胶乳偶联方案的输出.docx
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胶乳偶联方案的输出
方案一
实验方法:
一步法共价结合
实验步骤:
1、配制50mM的MES反应缓冲溶液,pH值为6.0;
2、将蛋白质溶解于反应缓冲溶液中,其浓度为10mg/L;
3、用反应缓冲溶液稀释胶乳微球,使其浓度为1%(W/V);
4、将上述蛋白质溶液与胶乳微球混合,混合后在温室培育20分钟;
5、用去离子水配制EDAC溶液,浓度为10mg/mL(52μmol/mL);
6、取计算量的EDAC溶液加到蛋白质与胶乳微球混合液中;
7、用0.1M氢氧化钠(NaOH)溶液调整该反应混合液的pH值至6.5±0.2,在摇床温室培育2小时;
8、将未结合的蛋白质除去,贮藏于缓冲溶液中。
方案二
实验方法:
简单二步法共价结合
实验步骤:
1、配制50mM的MES反应缓冲溶液,pH值为6.0;
2、将蛋白质溶解于反应缓冲溶液中,其浓度为10mg/L;
3、用反应缓冲溶液稀释胶乳微球,使其浓度为1%(W/V);
4、1mL胶乳微球悬浮液,加入20mgEDAC,在室温培育40分钟,在20分钟后第二次加入20mg/mL;
5、用相等体积的该缓冲溶液来洗涤胶乳微球,离心,用1倍体积的缓冲溶液重复处理;
6、将蛋白质溶解于50-100mM的MES缓冲溶液中,蛋白质浓度为1mg/mL;
7、再将胶乳微球悬浮于去离子水或结合的缓冲溶液中,迅速加入溶解的蛋白质,37℃搅拌反应3小时;
8、按1mL反应混合液加入2.5μL乙醇胺混合,搅拌反应10分钟;
9、除去未结合的蛋白质,贮藏与贮存的缓冲溶液中
方案三
实验方法:
生成NHS-酯的中间体二步法共价结合
实验步骤:
1、每ml反应混合物加入下列各物:
a.去离子水是最后容积为1.0mL;
b.0.1mL的10x的贮备缓冲溶液,其pH值为6.0-6.5(一般可用0.5MMES缓冲溶液);胶乳微球最终浓度为1%(W/V);
c.0.23mL的50mg/ml的NHS在去离子水中的溶液;
d.19.2mg/mL(100mM)的EDAC在去离子水中的溶液
2、在室温将此混合物反应15-30分钟,不断搅拌;
3、用MES缓冲液或纯化水洗涤胶乳微球悬浮物,除去未反应的NHS和EDAC;
4、重新将胶乳微球在去离子水中悬浮,使其浓度为1%(w/v);
5、将结合的蛋白质溶于50-100mM的MES缓冲溶液中,浓度为1mg/mL;
6、立即加入蛋白质溶液(胶乳微球、蛋白质和缓冲溶液的浓度分别为0.5%(w/v)、0.5mg/mL、25-50mM);
7、将混合物反应至少2小时,轻轻搅拌;
8、按1mL反应混合液加入2.5μL乙醇胺混合,搅拌反应10分钟;
9、除去未结合的蛋白质和乙醇胺,贮于适宜的贮存缓冲溶液中。
附录
试剂:
MES缓冲液
500mM和50mM;PH6.1;4°C储存(如果发黄或者污染,应倒掉)。
EDAC
盐酸1-乙基-3-二甲基氨基丙基二酰亚胺;52umol/ml:
分析天平称取10mgEDAC,加入1ml去离子水。
(EDAC对潮气非常敏感,在水中快速水解,EDAC储存于干燥器中,-5°C保存。
)
NHS
N-羟基琥珀酰亚胺;50mg/ml水溶液
蛋白质溶液
蛋白质充分稀释溶解,浓度为1-10mg/ml
技术说明:
1.微球总表面积与其粒径成反比,抗体的具体用量需要根据使用微球的大小做相应改变;
单位质量的微球表面积(m2/g):
A/M=6/PD
其中D=微球粒径(µm)
P=微球密度(聚苯乙烯1.05g/ml)
例如:
0.8µm的聚苯乙烯微球,A/M=6/1.05×0.8=7.14m2/g
1.6µm的聚苯乙烯微球,A/M=6/1.05×1.6=3.57m2/g
0.8µL,10mg聚苯乙烯微球需加入125-250µL多克隆抗体
1.6µL,10mg聚苯乙烯微球需加入62.5-125µL多克隆抗体
2.虽然疏水性吸附与缓冲液pH值无关,但反应缓冲液的pH值对被吸附蛋白质的构象有较大影响,进而影响其吸附效率。
在等电点pH值条件下,更多的蛋白质疏水性吸附点暴露出来,利于其与微球作用;
3.高效搅拌下,将微球分散液快速加入蛋白质反应缓冲液,可以获得最高的吸附效率和吸附均匀度;
4.绝大部分的蛋白质很快被吸附,延长蛋白质与微球混合时间有助于蛋白质正确定位。
方案五
SampleProtocolforTwo-StepCarbodiimideCouplingofProteintoCarboxylatedMicrospheres
Microspheresshouldbeprotectedfromprolongedexposuretolightthroughoutthisprocedure.
1.ResuspendthestockuncoupledmicrospheresaccordingtotheinstructionsdescribedintheProductInformationSheetprovidedwithyourmicrospheres.
2.Transfer5.0x106ofthestockmicrospherestoaUSAScientificmicrocentrifugetube.
3.Pelletthestockmicrospheresbymicrocentrifugationat≥8000xgfor1-2minutes.
4.Removethesupernatantandresuspendthepelletedmicrospheresin100μLdH2Obyvortexandsonicationforapproximately20seconds.
5.Pelletthemicrospheresbymicrocentrifugationat≥8000xgfor1-2minutes.
6.Removethesupernatantandresuspendthewashedmicrospheresin80μL100mMMonobasicSodiumPhosphate,pH6.2byvortexandsonicationforapproximately20seconds.
7.Add10μLof50mg/mLSulfo-NHS(dilutedindH20)tothemicrospheresandmixgentlybyvortex.
8.Add10μLof50mg/mLEDC(dilutedindH20)tothemicrospheresandmixgentlybyvortex.
9.Incubatefor20minutesatroomtemperaturewithgentlemixingbyvortexat10minuteintervals.
10.Pellettheactivatedmicrospheresbymicrocentrifugationat≥8000xgfor1-2minutes.
11.Removethesupernatantandresuspendthemicrospheresin250μLof50mMMES,pH5.0byvortexandsonicationforapproximately20seconds.SeeTechnicalNote1.
12.Pelletthemicrospheresbymicrocentrifugationat≥8000xgfor1-2minutes.
13.Repeatsteps11.and12.Thisisatotaloftwowasheswith50mMMES,pH5.0.
14.Removethesupernatantandresuspendtheactivatedandwashedmicrospheresin100μLof50mMMES,pH5.0byvortexandsonicationforapproximately20seconds.
15.Add125,25,5or1μgproteintotheresuspendedmicrospheres.(Note:
Werecommendtitrationinthe1to125μgrangetodeterminetheoptimalamountofproteinperspecificcouplingreaction.)
16.Bringtotalvolumeto500μLwith50mMMES,pH5.0.
17.Mixcouplingreactionbyvortex.
18.Incubatefor2hourswithmixing(byrotation)atroomtemperature.
19.Pelletthecoupledmicrospheresbymicrocentrifugationat≥8000xgfor1-2minutes.
20.Removethesupernatantandresuspendthepelletedmicrospheresin500μLofPBS-TBNbyvortexandsonicationforapproximately20seconds.SeeTechnicalNote2.
21.Incubatefor30minuteswithmixing(byrotation)atroomtemperature.(Note:
Optional–performthisstepwhenusingthemicrospheresthesameday.)
22.Pelletthecoupledmicrospheresbymicrocentrifugationat≥8000xgfor1-2minutes.
23.Removethesupernatantandresuspendthemicrospheresin1mLofPBS-TBNbyvortexandsonicationforapproximately20seconds.SeeTechnicalNote3.
24.Pelletthemicrospheresbymicrocentrifugationat≥8000xgfor1-2minutes.
25.Repeatsteps23.and24.Thisisatotaloftwowasheswith1mLPBS-TBN.
26.Remove