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生物化学

、

本科毕业论文

题目马铃薯miR169靶基因预测及其表达载体的构建

学院生命科学技术学院

专业生物技术（生物制品）

毕业届别应届毕业

姓名李世贵

指导教师司怀军

职称教授

甘肃农业大学教务处制

二〇一三年五月

马铃薯miR169靶基因预测及其表达载体的构建

姓名：

李世贵

（甘肃农业大学生命科学技术学院生物技术专业，甘肃兰州，730070）

摘要：

MicroRNA（简称MiRNA）是一类由20-24个核苷酸组成的内源RNA分子，是一类非编码RNA，在生物生长发育的各个时期都扮演着重要的角色，调控着许多重要的生物途径，处于基因调控网络的核心位置。

它们通过miRNA降解和翻译抑制等方式，特异地对靶基因进行转录后调控。

植物对干旱胁迫的响应是通过一些转录因子实现的，NF-YA类转录因子参与调控植物根瘤发育，缺氮，ABA胁迫和干旱胁迫等。

miR169/NF-YA的调控模式也在植物中高度保守并参与调控植物的生长发育和对胁迫的响应。

因此构建马铃薯miR169的表达载体显得至关重要。

本文通过生物信息学方法设计amiRNA序列，从而构建马铃薯miR169的表达载体。

关键词：

miRNA;生物信息学；转录因子；

Constructedtheexpressionvectorofpotato’smiR169

LiShiGui

（MajorinPlantBiotechnologyintheCollegeofLifeScienceandTechnologyofGansuAgriculturalUniversity,GansuLanzhou,730070）

MicroRNAs（miRNAs）areendogenous20~24nucleotideRNAs.ItisbelongtouncodingRNAs.miRNAshaverecentlybeenshowntoplaycriticalrolesateachmajorstageofplantdevelopment,regulatinganumberofkeypathways.Theytypicallyactatthecoreofageneregulatorynetwork。

WhichtargetcomplementarymRNAtranscriptsforcleavageortranscriptionalrepression.Theplantbysometranscriptionfactorachievetharesponding0fdroughtforce.theclassofNF-YAthatinplantswerehighlyconservative.alsoparcatingandregulatinggrowthanddevelopmentwithplant.althoughconstructedthemiR169’expressionvetorofpotatoisveryimportant.thisarthiclebytheinformationbiologywaydesigntheamiRNAblast,consequentlyconstructedthemiR169’expressionvetorofpotato.

Keywords:

miRNA；bioinformatics;transcriptionfactor

1.前言

1.1miRNA靶基因

miRNA靶基因是指能与miRISC相结合、被miRNA负调控的一类RNA序列。

在自然界中，除了少数病毒把核糖核酸作为存储遗传信息的载体外，几乎所有的生物都以脱氧核糖核酸为存储遗传信息的载体。

双链DNA在解旋酶及RNA聚合酶等作用下转录下形成mRNA，并将其携带的遗传因子转移到mRNA里。

在简单的原核生物中（如细菌），DNA转录生成的RNA即为mRNA,但对复杂的真核生物而言，由于其基因中含有大量的内含子，即不编码蛋白质的区域，因此转录RNA需经加工才能成为mRNA。

对于真核生物前体RNA而言，最重要的一个步骤就是进行RNA剪切——前体RNA在mRNA剪切酶的作用下，将内含子部分剪切掉，产生包含连续可读框的初始mRNA。

初始mRNA在进行5’端和3‘端的修饰后被转运到细胞质中，成为成熟的mRNA。

其中RNA的5’端修饰是指在其5’端显现时对其进行加帽的过程，3‘端修饰是指在其切割后对其加入一系列的腺苷酸尾部的过程。

真核生物的mRNA主要由编码区和非编码区组成。

mRNA的编码区通常始于AUG而在终止密码子处结束，中间包含一系列编码氨基酸系列的密码子。

虽然mRNA的主要功能是编码蛋白质，但mRNA的长度往往长于编码区的长度，它通常还包含编码区两端的非编码区域。

一般把编码区起始位点之前的区域称为前导区，或者5’非编码区（5’Untranslatedregion,5’UTR）。

把终止信号之后的3‘端的非编码区域称为尾部区，或者3‘非编码区（3’Untranslatedregion,3’UTR）。

虽然这些非编码区也是转录单元的一部分，但他们并不参与蛋白质的编码，而是在调控mRNA的生物活性和编码蛋白质能力等方面扮演重要角色。

从目前已有的生物学实验数据来看，miRNA主要通过结合mRNA的3’UTR来调控靶mRNA。

不同mRNA中的3’UTR长度变化范围很大，从几十nt到几十万nt,它与miRNA结合的具体位置被称为靶位点。

每个靶3’UTR可以有多个靶位点，一般认为，对于一个靶3’UTR而言，只要存在一个与miRNA相互作用的真实靶位点，则称3’UTR为该miRNA的靶基因。

1.2转录因子及其结构特征

转录因子（Trasnscriptionfactors，TF），亦称为反式作用因子，是一类能与位于真核基因启动子区中的顺式作用元件结合并发生特异性作用的蛋白质，当植物感受外界高盐、干旱、激素、病害时，通过一系列信号传递，激发转录因子，通过转录因子相互间及转录因子与其它相关蛋白的相互作用来激活RNA聚合酶II转录复合物，启动相对应的特定基因转录表达，或者参与调控基因转录的部位和时间，或者参与调控基因对外界环境因素所诱导的响应转录等，后通过基因产物的作用对内、外界信号做出相应的调节反应。

转录因子在高等植物的生长发育以及对生物和非生物的胁迫应答中起着十分重要的调控作用。

典型的植物转录因子的功能和特性是由四个功能区域：

核定位信号、寡聚化位点、转录调控域和DNA结合域等所决定的。

转录因子在特定的时间通过这些功能区域进入细胞核，或者结合其他转录因子的功能区域通过互作的方式调控表达，或者结合下游相关基因启动子中的顺式作用元件调控基因的表达。

目前，依据转录因子与DNA结合的方式的不同，可把转录因子大体分为两类：

普遍性转录因子（Generaltranscriptionfactor）以及特异性转录因子（Sequencespecifictranscriptionfactor）。

普遍性转录因子一般是同启动子中的核心序列TATA框结合，进而激活所有基因的转录。

而对于特异性转录因子，他只与DNA序列上某些特定的顺式作用元件发生作用，激活下游特定基因的转录。

1.3技术路线

2材料与方法

2.1实验材料

2.1.1菌株和质粒

Trans5a、Cpb121

2.1.2培养基

LB液体培养基

1.0%Tryptone

0.5%Yeastextract

1.0%NaCl

PH7.0

2.1.3主要仪器设备

PCR仪、水浴锅、小型高速离心机、离心机5430、1.5ml离心管

2.1.4酶和主要试剂

Polymerase、sac

、kpn

、X-gal、IPTG、AMP、solution1、buffer、MIX酶

2,1miRNA靶基因的预测

miRNA靶基因的预测用植物miRNA靶基因在线预测软件psRNATarget（http:

//plantgrn.noble.org/psRNATarget/）预测。

将预测得到的靶基因序列号PGSC0003DMT400000743用potatogenomesequencingconsortium（

表2.1靶基因预测

靶基因序列号靶基因注释

其中为预测的靶基因序列号，通过由上可知，PGSC0003DMT400000743对应的成熟序列中含有Y5转录因子。

因此可设计其amiRNA的序列。

2.2amiRNA序列的设计

利用WMD平台设计了miRNA169成熟序列MIMAT0031369的amiRNA的四条引物,其序列如表2.2

表2.2引物序列

amiRNA的四条引物序列

ImiR-sgaTAGCCAAGGATGACTTGCCTtctctcttttgtattcc

IImiR-agaAGGCAAGTCATCCTTGGCTAtcaaagagaatcaatga

IIImiR*sgaAGACAAGTCATCCATGGCTAtcacaggtcgtgatatg

IVmiR*agaTAGCCATGGATGACTTGTCTtctacatatatattcct

2．3系统进化树的构建

将待研究序列MIMAT0031369与番茄、马铃薯和拟南芥的序列进行多序列比对，以确定该序列与其它序列的关系。

利用miRBase（http:

//www.mirbase.org/）、psRNATarget（http:

//plantgrn.noble.org/psRNATarget/）、PotatoGenomeGenomeSequencingConsortium（TranscriptionFactorDatabase（

用clustalx1.83序列比对软件和系统发育树构建软件MEGA构建系统发育树。

图2.3.1MEGA5软件构建马铃薯NF-YA基因全长氨基酸序列与部分已知马铃薯，番茄和拟南芥NF-YA基因全长氨基酸序列的系统发生树

2.3amiRNAs的产生

已知目的基因MIMAT0037252的核苷酸序列（表2.1），将这一序列提供给上海生工，由其设计出引物。

以PRS300（图2.1）为模板，通过重叠PCR把质粒PRS300中内源miR393a的20个核苷酸替换为我们设计的21个核苷酸的amiRNAs序列（图2.2）。

在第一轮的PCR中分别扩增5‵臂（片段a）、中心环（片段b）和3‵臂（片段c）,产物a、b、c利用2%琼脂糖凝胶电泳纯化。

图2.2.1模板质粒PRS300

图2.2.2amiRNA模板产生示意图

表2.2.1产生amiRNA前体的标准PCR体系

PCR反应正向引物反向引物模板PCR引物长度

（a）A

PRS300272bp

（b）

PRS300171bp

（c）

BPRS300298bp

（d）AB（a）+（b）+（c）701bp

A：

（5，-3，）CTGCAAGGCGATTAAGTTGGGTAAC

B：

（5，-3，）GCGGATAACAATTTCACACAGGAAACAG

在表2.2的PCR扩增反应中，其标准的反应条件如下：

标准反应（a）、（b）和（c）PCR条件

2.0μl10×PCRbuffer（Mg2+）95℃2min

2.0μldNTPs95℃30sec

1.0μleacholigo52℃30sec

1.0μltemplateDNA72℃40sec

0.5μlpolymerase（40cycle）

12.5μlH2O72℃7min

2.3.1产物a、b、c片段的分离纯化

仪器和材料：

、异丙醇等。

标准回收步骤：

通过琼脂糖凝胶电泳尽可能将目的DNA片段与其它片段分开。

用干净的手术刀将含目的片段的琼脂糖凝胶块切下，放入1.5ml离心管中沉重。

1．根据胶块的重量和浓度，按100mg琼脂糖加300~600ul的比例加入Buffer2.凝胶浓度＞1%.≤1.5%每100mg凝胶加入400ulBufferB2

2．将离心管置于50℃水浴5-10min，间或混匀，直至胶块完全完全溶化。

3．当目的片段＜500bp时，加入所使用的BufferB2体积1/3的异丙醇。

混匀当目的片段≥500bp时，此步骤可以省略，直接进行步骤5

4．将溶化好的溶液全部移入吸附柱，8，000×g离心30sec.倒掉收集管中的液体，将吸附柱放入同一个收集管中。

5．向吸附柱加入500ulwalshsolution,9,000×g离心30sec倒掉收集管中的液体，将吸附柱放入同一个收集管中。

6．重复步骤6一次。

7．将吸附柱和收集管放入离心机9,000×g离心1min,此步骤绝不可省略。

否则残余的乙醇会严重影响得率和后续实验。

9.在吸附膜中央加入15-40ulElutionBuffer,室温静置1-2min，9,000×g离心1min.将所得到的DNA溶液置于-20℃保存或用于后续实验。

（将ElutionBuffer预热至60℃可以进一步提高得率。

2.3.2d片段的扩增和分离纯化

以这3个DNA片段的混合物作为模板，以A和B为引物扩产物d（表2.2）。

d片段的标准反应体系如下:

标准反应（d）PCR条件

2.0μl10×PCRbuffer（Mg2+）95℃2min

2.0μldNTPs95℃30sec

1.0μloligoAandB55℃30sec

1.0μlfragment（a）、（b）and（c）72℃90sec

0.5μlpolymerase（40cycle）

12.5μlH2O72℃7min

利用1%琼脂糖分离纯化d片段，纯化过程同2.3.1。

并将d片段寄往上海生工进行测序。

分离得到的a、b、c和d片段的琼脂糖凝胶电泳图如下：

3．克隆载体的构建

3.1pMD18-TVector的连接

T载体连接的反应体系为：

1.0μlpMD18-TVector

4.0μlPCR产物

5.0μlsolution1

全量（10μl）加入至100μlJM109感受态细胞中，冰中放置30min,在超净工作台内操作（感受态细胞在刚取出时，放在冰中融化1秒）。

在水浴锅内42℃加热45S后，再放置于冰中1min。

加入890μlLB培养基37℃，220r培养60min。

3.2培养形成单菌落

材料和仪器：

X-gal、IPTG、AMP、微波炉、酒精灯、移液器、涂菌棒。

将制备好的100ml固体培养基放入微波炉内，使其溶解。

在溶解的培养基内分别加入100μlX-gal、IPTG、AMP。

然后将其倒入4只培养皿内。

在接种前先将酒精灯、移液器等在超净工作台内进行紫外线灭菌20min，与此同时培养皿温度降低至45℃左右。

在第一只培养皿内加入30μl大肠杆菌液，然后用涂菌棒使菌液均匀涂布在培养基内。

最后用塑料纸密封培养皿。

2,3,4培养皿内分别加入50μl,70μl,100μl大肠杆菌菌液，重复以上操作。

37℃暗培养12h。

3.3挑取菌斑，震摇菌液，以及PCR扩增

暗培养12h以后，培养基内出现蓝白斑，挑取白斑，接种在装有5mlLB的摇菌管中，并加入5μlAMP,220R,37℃培养12h。

取1μl菌液作为模板，进行PCR测定

摇菌：

1、2、3号管：

400μL Cpb121+10mL LB培养基+20μL Kan

4、5、6号管：

400μL 167菌液+10mL LB培养基+10μL Amp

摇6管菌液，PCR扩增。

电泳显示，1号和6号有明显的700多bp的条带，并对其进行拍照。

将6号菌液保存于离心管中。

2管中分别加入200μl的甘油。

并放在-80℃下保存。

另一管寄往生物公司进行测序。

3.4提取Cpb121质粒和miR169d片段

1）柱平衡步骤：

向吸附柱CP3中（吸附柱放入收集管中）加入500ul的平衡液BL,12000rpm离心1min,倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。

2）取1~5ml过夜培养的菌液，加入离心管中，使用常规台式离心机，12,000rpm离心1min,尽量吸除。

3）向留有菌体沉淀的离心管中加入250ul溶液P1（请先检查是否已加入RNaseA）,使用移液器或漩振荡器彻底悬浮细菌沉淀。

4）向离心管中加入259ul溶液P2,温和地上下翻转6~8次使菌体充分裂解。

5）向离心管中加入350ul溶液P3，立即温和地上下翻转6~8次，充分混匀，此时将出现白色絮状沉淀，12,000rpm离心10min。

6）将上一步收集的上清液用移液器转到吸附柱CP3中（吸附柱放入收集管中），注意尽量不要吸出沉淀。

12,000rpml离心30~60sec,倒掉收集管中的废液将吸附柱CP3重新放回收集管中。

7）向吸附柱CP3加入500ul去蛋白液PD,12000离心30~60sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CP3重新放回收集管中。

8）向吸附柱CP3中加入600ul漂洗液PW（请先检查是否已加入无水乙醇），12,000rpm离心30~60sec,倒掉收集管中的废液，将吸附柱CP3放入收集管中。

9）重复操作步骤8

10）将吸附柱CP3放入收集管中，12,000rpm离心2min,目的是将吸附柱中残余的漂洗液去除。

11）将吸附柱CP3置于一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位滴加50~100ul洗脱缓冲液EB,室温放置2min,12000rpm离心2min将质粒溶液收集到离心管中。

3.5双酶切

1）酶切体系为：

27μl提取的169质粒+13μlH2O+5μlbuffer+2.5μlsac

+2.5μlkpn

。

37℃水浴55min

2）跑胶回收，并测其浓度。

3）表达载体的连接：

5.6μl表达载体+1.4μl目的DNA片段+1μl酶+2μlBuffer。

3.6DNA的转化

Trans-T1PhageResistant感受态是目前生长速度最快的感受态细胞，适用于高效的DNA克隆和质粒扩增，减少克隆DNA同源重组的发生，提高质粒DNA的产量和质量

操作方法

取50ul冰浴上融化的感受态细胞，加入目的DNA,轻轻混匀，在冰浴中放置30分钟。

42℃水浴热激30秒，然后快速将管转移到冰浴2分钟，该过程不要摇动离心管。

向每个离心管中加入500ul无菌的LB培养基（不含抗生素），混匀后置于37℃,200/分钟培养1小时，使细菌复苏。

根据实验要求（质粒，重组连接产物转化），吸取不同体积已转化的感受态细胞加到含相应抗生素的LB琼脂培养基上，将细胞均匀涂开。

将平板置于37℃至液体被吸收，倒置平板，37℃过夜培养。

3.7挑取菌落

向50ml的LB液体培养基中加入50μl的kan,再将含有1/1000kan的LB液体培养基向5只摇菌管中分别加入5ml，将大而且圆的单菌落挑起，连同枪头一起打进摇菌管中，最后用封口纸封住摇菌管口。

220r,37℃,培养12h.

3.8PCR扩增测定

扩增体系为：

7μlH2O+1μlCpb121上游引物+1μlCpb121下游引物+1μl菌液+10μl酶

4.结果与讨论

4.1引物设计

引物要与模板链的序列紧密互补。

合成的一对引物分别与待测DNA的5’端和3’端互补。

引物内和引物之间不能形成稳定的二聚体或发夹结构。

这会破坏引物退火稳定性。

引物内部和引物之间不应有互补序列，一般来说，引物内部以及引物之间连续互补的碱基不应多于4个。

引物与非特异性扩增区无同源性。

引物不能在模板的非目的位点引发DNA聚合反应，即错配。

DNA熔解温度，指把DNA的双螺旋结构降解一半时的温度。

不同序列的DNA，Tm值不同。

DNA中G－C含量越高，Tm值越高，成正比关系。

复性温度=Tm值-（5～10℃）在Tm值允许范围内，选择较高的复性温度可大大减少引物和模板间的非特异性结合，提高PCR反应的特异性。

复性时间一般为30～60sec，足以使引物与模板之间完全结合。