种初始及接种后1.5h取样稀释涂板计数．
把用液体MＲS培养基活化好的菌种以5%的接种
量分别接种于上述胆盐浓度值为1‰、2‰、3‰、4‰
的人工肠液中，28℃静置培养，接种初始及接种后
3.0h取样稀释涂板计数，计算存活率．
1.8数据处理
文中pH值、乳酸含量、抑菌圈直径和活菌数量
均为3个重复的平均值，数据用统计软件SPSS19.0
单因子多重比较中的Duncan进行统计学方差分析，
以平均值±标准差表示．
2结果与分析
2.13株乳酸菌的16SrＲNA鉴定结果
如表1所示，根据菌株的16SrＲNA基因测序分
析结果，LS61鉴定为植物乳杆菌（Lactobacillusplan-
tarum），LS64鉴定为肠膜明串珠菌（Leuconostocmes-
enteroides），LS77鉴定为糊精乳杆菌（Lactobacillus
dextrinicus）．
2.2乳酸菌发酵液的抑菌活性
在培养48h的条件下，这3株乳酸菌发酵液对
病原指示菌的抑制结果如表2所示．
由表2可知，这3株乳酸菌发酵液对哈维氏弧
菌、坎贝氏弧菌和嗜水气单胞菌均有较强的抑制效
果，抑菌圈直径都在15mm以上．而对照组（用乳酸
调MＲS培养基pH值至与培养发酵液相同）对这3
指示菌也有一定的抑制作用，但明显弱于乳酸菌发
酵液对其的抑制作用，差异显著（p＜0.05）．推测这
3株乳酸菌的抑菌作用一方面是由于低pH的作用，
另一方面是由于乳酸菌本身产生除乳酸以外的其他
抑菌物质．
表13株乳酸菌菌种鉴定结果
Tab．1Identificationoflacticacidbacteria
菌株最近源模式种相似度/%NCBI登录号
LS61LactobacillusplantarumATCC14917（T）100.0KC700038
LS64LeuconostocmesenteroidesATCC8293（T）99.9KC700039
LS77LactobacillusdextrinicusJCM5887（T）99.9KC700040
表2乳酸菌发酵液对3种病原指示菌的抑制效果比较
Tab．2Inhibitioneffectsoflacticacidbacteriaagainst3pathogenicindicatorbacteria
乳酸菌
抑菌圈直径/mm
哈维氏弧菌QBY3坎贝氏弧菌VH1嗜水气单胞菌SHI
LS61菌株（pH=4.2）18.5±0.2
a
18.1±0.2
a
20.2±0.4
a
对照（pH=4.2）11.6±0.2
b
12.0±0.3
b
12.5±0.2
b
LS64菌株（pH=4.4）19.0±0.3
a
18.3±0.5
a
20.0±0.3
a
对照（pH=4.4）11.5±0.2
b
12.0±0.4
b
12.3±0.4
b
LS77菌株（pH=4.8）18.2±0.3
a
18.9±0.6
a
22.2±0.5
a
对照（pH=4.8）11.3±0.2
b
11.8±0.2
b
12.0±0.3
b
注:
用乳酸调MＲS培养基pH值至与菌株发酵液相同作为对照组．上标注明了数据的统计学方差分析结果，同列上标字母相同者表示不存在显著性差异，同列
上标字母不同者表示差异显著（p＜0.05）
2.3乳酸菌的产酸能力
对乳酸菌发酵液进行连续监测，每4h测一次
菌体浓度、pH值和乳酸含量，连续监测48h．其结果
表明:
这3株乳酸菌都在培养20h左右达到稳定期
（图1a），培养液的pH值随着培养时间的延长呈下
降趋势，LS64在20h时左右达到最低点，LS61、
LS77分别在24h和32h左右达到最低点，其中
LS61、LS64菌株发酵液的pH值最终稳定在4.5左
右（图1c）．由图1b可见，LS61、LS77菌株发酵液
的L-乳酸含量随着培养时间的延长而呈上升趋
势，分别在40h和32h左右达到最高值（分别为
55.6、61.0mmol/dm
3
），LS64菌株发酵液的D-乳
酸含量在40h时达到最高（51.6mmol/dm
3
）．通
过对图1b、c的比较可以发现，这3株乳酸菌发酵4期陈艳武，等:
斜带石斑鱼肠道乳酸菌部分生物学特性研究·533·
图1不同培养时间发酵液菌体含量、乳酸含量、
pH值的变化
Fig．1Changeinthecellconcentrationinfermentation
liquid（a）andlacticacidconcentration（b）andpH
valuesduringdifferentfermentationperiods
液pH值的降低和乳酸含量的升高表现出了较好的
协同性，可能是由于菌株产乳酸才导致发酵液pH
值的降低．
2.4温度对菌株存活的影响
LS61、LS64、LS77这3株乳酸菌发酵液经过不
同温度处理后，活菌数量的统计结果显示，3株乳酸
菌的存活量随着处理温度的升高而下降（表3）．在
28、40℃的温度下都能存活，且处理时间0.5、1.5、
3.0、4.5h对其存活无明显影响．但3株菌对较高的
温度敏感，在60、80℃条件下基本无法存活，仅有
LS77菌株在60℃下处理0.5h后仍有0.43%的存
活率．
2.5pH值对LS61、LS64、LS77菌株存活的影响
pH值对乳酸菌菌株存活的影响实验结果表
明，在pH值为1.5的培养条件下，3株乳酸菌都无
法存活．pH值为2.5时，LS61菌株的存活没有受
到显著影响，并且随着处理时间的延长，LS61菌株
能维持初始菌量并略有上升;LS64菌株在处理30
min时的存活率约为36%，但处理1.5h时的存活
率还不到5‰，随着处理时间延长至3.0h，其存活
率降至0;LS77菌株对pH值2.5的耐受性最差，
处理30min时的存活率为0．在pH值为3.5、4.5
的培养条件下，LS61、LS64菌株均能正常生长繁
殖，且菌量随处理时间延长而上升;而LS77菌株
存活量随着处理时间延长略有下降，在pH值为
3.5、4.5培养条件下处理4.5h后的存活率分别
为43%、70%．可见LS61菌株的pH耐受性最强，
其次是LS64，而LS77菌株对pH的耐受性最差
（表4）．
表3不同温度处理对乳酸菌存活量的影响
Tab．3Survivaloflacticacidbacteriaunderdifferenttemperature
菌株处理时间/h
乳酸菌存活量/cfu·cm
－3
28℃40℃60℃80℃
LS6104.5×10
6
4.5×10
6
4.5×10
6
4.5×10
6
0.55.2×10
6
4.7×10
6
00
1.59.5×10
6
6.3×10
6
00
3.02.3×10
7
9.2×10
6
00
4.55.5×10
7
2.3×10
7
00
LS6405.2×10
6
5.2×10
6
5.2×10
6
5.2×10
6
0.58.2×10
6
5.4×10
6
00
1.52.5×10
7
6.7×10
6
00
3.01.4×10
8
6.5×10
6
00
4.54.2×10
8
5.8×10
6
00·534·应用海洋学学报32卷
续表3
菌株处理时间/h
乳酸菌存活量/cfu·cm
－3
28℃40℃60℃80℃
LS7702.3×10
6
2.3×10
6
2.3×10
6
2.3×10
6
0.51.1×10
6
1.1×10
6
1.0×10
4
0
1.51.2×10
6
1.0×10
6
2.2×10
2
0
3.01.4×10
6
4.5×10
6
00
4.51.7×10
6
7.5×10
6
00
注:
0h测的菌数为初始活菌数
表4不同pH值处理下乳酸菌的存活量
Tab．4SurvivaloflacticacidbacteriaunderdifferentpHvaluestreatment
菌株处理时间/h
乳酸菌存活量/cfu·cm
－3
1.52.53.54.57（对照）
LS6104.2×10
6
4.2×10
6
4.2×10
6
4.2×10
6
4.2×10
6
0.503.7×10
6
3.2×10
6
8.2×10
6
5.2×10
6
1.504.3×10
6
3.8×10
6
9.7×10
6
9.5×10
6
3.004.5×10
6
4.7×10
6
1.1×10
7
2.3×10
7
4.505.3×10
6
8.9×10
6
2.1×10
7
5.5×10
7
LS6405.2×10
6
5.2×10
6
5.2×10
6
5.2×10
6
5.2×10
6
0.501.9×10
6
5.5×10
6
7.6×10
6
8.2×10
6
1.502.2×10
4
6.2×10
6
8.9×10
6
2.5×10
7
3.0007.8×10
6
1.1×10
7
1.4×10
8
4.5009.8×10
6
3.6×10
7
4.2×10
8
LS7702.3×10
6
2.3×10
6
2.3×10
6
2.3×10
6
2.3×10
6
0.5001.3×10
6
1.8×10
6
2.5×10
6
1.5001.2×10
6
1.7×10
6
2.4×10
6
3.0001.1×10
6
1.7×10
6
3.4×10
6
4.5001.0×10
6
1.6×10
6
3.7×10
6
注:
0h测的菌数为初始活菌数
2.6胆盐含量对菌株存活量的影响
以胆盐含量分别为1‰、2‰、3‰、4‰的MＲS
液体培养基处理LS61、LS64、LS77菌株，28℃条件
下处理0、0．5、1．5、3．0、4．5h后乳酸菌的存活量列
于表5．
表5不同胆盐含量下乳酸菌的存活量
Tab．5Survivaloflacticacidbacteriaunderdifferentbilesaltconcentration
菌株处理时间/h
乳酸菌存活量/cfu·cm
－3
1‰2‰3‰4‰0（对照）
LS6104.9×10
6
4.9×10
6
4.9×10
6
4.9×10
6
4.9×10
6
0.55.1×10
6
4.9×10
6
4.5×10
4
5.1×10
3
5.2×10
6
1.55.5×10
6
4.9×10
6
4.1×10
4
5.2×10
3
9.5×10
6
3.08.0×10
6
5.3×10
6
4.2×
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