流感病毒RNA聚合酶的结构与功能及其应用病毒学论文生物学论文.docx

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流感病毒RNA聚合酶的结构与功能及其应用病毒学论文生物学论文

流感病毒RNA聚合酶的结构与功能及其应用-病毒学论文-生物学论文

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　　每次流感大流行都对国际社会稳定和经济发展带来严重影响，因此很有必要研发流感防治药物。

　　目前有两类（神经氨酸酶抑制剂和M2蛋白阻滞剂）应用于流感病毒的药物，但是随着其耐药性逐渐出现，开发有效的靶向不同的病毒蛋白抗流感药物是迫切需要的。

流感病毒RNA聚合酶高度保守，在流感病毒基因组RNA复制，病毒mRNA转录以及维持病毒生命周期中发挥着重要作用，因此成为目前药物筛选与研究的首选靶点。

　　1流感病毒RNA聚合酶的结构

　　流感病毒RNA聚合酶是一个由PB2，PB1和PA三个亚基组成的异源多聚体，通过与病毒RNA及核衣壳蛋白组装形成vRNP复合体来介导病毒基因组的转录与复制（关于vRNP本综述不做详细介绍）。

该多聚体非常稳定，可以通过亲和层析纯化可获得完整的RNA聚合酶复合体，该复合体又被称为3P蛋白质，相对分子质量大约250000gmL－1。

这3种蛋白质是病毒粒子中分子量最大的蛋白质，分别为PBl（质量为96000gmL－1），PB2（质量为87000gmL－1），PA（质量为85000gmL－1）。

其中分子量较大的两种蛋白质呈偏碱性，称为碱性蛋白1（basicprotein1，PB1）和碱性蛋白2（basicpro-tein2，PB2）;分子量最小的蛋白质显酸性，称为酸性蛋白质（acidicprotein，PA）。

该蛋白复合物在病毒粒子中位于病毒基因3端，用免疫电镜技术直接观察到该复合体位于每一个核壳体的一端。

　　对于RNA聚合酶各亚基的装配及其相互作用也有较多的研究和报道。

通过三维重构技术得到的聚合酶复合体的结构相当紧凑，各亚基之间无明显界限。

通过生化、遗传及结构学研究表明，PB1亚基位于3P蛋白的核心，PB1亚基的N末端与PA亚基的C末端相连，PB1亚基的C末端与PB2亚基的N末端相连，形成稳定的蛋白质复合物。

关于这几个亚基相互作用位点存在很大的争议，有研究报道，PB1通过其N末端（残基1～25）（A/goose/Guangdong/1/96（H5N1））、C末端（残基678～757）（A/PuertoRico/8/1934），分别与PA亚基C末端（残基668～692）（A/goose/Guangdong/1/96（H5N1））、PB2亚基N末端（残基1～37）（A/PuertoRico/8/1934）相互连接。

此外，有研究表明，这3个亚基都包含一个功能性的核定位信号（NLS），其作用是使这几种蛋白质在胞浆合成后能分别的进入细胞核，之后在细胞核内组装成完整的聚合酶复合物。

也有研究表明，PB1和PA首先装配成异源二聚体，在RanBP5或Hsp90蛋白的帮助下运输到细胞核内，然后再与核内的PB2装配成完整的聚合酶复合物。

近年来，利用双分子荧光互补（BiFC）方法研究流感病毒聚合酶复合物（H1N1A/WSN/33）组装中蛋白质-蛋白质相互作用的试验中，检测到PA及PB2之间的也有相互作用，PA蛋白N端100个氨基酸残基负责PA-PB2之间的互动。

　　2流感病毒RNA聚合酶的功能

　　流感病毒RNA聚合酶复合体是一个多功能酶，不仅具有RNA聚合酶活性，同时也具有核酸酶活性。

　　流感病毒的病毒RNA（vRNA）转录形成mRNA过程的启动需要有加帽的引物（cappedRNAprim-er），该引物是从宿主细胞的mRNA上剪切下来的，该功能就是由病毒的RNA聚合酶完成的。

具体如下，在病毒基因组的转录过程中RNA聚合酶以病毒RNA（vRNA）为模板，通过聚合酶特异性的结合位点与宿主细胞mRNA的帽子结构相结合，从而发挥核酸内切酶活性，从宿主细胞mRNA嘌呤碱基处剪切下一个含有（10～13）个碱基的RNA片段，作为引物起始转录vRNA，合成mRNA。

当病毒聚合酶在模板5端遇到富集U区时，发生stutter产生Po-ly（A）尾结构并终止转录，至此完成了转录过程进入复制模式。

因而，完整的mRNA其5端具有1型帽子Cap-1结构，3端带有Poly（A）尾巴。

在转录过程中，病毒RNA聚合酶还具有3-5的核酸外切酶活性，利用该酶活性可以将新合成的3端错配的碱基切除，保证转录的真实性，起到校对转录本的作用。

　　除了上述转录过程，流感病毒RNA聚合酶还负责流感病毒的复制。

与转录过程相比，复制过程简单很多，既不需要帽子结构作为引物也不需要多聚腺苷酸化。

首先，RNA聚合酶以vRNA作为模板合成其互补链cRNA，接下来再以cRNA链作为模板合成vRNA。

总之，在病毒感染的早期阶段RNA聚合酶处于转录的模式，在感染的晚期阶段RNA聚合酶处于复制的模式。

　　3流感病毒聚合酶各亚基的结构和功能

　　3．1PB2PB2是个多功能的蛋白。

其在病毒mRNA转录的起始阶段能识别并结合5端I型帽子结构，启动转录过程。

然而对结合位点的位置却有很多争议。

最早通过交联实验表明，PB2（A/PR8）上有两个的基序参与RNACAP-1结合，一个位于N-末端氨基酸残基242～282位，另外一个位于C-末端氨基酸残基538～577位。

接着通过基因突变研究表明，PB2亚基（A/WSN/33，B/Aichi/5/88，C/JJ/50）的2个芳香族残基-Phe363，Phe404是帽结合的关键位点，它们与帽子上带正电的N（7）-甲基鸟嘌呤形成三明治样结构。

而且这2个芳香族氨基酸在A，B和C型流感病毒中高度保守。

最近Guilligay等对PB2亚基（A/Victoria/3/1975（H3N2））的中心区域进行原子分辨率的结构测定以及功能分析，发现帽子结构的结合位点位于318～483位氨基酸残基区域。

帽结合结构域是一个紧凑、有序的-褶皱。

它是由5个不平行的折叠（1，2，5，6和7）、4个螺旋（1～4）及两侧的C-末端部分组成的短折叠（8～12）构成（见图1）。

对其结合区域碱基突变会影响病毒转录但却不影响病毒的复制。

因此，该区域可以作为抗流感病毒药物的靶点，设计帽子结构的类似物，与该领域相互作用，抑制RNA聚合酶的活性进而抑制流感病毒的复制。

也有研究表明，PB2亚基与帽子结构结合区域中起关键作用的活性位点主要是arg355，his357，Glu361以及Gln406等残基。

它们在帽识别和形成芳香族三明治过程中提供最重要的氢键和疏水作用。

　　有研究组使用共沉淀结晶的方法获得了PB2N-PB1C（A/PuertoRico/8/1934）的晶体结构，确认了PB2亚基通过其N末端（1～37）氨基酸和PB1亚基C末端86个氨基酸相互连接。

尽管该晶体结构的体积较小，但是对于三聚体之间的互动却是必须的，同时由于它们相互作用的界面在跨种属的和人流感毒株中却是完全保守的，因此该相互作用位点也可能是一个药物作用位点。

　　关于PB2亚基部分信息是在研究其在细胞质与细胞核之间运输过程中获得的。

研究表明，PB2亚基C末端（678～757）（A/PR8）氨基酸残基区域存在二重核定位信号（NLS;737RKRX12KRIR755），保证了RNA聚合酶通过核孔复合体被运到细胞核内。

Tarendeau等没有获得NLS域结晶（A/Victoria/3/75（H3N2）），但却获得了其与输入蛋白5（importin-5）共结晶的X射线结构图。

该研究详细说明了NLS二重定位特性及其与输入蛋白-绑定时NLS区域的构象变化。

　　PB2亚基与流感病毒宿主嗜性有关。

用统计学方法对美国国家生物技术信息中心（NCBI）及全球倡议所有流感数据共享数据库（GISAID）获得的野生型病毒分离株进行序列比较、分析后发现与宿主嗜性相关的基因主要集中在流感病毒聚合酶亚基上。

其中有2个在PA亚基上，3个在PB1亚基上，13个在PB2亚基上。

这与流感病毒宿主嗜性与PB2亚基上多个基因相关的研究结果相一致。

许多研究表明，PB2的627位可能是A型流感病毒宿主范围的重要决定位点之一，对当时所搜集到的数据进行分析后显示，所有人源流感病毒PB2的627位均为K，禽源流感病毒则均为E，因此推测PB2的627位与宿主嗜性相关。

接着有许多关于突变原因的研究，其中一个主要的假设是e627k突变能使病毒在较低温度下复制，从而导致病毒能在哺乳动物细胞中复制，这一假设与在哺乳动物上呼吸道温度（33～35℃）明显低于禽肠道温度（37～40℃）现象相一致。

　　PB2蛋白序列不同于其他蛋白序列，因此不能使用序列比对法识别其结构域。

同时，全长PB2不能可溶性表达，导致针对该亚基的研究进展缓慢，直到ESPRIT（基于随机文库构建的筛选过程，可以随机筛选到90000个PB2片段）技术的产生，才得到一系列用于结构研究的大肠杆菌表达的可溶性PB2片段。

接着有研究组运用ESPRIT方法获得一个PB2大的C-末端可溶性片段，该片段包括627域（因含有与宿主嗜性相关的627位氨基酸被命名为627域）和NLS域。

这两个域通过一个极性界面紧紧靠在一起，侧链暴露着赖氨酸和谷氨酸两个可溶性氨基酸。

接着有研究表明，627位突变会破坏627域的表面贴片。

同时，贴片学说解释了2009年流感大流行H1N1病毒627位点是E，确可以在人类广泛传播，可能由于双突变（g590s和q591r）补偿导致，其中arg-591有效屏蔽了glu-627的负电荷，重新建立了基础表面贴片，因此导致病毒可以在人类的传播。

　　PB2亚基第701，714位氨基酸也被认为与流感病毒在哺乳动物体内繁殖相关。

其机制可能与这两个氨基酸参与PB2与宿主蛋白之间的相互作用有关。

同时该研究表明，这两个氨基酸处于PB2C端结构域的双向核定位序列（NLS）中，通过核磁共振（NMRNuclearMagneticResonance）图显示PB2第627，701及714这3个氨基酸位点均位于蛋白质三维结构的外表面。

　　此外，PB2C末端可以与宿主细胞输入蛋白-1，5，7相互作用，从而将PB2亚基输入细胞核。

二者之间的相互作用在病毒RNA聚合酶的组装以及病毒对宿主细胞适应方面发挥着重要作用。

还有研究表明，PB2亚基不仅存在于细胞核内，在线粒体内也有分布，它能够与线粒体抗病毒信号蛋白相互作用，抑制线粒体介导的干扰素的表达，在决定病毒毒力方面发挥着重要作用。

　　3．2PB1PB1亚基是RNA聚合酶的核心亚基，其中PA羧基末端结构域形成一个新的折叠即形成深的，高度疏水凹槽，而PB1氨基末端残基则形成一个适合的3（10）螺旋插入其中。

这一复合体结构从外观看类似于一个龙头（PA羧基端）嘴部咬着一块骨头（PB1短肽）。

PB1N端7～10个氨基酸残基构成的短LLFI基序在与PA相互连接中起重要作用。

有研究表明，PA与PB1的连接对聚合酶复合体的活性及病毒繁殖能力起关键作用。

而PB1亚基的C末端与PB2亚基的N末端连接区域存在一个由3股螺旋形成的涡轮状的结构，该结构对聚合酶的活性起着十分重要的作用，相应的碱基突变会导致酶的转录复制活性大幅降低。

因此该连接区可以作为抗流感病毒药物的重要靶点。

　　PB1亚基是RNA聚合酶的催化中心，既参与mRNA转录又参与vRNA的复制。

同时，PB1与vRNA和cRNA的不同结合特性提示，RNA聚合酶在病毒基因组的复制和转录过程中可能存在构象变换。

有研究表明，其构象变化可能是由于vRNA5端与PB1第571～572两个Arg残基结合时导致的。

　　构象转换是帽子结构与内切酶活性位点激活的原因之一。

　　此外，PB1亚基上有4个高度保守基序（A，B，C，D），该基序存在于所有RNA病毒PB1亚基上。

　　其中C序列区参与了vRNA链的延长。

有研究表明，该保守序列上的基因变异，会导致聚合酶的活性明显下降。

因此，这些高保守基序在流感病毒转录及复制过程中起着重要的作用。

PB1C端（731～757氨基酸）（A/goose/Guangdong/1/96（H5N1））可以通过干扰流感病毒聚合酶的组装抑制病毒的复制繁殖。

更有趣的是，该段氨基酸是通过与PB1C端相互作用干预PB1C端与PB2N端的连接。

该研究为抗流感新药的研发奠定了基础。

　　3．3PA亚基PA亚基是聚合酶中的一个关键蛋白。

它能够被胰蛋白酶切割为两个部分:

25kD的PAN端和55kD的PAC端。

这两个区域是分开的，由一个20个氨基酸的长链肽连接，该连接肽能提高PA构象的灵活度。

同时该连接肽的缺失能导致PA亚基的N端与C端都不能与PB1相互作用。

针对PAN端及PAC端（A/goose/Guang-dong/1/96（H5N1））晶体结构及功能的研究较多。

　　研究表明，其PAN端是由/组装而成，由7个螺旋包绕着5个折叠组成，其2-5螺旋及3折叠组成的带负电的空腔是金属离子的结合位点（图2）。

PAC端由13个螺旋，一个短310螺旋，9个折叠和几个环及转角组成。

PAC端整体结构从外观看类似于一个龙头，由两部分组成，一部分似龙脑，一部分似龙嘴。

龙脑由5个螺旋，一个短3（10）螺旋包绕着7个折叠构成，龙嘴由8个螺旋，2个折叠则构成（图3）。

通过结构比对显示，PAC与其他蛋白质结构无相似性，表明PAC有新的折叠。

最新研究表明，PAN含有核酸内切酶的活性位点，该活性可以通过金属离子激活。

Yuan等（A/goose/Guangdong/1/96（H5N1）），在Mg2+存在下，得到了PA亚基N末端的晶体结构，发现1～197位氨基酸残基区域存在核酸内切酶的活性位点。

　　Mg2+与电负性空穴的保守酸性氨基酸残基相结合，相应的氨基酸残基发生突变会导致核酸内切酶活性下降，然而复制酶的活性保持不变。

Dias等（A/Victoria/3/1975（H3N2）），在Mn2+离子存在下，也获得了PA亚基N末端的晶体结构，发现核酸内切酶活性位点存在于1～209位氨基酸残基区，两个Mn2+与相应的酸性氨基酸残基相互结合，表明核酸内切酶是一个双离子介导的作用机制。

双离子Mn2+能介导最佳的核酸内切酶活性，而Mg2+介导的活性只能达到双离子介导的50%。

然而考虑到在生理条件下的浓度远远高于Mn2+，因此Mg2+可能协同介导细胞内核酸内切酶的活化。

此外，该活性可以被已知的流感病毒核酸内切酶抑制剂（2，4-dioxo-4-phenylbutanoicacid）抑制。

对其结构进行研究表明，PAN可能是（P）DXN（D/E）XK核酸内切酶家族的一名新成员。

　　PAC端参与PA与PB1之间的相互作用。

PAC端龙嘴区域的4个螺旋提供了一个高度疏水的口袋，该疏水口袋上的一些氨基酸残基，特别是一些疏水氨基酸，诸如F441，M595，L666，W706，F710，V636，L0通过疏水、氢键、范德华力作用与PB1亚基N末端的1～15个氨基酸残基相互连接，形成稳定的复合物。

Kawaguchi等发现，PAC通过493～512位及557～574位氨基酸（A/PR/8/34）这两个区域与宿主蛋白hCLE和微型染色体维持复合物（MCM）相互作用。

Liang等研究发现，PAC末端区域还具有蛋白核定位，参与病毒RNA的合成以及反式作用因子等功能。

　　PA具有导蛋白水解的活性，可导病毒和宿主蛋白的水解。

因此可以降低自身蛋白和与其共表达的异源蛋白质的累积水平。

它是一种磷酸化蛋白，Ser和Thr是其磷酸化位点。

有研究表明，此蛋白水解活性与3P聚合体复制功能有关。

该报道中称，PA基因157位Thr-Glu突变导致其完全丧失蛋白水解功能。

以该突变基因重构的RNA聚合酶丧失了由vRNA合成cRNA的能力，但转录vRNA功能不受到影响。

PA162位Thr-Ala的突变导致其导蛋白水解的能力降低，但没有完全丧失，其RNA聚合酶的聚合活性也表现出中等水平。

这表明RNA聚合酶活性与PA介导的蛋白水解活性存在正相关性。

进一步研究表明含有PA162突变体亚基的病毒表现出野生型的表型，而含有PA157突变体亚基的病毒无论在低感染剂量还是在高感染剂量下病毒的繁殖能力均降低。

该突变体病毒在小鼠体内也呈现出减毒的特征。

　　此外研究表明，PA亚基还具有以下功能:

在vRNA的合成中，PA可以与cRNA启动子结合;PA参与RNA聚合酶与RNA的相互作用;PA可能与毒力有关;PA亚基还具有糜蛋白型丝氨酸蛋白酶活性，624位的Ser残基是其活性的关键位点，但这种蛋白酶的具体功能还不清楚;PA参与了3P聚合体从没有活性的中间体装配成有活性复合物的过程;PA亚基还能影响RNA聚合酶的多种功能，包括3P多聚体的稳定性、活性、帽结合能力，与vRNA启动子结合能力。

　　4流感病毒聚合酶抑制剂

　　流感病毒RNA聚合酶高度保守，介导着病毒基因组的转录与复制，因此成为目前药物筛选与研究的首选靶点。

针对流感病毒RNA聚合酶的药物可以分为聚合酶抑制剂、核酸内切酶活性抑制剂。

　　4．1流感病毒聚合酶抑制剂分类其中聚合酶抑制剂可分为核苷类逆转录酶抑制剂和非核苷类逆转录酶抑制剂。

1987年Pravdina等研究发现，3-amino-3-deoxy-和3-azido-3-deoxyribonucleo-side-5-triphosphates核苷类抑制物可以抑制流感病毒转录，其抑制效果比当时众所周知甲型流感病毒复制抑制剂ribavirine5-triphosphate更有效。

Well-come实验室对核苷类逆转录酶抑制剂2-flu-orodGuo进行了研究。

研究表明，该抑制剂可被细胞酶磷酸化，可以可逆地抑制流感病毒感染鸡胚4h内的复制。

RNA杂交的研究结果表明，10molL－1化合物即可终止流感病毒RNA转录，但即使高浓度化合物（200molL－1）也没有抑制细胞自身蛋白质的合成。

体外实验表明，该化合物是竞争性抑制流感病毒的逆转录酶活性从而中断的病毒的转录，其Ki（药物分子对蛋白酶抑制作用的抑制常数）值为1m。

Favipiravir（T-705）也是核苷类转录酶抑制剂，它是一类广谱抗流感病毒药，能有效的抵抗H1N1，H5N1以及最近出现的病毒。

　　能降低流感病毒的耐药性，与奥司他韦联合使用对抵抗流感病毒有协同作用。

目前已在日本完成Ⅲ期临床试验。

T-705作用机制主要是抑制流感病毒RNA聚合酶的活性。

T-705在细胞内被细胞酶转换成活性代谢产物T-705-4-ribofuranosyl-5-triphosphate（T-705RTP），然后T-705RTP作为一个核苷类似物竞争性抑制GTP和ATP的合成。

该化合物IC50值为1．0molL－1，CC50值高达6370molL－1。

此外，针对非核苷类逆转录酶抑制剂4-［（4-butylphenyl）amino］-2-methylene-4-oxo-butanoicacid（d282）体外实验表明，该药物可以通过抑制嘧啶合成抵制甲型和乙型流感病毒。

但体内实验表明，该药物不能防止感染流感病毒小鼠的。

　　4．2抑制RNA聚合酶核酸内切酶抑制RNA聚合酶核酸内切酶的活性也是流感病毒感染治疗药物研发的一个新方向。

随着对PA晶体结构深入研究，研究人员渐渐认识到多价金属离子在核酸内切反应的酶催化过程中发挥着重要作用，因此可以通过一些金属螯合剂与PA亚基金属域相互作用特异性地抑制核酸内切酶活性。

1994年Merck公司研究团队发现了4-substituted2，4-dioxobutanoicacid系列化合物是核酸外切酶抑制剂，其IC50值0.2～29.0molL－1。

flutimide是从一个新的del-itschiacofertaspora物种分离得到，可以选择性地抑制A，B型流感病毒复制，IC50值为5．5molL－1。

　　2-氧基丁酸类L-735882及其衍生物，可以高度选择性抑制A，B型流感病毒的复制。

沙利度胺衍生物PPT-65，PPT-66，PPT-67也可以抑制PA核酸外切酶的活性。

BPR3P0128通过抑制核酸内切酶活性抑制了A型和B型流感病毒的复制。

其IC50值在51～190nmolL－1。

Bauman等使用晶体片段扫描的方法获得一系列高度有效的羟基吡啶酮化合物，其中活性最高化合物IC50值为11nmolL－1。

　　L-742，001是二酮酸类化合物，有研究表明PA上活性中心或其周围疏水口袋上碱基突变会导致流感病毒耐药株出现。

　　4．3小分子抑制剂此外，Muratore等使用现有的聚合酶蛋白之间相互作用晶体结构，确定一些潜在的小分子抑制剂。

其中一个小分子抑制剂可以通过抑制PB1-PA复合物的核输入进而抑制RNA聚合酶的转录作用。

该小分子抑制剂可以抑制H3N2、季节性H1N1及2009大流行株H1N1。

更重要是，它同时可以抑制奥司他韦耐药株。

　　综上所述，流感病毒RNA聚合酶是一个多功能酶，既是转录酶又是复制酶。

同时，该酶较为稳定，具有高度保守性及低突变率，不像表面抗原血凝素HA和NA那样容易发生变异。

因此，对流感病毒RNA聚合酶的结构和功能进行深入研究，找出其关键结构域和酶活性位点及其他功能位点，有望开发用于防治流感的高效、低毒、副作用小的破坏酶结构或抑制酶活性的新型药。