精选推荐版高考生物一轮复习生物技术实践第二讲微生物的培养与应用精选教案.docx
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精选推荐版高考生物一轮复习生物技术实践第二讲微生物的培养与应用精选教案
第二讲微生物的培养与应用
[基础知识·系统化]
知识点一 微生物的实验室培养
1．培养基
2．无菌技术
3．大肠杆菌的纯化培养
知识点二 土壤中分解尿素的细菌的分离
知识点三 分解纤维素的微生物的分离
1．实验原理
2．实验流程
[基本技能·问题化]
1．据某微生物培养基的配方表回答下列问题
编号
①
②
③
④
⑤
成分
（NH4）2SO4
KH2PO4
FeSO4
CaCl2
H2O
含量
0.4g
4.0g
0.5g
0.5g
100mL
（1）此培养基按物理性质划分属于液体培养基，因为没有凝固剂（如琼脂）；按功能划分属于选择培养基，因为没有碳源，只有自养型微生物才能生长（利用空气中的CO2）。
（2）此培养基含有的微生物的营养成分包括水、无机盐和氮源三类，若加入氨基酸，则它可充当的营养成分包括碳源、氮源和生长因子。
（3）若要观察微生物的菌落特征，培养基中应添加的成分是凝固剂（琼脂）。
（4）若用该培养基来分离尿素分解菌，应除去表中①成分（填表中序号），加入尿素和不含氮元素的有机物。
2．下图是倒平板的操作，请据图填空
（1）请用文字和箭头写出正确的倒平板操作流程：
丙→乙→甲→丁。
（2）甲、乙、丙中的灭菌方法是灼烧灭菌。
（3）丁中的操作需要等待平板冷却凝固后才能进行。
3．据两种接种方法产生的培养效果图完成下列问题
（1）获得图A效果和图B效果的接种方法分别是稀释涂布平板法、平板划线法。
（2）某同学在纯化土壤中的细菌时，发现培养基上的菌落连成一片，最可能的原因是什么？
应当怎样操作才可避免此种现象。
提示：
最可能的原因是菌液浓度过高或划线时在划下一区域前未将接种环灭菌。
采取的措施是增大稀释倍数或每次划新区域前先将接种环灭菌。
4．连线以下几种选择培养基和鉴别培养基及其应用
考点一培养基及微生物的纯化培养技术
命题点
（一） 培养基的成分、功能和制备
1．（2016·全国卷Ⅰ）空气中的微生物在重力等作用下，可以一定程度地沉降。
某研究小组欲用平板收集教室空气中的微生物，以了解教室内不同高度空气中微生物的分布情况。
实验步骤如下：
①配制培养基（成分：
牛肉膏、蛋白胨、NaCl、X、H2O）；
②制作无菌平板；
③设置空白对照组和若干实验组，进行相关操作；
④将各组平板置于37℃恒温箱中培养一段时间，统计各组平板上菌落的平均数。
回答下列问题：
（1）该培养基中微生物所需的氮来源于______________________。
若要完成步骤②，该培养基中的成分X通常是____________。
（2）步骤③中，实验组的操作是_______________________________________________
________________________________________________________________________。
（3）若在某次调查中，某一实验组平板上菌落平均数为36个/平板，而空白对照组的一个平板上出现了6个菌落，这种结果说明在此次调查中出现了__________现象。
若将30（即36－6）个/平板作为本组菌落数的平均值，该做法______________（填“正确”或“不正确”）。
解析：
（1）牛肉膏和蛋白胨中均含有氮元素，因此微生物所需的氮来源于牛肉膏和蛋白胨。
若要完成步骤②，需要进行倒平板操作，用到的是固体培养基，所以培养基中要有琼脂。
（2）该实验的空白对照组为不进行处理的无菌平板，实验组的操作为将各无菌平板分别放置在教室不同高度的位置上，开盖暴露相同时间。
（3）若空白对照组的平板上出现了菌落，说明实验过程中出现了污染现象。
空白对照组的一个平板上出现了6个菌落，导致实验变量不唯一，不能确定实验组平板上的菌落是否仅由教室内不同高度空气中的微生物形成，因此不能求出实验组的菌落平均值。
答案：
（1）牛肉膏、蛋白胨 琼脂
（2）将各实验组平板分别放置在教室不同高度的位置上，开盖暴露一段时间
（3）污染 不正确
2．（2016·全国卷Ⅲ）某同学用新鲜的泡菜滤液为实验材料分离纯化乳酸菌。
分离纯化所用固体培养基中因含有碳酸钙而不透明，乳酸菌产生的乳酸能溶解培养基中的碳酸钙。
回答下列问题：
（1）分离纯化乳酸菌时，首先需要用__________对泡菜滤液进行梯度稀释，进行梯度稀释的理由是______________________________________________。
（2）推测在分离纯化所用的培养基中加入碳酸钙的作用有______________________和____________________。
分离纯化时应挑选出________________的菌落作为候选菌。
（3）乳酸菌在－20℃长期保存时，菌液中常需要加入一定量的________________（填“蒸馏水”“甘油”或“碳酸钙”）。
解析：
（1）分离纯化乳酸菌时，首先需要用无菌水对泡菜滤液进行梯度稀释，这样既可避免杂菌污染，又可将乳酸菌分散成单个细胞，以便在培养基表面形成单个菌落。
（2）乳酸的积累影响乳酸菌的增殖，加入碳酸钙可以中和乳酸菌代谢（无氧呼吸）过程中产生的乳酸，另外，乳酸和碳酸钙反应，进而导致碳酸钙分解形成透明圈，有利于乳酸菌的鉴别和分离。
（3）对于需要长期保存的菌种，可以采用甘油管藏的方法。
在3mL的甘油瓶中，装入1mL甘油后灭菌。
将1mL培养的菌液转移到甘油瓶中，与甘油充分混匀后，放在－20℃的冷冻箱中保存。
答案：
（1）无菌水 泡菜滤液中菌的浓度高，直接培养很难分离得到单菌落
（2）鉴别乳酸菌 中和产生的乳酸（或酸） 具有透明圈 （3）甘油
[重难点拨]
常用选择培养基与鉴别培养基实例归纳
类型
实例
选择培养基
培养基中加入青霉素分离得到酵母菌和霉菌
培养基中加入高浓度的食盐用于分离得到金黄色葡萄球菌
以尿素作为唯一氮源的培养基用于分离分解尿素的细菌
不添加氮源的培养基用于分离固氮微生物
石油是唯一碳源时，可以抑制不能利用石油的微生物的生长，使能够利用石油的微生物生存，达到分离能消除石油污染的微生物的目的
培养基放在高温环境中培养只能得到耐高温的微生物
鉴别培养基
伊红—美蓝培养基可以鉴别大肠杆菌（菌落呈黑色）
命题点
（二） 无菌技术的操作
3．（2014·江苏高考节选）为了获得β 胡萝卜素产品，某小组开展了产β 胡萝卜素酵母的筛选与色素提取实验。
请回答下列问题：
（1）实验用的培养皿常用的两种灭菌方法是________________________________；为了减少灭菌后器皿被污染，灭菌前应该______________________。
（2）为了筛选出酵母菌，培养基中添加了青霉素，其目的是______________。
（3）右图是灭菌锅及其局部剖面示意图，图中甲、乙、丙指示的依次是__________。
（填序号）
①安全阀、放气阀、压力表
②放气阀、安全阀、压力表
③安全阀、放气阀、温度表
④放气阀、安全阀、温度表
（4）为了将分离到的菌株纯化，挑取了菌落在3块相同平板上划线，结果其中一块平板的各划线区均未见菌生长，最可能的原因是_____________________________________。
解析：
（1）实验室常用的灭菌方法是干热灭菌和湿热灭菌（高压蒸汽灭菌），在实验前应用牛皮纸或干净的报纸包扎器皿。
（2）酵母菌是真菌，对青霉素具有抵抗能力，青霉素主要抑制细菌、放线菌的生长。
（3）图中甲为安全阀，乙为放气阀，丙为压力表。
（4）接种的平板上未见菌落生长，说明接种不成功，原因可能是接种环灼烧后未冷却，使菌株因温度过高而被杀死。
答案：
（1）干热灭菌和湿热灭菌（高压蒸汽灭菌） 用牛皮纸（报纸）包扎器皿
（2）抑制细菌（放线菌）的生长 （3）①
（4）接种环温度过高，菌种被杀死
[重难点拨]
全面比较消毒和灭菌
条件
结果
常用方法
应用范围
消毒
较为温和的物理或化学方法
仅杀死物体表面或内部的部分微生物
煮沸消毒法
日常用品
巴氏消毒法
不耐高温的液体
化学药剂
消毒法
用酒精擦拭双手，用氯气消毒水源
灭菌
强烈的理化因素
杀死物体内外所有的微生物，包括芽孢和孢子
灼烧灭菌法
接种工具
干热灭菌法
玻璃器皿、金属用具
高压蒸汽
灭菌法
培养基及容器
命题点（三） 微生物的培养与纯化
4．（2017·江苏高考）苯酚及其衍生物广泛存在于工业废水中，对环境有严重危害。
小明同学准备依据如图操作步骤，从处理废水的活性污泥中分离筛选酚降解高效菌株。
请回答下列问题：
（1）酚降解菌富集培养基含有蛋白胨、K2HPO4、MgSO4、苯酚和水，其中可作为碳源的有____________。
（2）将采集到的样品接种培养，苯酚用量应随转接次数增加而逐渐________，以达到富集酚降解菌的目的。
若上图平板中菌落过于密集，应进一步____________，以便于菌落计数与分离。
制备平板培养基时除了需要水、营养物质外，还必须添加________。
（3）右图为连续划线法示意图，在图中____________（填图中序号）区域更易获得单菌落。
（4）采用比色测定法（使用苯酚显色剂）检测降解后的废水中苯酚残留量。
先制作系列浓度梯度并进行显色反应，下表中1～5号比色管的苯酚浓度应分别为____________。
管号
1
2
3
4
5
6
苯酚浓度（mg/L）
1
如果废水为50mg/L苯酚溶液，降解后约有21%的苯酚残留，则需将残留液稀释________（填序号：
①5 ②10 ③20）倍后，再进行比色。
解析：
（1）富集培养基中蛋白胨、苯酚都是含碳的有机物，可作为碳源。
（2）欲富集酚降解菌，随转接次数的增加，应逐渐增加培养基中苯酚的含量；若接种培养后平板上菌落过于密集，则应进一步稀释后再进行涂布，以降低平板上菌落密度，便于菌落计数与分离；平板培养基是固体培养基，除含有水、营养物质（碳源、氮源、无机盐等）外，还需添加琼脂作为凝固剂。
（3）利用连续划线法接种时，最后的划线区域（③）中，菌体的密度较小，容易获得单菌落。
（4）因系列浓度梯度中6号比色管中苯酚浓度为1mg/L，故1～5号比色管中的苯酚浓度应分别为0mg/L、0.2mg/L、0.4mg/L、0.6mg/L、0.8mg/L；根据题意，废水为50mg/L苯酚溶液，降解后约有21%的苯酚残留，要使稀释后的苯酚残留液浓度介于0～1mg/L，需将残留液稀释20倍左右。
答案：
（1）蛋白胨、苯酚
（2）增加 稀释涂布 凝固剂 （3）③ （4）0、0.2、0.4、0.6、0.8 ③
5．（2014·全国卷Ⅱ）为了调查某河流的水质状况，某研究小组测定了该河流水样中的细菌含量，并进行了细菌分离等工作。
回答下列问题：
（1）该小组采用稀释涂布平板法检测水样中的细菌含量。
在涂布接种前，随机取若干灭菌后的空白平板先行培养了一段时间，这样做的目的是__________________________；然后，将1mL水样稀释100倍，在3个平板上用涂布法分别接入0.1mL稀释液；经适当培养后，3个平板上的菌落数分别为39、38和37。
据此可得出每升水样中的活菌数为________个。
（2）该小组采用平板划线法分离水样中的细菌。
操作时，接种环通过________灭菌，在第二次及以后的划线时，总是从上一次划线的末端开始划线。
这样做的目的是________________________________________________________________________
________________________________________________________________________。
（3）示意图A和B中，________表示的是用稀释涂布平板法接种培养后得到的结果。
（4）该小组将得到的菌株接种到液体培养基中并混匀，一部分进行静置培养，另一部分进行振荡培养。
结果发现：
振荡培养的细菌比静置培养的细菌生长速度快。
分析其原因是：
振荡培养能提高培养液中____________的含量，同时可使菌体与培养液充分接触，提高______________的利用率。
解析：
（1）为了检测培养基平板灭菌是否合格，可在涂布接种前，随机取若干灭菌后的空白平板先行培养一段时间。
0.1mL稀释液中平均有38个活菌，可推测每升水样中的活菌数＝38×10×100×1000＝3.8×107（个）。
（2）接种环、接种针或其他金属用具直接在酒精灯火焰的充分燃烧层灼烧，可以迅速彻底地灭菌。
在第二次及以后的划线时，总是从上一次划线的末端开始划线，其目的是将聚集的菌体逐步稀释以便获得单个菌落。
（3）比较两图可以看出，A是用平板划线法接种培养后得到的结果，B是用稀释涂布平板法接种培养后得到的结果。
（4）由于振荡培养可以提高培养液中溶解氧的含量，还可以使菌体与培养液充分接触，提高营养物质的利用率，因此振荡培养的细菌比静置培养的细菌生长速度快。
答案：
（1）检测培养基平板灭菌是否合格 3.8×107
（2）灼烧 将聚集的菌体逐步稀释以便获得单个菌落
（3）B （4）溶解氧 营养物质
[重难点拨]
平板划线法和稀释涂布平板法的比较
比较项目
平板划线法
稀释涂布平板法
关键操作
接种环在固体平板培养基表面连续划线
①一系列的梯度稀释
②涂布平板法操作
注意事项
每次划线前后均需灼烧接种环
稀释度要足够高，为确保实验成功可以增加稀释度的范围
菌体获取
在具有显著的菌落特征的区域菌落中挑取菌体
从适宜稀释度的平板上的菌落中挑取菌体
适用范围
适用于好氧菌
适用于厌氧菌和兼性厌氧菌
优点
可以根据菌落的特点获得某种微生物的单细胞菌落
既可以获得单细胞菌落，又能对微生物计数
缺点
不能对微生物计数
操作复杂，需要涂布多个平板
考点二微生物的筛选与计数
命题点
（一） 土壤中分解尿素细菌的分离与计数
1．（2017·全国卷Ⅰ）某些土壤细菌可将尿素分解成CO2和NH3，供植物吸收和利用。
回答下列问题：
（1）有些细菌能分解尿素，有些细菌则不能，原因是前者能产生__________。
能分解尿素的细菌不能以尿素的分解产物CO2作为碳源，原因是__________________________________________。
但可用葡萄糖作为碳源，进入细菌体内的葡萄糖的主要作用是__________________________________________________________（答出两点即可）。
（2）为了筛选可分解尿素的细菌，在配制培养基时，应选择________（填“尿素”“NH4NO3”或“尿素＋NH4NO3”）作为氮源，不选择其他两组的原因是____________________________________________________。
（3）用来筛选分解尿素细菌的培养基含有KH2PO4和Na2HPO4，其作用有________________________________________________（答出两点即可）。
解析：
（1）土壤中的某些细菌之所以能够分解尿素，是因为它们能产生脲酶。
尿素分解菌是异养生物，不能利用CO2来合成有机物，必须利用现成的有机物（如葡萄糖）作为碳源；葡萄糖通过呼吸作用被分解时，能为细胞生命活动提供能量，同时，葡萄糖还可以转化成脂肪、某些氨基酸等物质，所以进入细菌体内的葡萄糖能为其他有机物的合成提供原料。
（2）选择培养基只是允许特定种类的微生物（目的微生物）生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基。
本实验的目的菌是可分解尿素的细菌，因此配制的培养基应只允许尿素分解菌生长，NH4NO3可以作为所有细菌的氮源，培养基中如含有NH4NO3，将不能起到筛选作用。
（3）KH2PO4和Na2HPO4能为细菌生长提供钾盐、钠盐和磷酸盐，而H2PO
/HPO
可作为缓冲剂，使培养基中pH保持相对稳定。
答案：
（1）脲酶 分解尿素的细菌是异养生物，不能利用CO2来合成有机物 为细胞生命活动提供能量，为其他有机物的合成提供原料
（2）尿素 其他两组都含有NH4NO3，能分解尿素的细菌和不能分解尿素的细菌都能利用NH4NO3，不能起到筛选作用 （3）为细菌生长提供无机营养，作为缓冲剂保持细胞生长过程中pH稳定
2．（2016·四川高考）图甲是从土壤中筛选产脲酶细菌的过程，图乙是脲酶基因转录的mRNA部分序列。
（1）图中选择培养基应以________为唯一氮源；鉴别培养基还需添加________作指示剂，产脲酶细菌在该培养基上生长一段时间后，其菌落周围的指示剂将变成________色。
（2）在5个细菌培养基平板上，均接种稀释倍数为105的土壤样品溶液0.1mL，培养一段时间后，平板上长出的细菌菌落数分别为13、156、462、178和191。
该过程采取的接种方法是__________________，每克土壤样品中的细菌数量为________×108个；与血细胞计数板计数法相比，此计数方法测得的细菌数较________。
（3）现有一菌株的脲酶由于基因突变而失活，突变后基因转录的mRNA在图乙箭头所示位置增加了70个核苷酸，使图乙序列中出现终止密码（终止密码有UAG、UGA和UAA）。
突变基因转录的mRNA中，终止密码为________，突变基因表达的蛋白含________个氨基酸。
解析：
（1）脲酶能够催化尿素分解释放出氨和二氧化碳，因此选择培养基中应以尿素为唯一氮源。
挑取单菌落接种到加有酚红指示剂的鉴别培养基中，培养一段时间后，菌落周围的氨增加，pH升高，酚红指示剂将变红。
（2）该过程采取的接种方法为稀释涂布平板法。
利用稀释涂布平板计数法对细菌进行计数时，应选择菌落数在30～300的平板，因此平板上长出的细菌菌落平均数为（156＋178＋191）÷3＝175个。
每克土壤样品中的细菌数为175÷0.1×105＝1.75×108个。
血细胞计数板计数法能将死细胞计算在内，而稀释涂布平板计数法只能计数活细胞（只有活细胞才能在平板上生长），故一般血细胞计数板计数法要比稀释涂布平板计数法的结果大。
（3）箭头处插入70个核苷酸，箭头后密码子的解读方式为*AG，UGA，GAA……对比3种终止密码可发现，此处的终止密码为UGA。
从起始密码到终止密码之前共有273＋72个碱基，因此突变基因表达的蛋白质含115个氨基酸。
答案：
（1）尿素 酚红 红
（2）稀释涂布平板法 1.75 少 （3）UGA 115
[重难点拨]
统计菌落数目的两种方法
（1）显微镜直接计数法：
原理
利用特定细菌计数板或血细胞计数板，在显微镜下计算一定容积的样品中微生物的数量
方法
用计数板计数
缺点
不能区分死菌与活菌
（2）间接计数法（活菌计数法）：
原理
当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌，通过统计平板上的菌落数，就能推测出样品中大约含有多少活菌
计算公式
每克样品中的菌株数＝（C÷V）×M，其中，C代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数，V代表涂布平板时所用的稀释液的体积（mL），M代表稀释倍数
操作
设置重复组，增强实验的说服力与准确性。
同时为了保证结果准确，一般选择菌落数在30～300的平板进行计数
命题点
（二） 分解纤维素的微生物的分离
3．（2014·全国卷Ⅰ）植物秸秆中的纤维素可被某些微生物分解。
回答下列问题：
（1）分解秸秆中纤维素的微生物能分泌纤维素酶，该酶是由3种组分组成的复合酶，其中的葡萄糖苷酶可将__________分解成________。
（2）在含纤维素的培养基中加入刚果红（CR）时，CR可与纤维素形成________色复合物。
用含有CR的该种培养基培养纤维素分解菌时，培养基上会出现以该菌的菌落为中心的________。
（3）为从富含纤维素的土壤中分离获得纤维素分解菌的单菌落，某同学设计了甲、乙两种培养基（成分见下表）：
酵母膏
无机盐
淀粉
纤维素粉
琼脂
CR溶液
水
培养基甲
＋
＋
＋
＋
－
＋
＋
培养基乙
＋
＋
＋
－
＋
＋
＋
注：
“＋”表示有，“－”表示无。
据表判断，培养基甲________（填“能”或“不能”）用于分离和鉴别纤维素分解菌，原因是________________________；培养基乙________（填“能”或“不能”）用于分离和鉴别纤维素分解菌，原因是____________________________________________________
________________________________________________________________________。
解析：
（1）纤维素酶至少包括3种组分，即C1酶、CX酶和葡萄糖苷酶，C1酶、CX酶催化纤维素分解成纤维二糖，葡萄糖苷酶将纤维二糖分解成葡萄糖。
（2）CR能与培养基中的纤维素形成红色复合物。
当纤维素被纤维素酶分解后，CR 纤维素的复合物就无法形成，培养基中会出现以纤维素分解菌的菌落为中心的透明圈。
（3）培养基甲中未添加琼脂，为液体培养基，液体培养基上不能形成单菌落，故不能用于分离和鉴别纤维素分解菌。
培养基乙中未添加纤维素，不能和CR形成红色复合物，即使出现单菌落也不能确定为纤维素分解菌。
答案：
（1）纤维二糖 葡萄糖
（2）红 透明圈 （3）不能 液体培养基不能用于分离单菌落 不能 培养基中没有纤维素，不会形成CR 纤维素红色复合物，即使出现单菌落也不能确定其为纤维素分解菌
[重难点拨]
微生物的筛选与鉴别方法
（1）微生物的筛选方法：
单菌落挑取法
利用平板划线法或稀释涂布平板法接种到固体平板培养基表面，直接根据微生物菌落的特征利用单菌落挑取的方法获得目的微生物
选择培养法
利用选择培养基对微生物进行选择培养，直接获得目的微生物
鉴定培养法
利用鉴别培养基使目的微生物菌落呈现特有的特征，然后筛选目的微生物
（2）微生物的鉴别方法：
菌落特征鉴别法
根据微生物在固体平板培养基表面形成的菌落的形状、大小、隆起程度和颜色等特征进行鉴别
指示剂鉴别法
如培养基中加入酚红指示剂，培养某种微生物后，培养基变红说明该种微生物能够分解尿素
染色鉴别法
如利用刚果红染色法，根据培养基中出现以纤维素分解菌为中心的透明圈来筛选分解纤维素的微生物
[真题集训——验能力]
1．（2015·全国卷Ⅰ）已知微生物A可以产生油脂，微生物B可以产生脂肪酶。
脂肪酶和油脂可用于生物柴油的生产。
回答有关问题：
（1）显微观察时，微生物A菌体中的油脂通常可用________染色。
微生物A产生的油脂不易挥发，可选用__________（填“萃取法”或“水蒸气蒸馏法”）从菌体中提取。
（2）为了从自然界中获得能产生脂肪酶的微生物B的单菌落，可从含有油料作物种子腐烂物的土壤中取样，并应选用以________为碳源的固体培养基进行培养。
（3）若要测定培养液中微生物B的菌体数，可在显微镜下用________________直接计数；若要测定其活菌数量，可选用______________法进行计数。
（4）为了确定
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