植物细胞工程理论3.docx
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植物细胞工程理论3
第三章植物主要组织培养技术
本章教学目标
（1）掌握植物组织培养快速繁殖技术
（2）掌握茎尖脱毒原理与技术
（3）掌握花药培养、花粉培养
（4）了解植物胚胎培养
第一节植物的快速繁殖
本节教学目标
（1）掌握植物组织培养概念及快速繁殖流程
（2）掌握植物组织培养外植体成苗途径
（3）了解植物组织培养快速繁殖常见问题及对策
（4）掌握试管苗增殖率的估算
（5）了解培养反应的观察与统计方法
引言：
自然界无性繁殖途径有2条：
1、无融合生殖：
不经过减数分裂和受精而形成种子。
2、营养繁殖：
由母株的部分营养体再生出新的植株。
营养繁殖主要有分株繁殖、播种繁殖、压条繁殖、嫁接繁殖、扦插繁殖等。
植物组织培养也是植物营养繁殖的重要手段。
繁殖植物组织培养包括根、茎、叶、叶柄、茎尖、幼胚、花药、花粉等无菌培养。
一、植物组织培养的概念
1、广义的概念：
离体的植物器官、组织、细胞和原生质体（即外植体）在无菌条件下，在人工配制的培养基上，在适当的培养条件下分化发育成完整植株。
狭义的概念：
对植物体组织或由植物器官培养产生的愈伤组织进行培养直至生成完整植株。
2、植物组织培养类型：
根据培养对象（外植体explant）的不同划分：
植株培养（plantculture）是对完整植株材料的培养，如幼苗及较大植株的培养。
植物器官培养（plantorganculture）即离体器官的培养，根据需要的不同，可以包括分
离茎尖、茎段、根尖、叶片、叶原基、花瓣、雄蕊、雌蕊、胚、子房、
果实等外植体的培养。
植物组织培养（tissueculture）为狭义的组织培养，是对植物体的各部分组织或组织切块
放在离体的无菌环境中让其生长发育的方法。
由于离体培养的组织块大
多是先脱分化形成愈伤组织，而后再进一步分化，因此也将植物组织的
培养定义为愈伤组织的培养（callusculture）。
愈伤组织的培养是指使一个
细胞、一块组织或一个器官的细胞，通过脱分化形成愈伤组织，并再分
化成植株的方法。
二者均通过再分化诱导形成植株。
植物细胞培养（cellculture）是对由愈伤组织等进行液体振荡培养所得到的能保持较好
分散性的离体单细胞或花粉单细胞或很小的细胞团的培养。
植物原生质体培养（proplastculture）是用酶及物理方法除去细胞壁的原生质体的培养。
根据培养结果划分：
分为3类
愈伤组织培养：
是指从外植体上直接诱导出愈伤组织的培养。
愈伤组织在植物组织培养中的用途非常广泛
①作为植物组织培养的原材料和进一步培养的材料。
如：
作为原生质体游离的材料、悬浮培养细胞的材料、胚状体诱导的材料等
②作为培养的终产物用于研究。
如：
用为植物组织细胞次生代谢物提取的原料。
胚状体培养：
是指从外植体上直接或间接诱导出胚状体的培养。
胚状体的获得是进行植物组织培养的主要目的，胚状体一方面可作为人工种子的来源；另一方面也是快速繁殖的主要途径。
再生植株培养：
是指从外植体上通过各种途径直接或间接诱导出再生植株的培养。
再生植株培养是植物组织培养的最终目的。
一般来讲，只有将外植体诱导出再生植株才算获得植物组织培养的真正成功。
根据培养基物理状态划分：
固体培养：
液体培养：
根据加入液体量的多少又分为液体悬浮培养和液体浅层培养；根据培养
瓶的放置情况分为液体静置培养、液体旋转培养、液体振荡培养等。
根据培养目的的不同划分：
试管嫁接:
指在无菌条件下，用显微镜操作法将仅带1～3片叶原基的茎尖（约1mm）
取下，嫁接于在试管中培养的砧木上的技术。
试管受精：
指在无菌条件下，将未受精的雌蕊、胚珠或子房和花粉同进放在人工配
制的培养基上生长，使花粉萌发产生的花粉管进入胚珠，在试管内完成
受精过程而获得有生活力的种子的技术。
试管加倍：
指在无菌条件下，将获得的幼小植株放在加入一定化学物质的培养基上
培养，在化学物质的作用下，幼小植株细胞的染色体数可加倍的技术。
试管育种：
指植株在离体培养条件下，通过人工诱变，进行新品种选育的技术。
根据培养方法的不同分为：
平板培养、微室培养、悬浮培养和单细胞培养。
植物组织培养的类型（依外植体分类）
植株培养、器官培养、组织培养、胚培养、细胞培养、原生质体培养
植株培养：
种子培养以及通过各种类型培养后都要经过植株培养阶段。
茎段培养成苗、胡萝卜形成层（分生组织）培养、胚培养。
4、植物组织培养的特点
①培养条件可以人为控制
②繁殖系数大，培养周期短，提供规格一致的优质种苗或脱病毒种苗
③管理方便，有利于实现工厂化生产和自动化控制
二、材料的培养和驯化（植物组培快繁过程：
初代培养、继代培养、生根、驯化移栽）
（一）、培养包括：
初代培养、继代培养、生根培养
1．培养的含义将接种的植物材料置于培养室，提供光照、温度等条件进行培养的的过程。
2．培养方法
（1）固体培养法是现在最常用的方法。
虽然该方法设备简单，易行，但养分分布不均，生长速度不均衡，并常有褐化中毒现象发生。
（2）液体培养法由于液体中氧气含量较少，所以通常需要通过搅动或振动培养液的方法以确保氧气的供给，采用往复式摇床或旋转式摇床进行培养，其速度一般为50-100r/min，这种定期浸没的方法，既能使培养基均一，又能保证氧气的供给。
3．培养步骤 初代培养；继代培养；生根培养。
（1）初代培养芽、茎段、叶片等外植体在离体培养条件下诱导愈伤组织、侧芽或不定芽、胚状体过程，即接种某种外植体后，最初的几代培养。
目的：
获得无菌材料和无性繁殖系。
无性繁殖系包括：
芽丛、不定芽、胚状体、原球茎。
培养基：
诱导或分化培养基。
培养基中CTK多，IAA少。
类型：
依植物离体分化过程类型不同分为5种（罗士韦）
无菌短枝型：
顶芽、侧芽和带芽的茎段在CTK刺激下形成的茎梢直立向上生长形成一个枝条（单芽茎段培养继代扩繁），生根培养形成试管苗。
此过程无愈伤组织产生如同微型扦插。
生长素维持顶端优势，内源生长素高。
加细胞分裂素也很难打破，浓度过高对生长不利，畸形或玻璃化等，所以一芽总是形成一个枝条。
如葡萄、马铃薯。
丛生芽增殖型：
顶芽、侧芽和带芽的茎段在CTK刺激下形成的茎梢直立向上呈小灌木丛状（茎段培养继代扩繁），获得较多嫩茎梢，生根培养形成试管苗。
此过程无愈伤组织产生如同微型扦插。
加细胞分裂素打破顶端优势，在顶芽存在时，也可使侧芽生长，促进腑芽分枝或丛生。
如：
苹果，甘蔗等。
（顶芽或腋芽发育：
采用外源的细胞分裂素，可促使具有顶芽或没有腋芽的休眠侧芽启动生长，从而形成一个微型的多枝多芽的小灌木丛状的结构。
在几个月内可以将这种丛生苗的一个枝条转接继代，重复芽-苗增殖的培养，并且迅速获得多数的嫩茎。
然后将一部分嫩茎转移到生根培养基上，就能得到可种植到土壤中去的完整的小植株。
这种繁殖方式也称作微型扦插，它不经过发生愈伤组织而再生，所以是最能使无性系后代保持原品种特性的一种繁殖方式。
适宜这种再生繁殖的植物，在采样时，只能采用顶芽、侧芽或带有芽的茎切段，其它如种子萌发后取枝条也可以。
用靠培养定芽得到的培养物一般是茎节较长，有直立向上的茎梢，扩繁时主要用切割茎段法，如香石竹、矮牵牛、菊花等。
但特殊情况下也会生出不定芽，形成芽丛。
）
器官发生型：
外植体诱导出愈伤组织，愈伤组织分化出芽、芽丛，切割芽丛，继代培养长出大量芽丛，生根培养形成试管苗。
或外植体直接诱导出芽、芽丛，切割芽丛，继代培养长出大量芽丛，生根培养形成试管苗。
（不定芽的发育：
在培养中由外植体产生不定芽，通常首先要经脱分化过程，形成愈伤组织的细胞。
然后，经再分化，即由这些分生组织形成器官原基，它在构成器官的纵轴上表现出单向的极性（这与胚状体不同）。
多数情况下它先形成芽，后形成根。
另一种方式是从器官中直接产生不定芽，有些植物具有从各个器官上长出不定芽的能力如矮牵牛、福禄考、悬钩子等。
当在试管培养的条件下，培养基中提供了营养，特别是提供了连续不断植物激素的供应，使植物形成不定芽的能力被大大地激发起来。
许多种类的外植体表面几乎全部为不定芽所覆盖。
在许多常规方法中不能无性繁殖的种类，在试管条件下却能较容易地产生不定芽而再生，如柏科，松科，银杏等一些植物。
许多单子叶植物储藏器官能强烈地发生不定芽，用百合鳞片的切块就可大量形成不定鳞茎。
在不定芽培养时，也常用诱导或分化培养基。
用靠培养不定芽得到的培养物，一般采用芽丛进行繁殖，如非洲菊、草莓等。
）
胚状体发生型：
外植体（器官、游离单细胞、小孢子）产生胚状体，直接成苗；或外植体产生愈伤组织后再产生胚状体直接成苗。
原球茎（增殖）型：
原球茎是兰科植物的一种再生方式，它最初是指兰花种子萌发过程中的形态学构造。
类原球茎是兰科植物离体培养时形成的一种特殊结构，呈扁球状体，基部着生假根，能够切割进行扩增繁殖，若不切割即分化出完整植株。
从起源上讲，有人认为类原球茎是来源于体细胞胚；
也有人认为类原球茎发生过程是介于体细胞胚发生与器官发生之间的另一形态发生途径。
原因是胚性细胞团分裂形成原球胚、叶原基、茎尖的过程中始终没有看到胚根的出现，这类似于不定芽、小鳞茎等的发生过程。
另：
原球茎是缩短的、呈珠粒状的、由胚性细胞组成的、类似嫩茎的器官。
对兰花等植物，茎尖或侧芽培养会形成原球茎结构（基部带有根状体的小球状结构，形态结构上与种子萌发时形成的原球茎相似，故也称原球茎），将这些原球茎切成数块后继代培养，每一块又形成若干个原球茎。
另外，兰花种子为无胚乳种子，种子无菌萌发及其它外植体（如叶片切段）也可诱导出原球茎。
原球茎长到一定大小就开始出芽长根形成完整植株。
这种方式也称原球茎增殖，是兰花商业化繁殖的主要方法。
中国兰如建兰（MS、B5），热带兰如蝴蝶兰、文心兰、大花蕙兰、卡特利亚兰等均用此法增殖（Knudson、MS等）。
（2）继代培养更换新鲜培养基来繁殖同种类型的材料（愈伤组织、芽）。
目的：
扩繁无根苗，最后达到边繁殖边生根。
扩繁方法：
以几何级数增加，可切割茎段、分离芽丛、胚状体、原球茎。
切割茎段常用于有伸长的茎梢、茎节较明显的培养物。
这种方法简便易行，能保持母种特性。
培养基常是MSo基本培养基；分离芽丛适于由愈伤组织生出的芽丛。
培养基常是分化培养基。
若芽丛芽较小。
可先切成芽丛小块，放入MS培养基中，待稍大时，再分离开来继续培养。
增殖使用的培养基对于一种植物来说每次几乎完全相同，由于培养物在接近最良好的环境条件，营养供应和激素调控下，排除了其它生物的竞争，所以能够按几何级数增殖。
在快速繁殖中初代培养只是一个必经的过程，而继代培养则是经常性不停的进行过程。
但在达到相当的数量之后，则应考虑使其中一部分转入生根阶段。
从某种意义上讲，增殖只是贮备母株，而生根才是增殖材料的分流，生产出成品。
培养基：
基本培养基或分化培养基
（3）生根培养生根培养可采用1/2或1/4MS培养基，全部去掉细胞分裂素，并加入适量的生长素（NAA、IBA等）。
诱导生根方法：
①将新梢基部浸入（50~100）×10-6IBA溶液中处理4~8h；②在含生长素的培养基中培养4~6d；③直接移入含有生长素的生根培养基中。
前2种方法对新生根的生长发育则更为有利，第3种对幼根的生长有抑制作用。
原因是当根原基形成后较高浓度生长素的继续存在，不利于幼根的生长发育，不过这种方法比较可行。
其他方法：
①延长在增殖培养基中的培养时间；②有意降低一些增殖倍率，减少细胞分裂素的用量（即将增殖与生根合并为一步）；③切割粗壮的嫩枝在营养钵中直接生根，此方法没有生根阶段。
切下的插穗可用生长素溶液浸蘸处理，但此方法只适于一些容易生根的植物。
另外少数生根困难需要在培养基中放置滤纸桥，使其略高于液面，靠滤纸的吸水性供应水和营养而诱发生根。
从胚状体发育成的小苗，常有原先已分化的根，这种根可不经诱导生根阶段而生长。
但因经胚状体途径发育的苗数特别多个体较小，所以也常需要一个低浓度或没有激素的培养基培养的阶段，以便壮苗生根。
4、外植体成苗途径（汇总）通过哪种途径再生与试验材料和培养基尤其添加的激素有关。
植物快速繁殖的类型与方式
（二）.驯化移栽（实验课）
组织培养工厂化育苗生产流程生产流程简图：
三、培养物的不良表现及改进措施
（一）、初始培养阶段
1.培养物水浸状、变色、坏死、茎断面附近干枯
可能原因：
表面杀菌剂过量，消毒时间过长，外植体选用不当（部位或时期）。
改进措施：
调换其他杀菌剂或降低浓度，缩短消毒时间，试用其他部位，生长初期取材。
2.培养物长期培养几乎无反应
可能原因：
基本培养基不适宜，生长素不当或用量不足，温度不适宜。
改进措施：
更换基本培养基或调整培养基成分，尤其是调整盐离子浓度，增加生长素用量，试用2,4-D，调整培养温度。
3.愈伤组织生长过旺、疏松，后期水浸状
可能原因：
激素过量，温度偏高，无机盐含量不当。
改进措施：
减少激素用量，适当降低培养温度，调整无机盐（尤其是铵盐）含量，适当提高琼脂用量增加培养基硬度。
4.愈伤组织太紧密、平滑或突起，粗厚，生长缓慢
可能原因：
细胞分裂素用量过多，糖浓度过高，生长素过量。
改进措施：
减少细胞分裂素用量，调整细胞分裂素与生长素比例，降低糖浓度。
5.侧芽不萌发，皮层过于膨大，皮孔长出愈伤组织
可能原因：
枝条过嫩，生长素、细胞分裂素用量过多。
改进措施：
减少激素用量，采用较老化枝条。
（二）、继代培养阶段
1.苗分化数量少、速度慢、分枝少、个别苗生长细高
可能原因：
细胞分裂素用量不足，温度偏高，光照不足。
改进措施：
增加细胞分裂素用量，适当降低温度，改善光照，改单芽继代为团块（丛芽）继代。
2.苗分化过多，生长慢，有畸形苗，节间极短，苗丛密集，微型化
可能原因：
细胞分裂素用量过多，温度不适宜。
改进措施：
减少或停用细胞分裂素一段时间，调节温度。
3.分化率低,畸形,培养时间长时苗再次愈伤组织化
可能原因:
生长素用量偏高,温度偏高。
改进措施：
减少生长素用量，适当降温。
4.叶粗厚变脆
可能原因：
生长素用量偏高，或兼有细胞分裂素用量偏高。
改进措施：
适当减少激素用量，避免叶片接触培养基
5.再生苗的叶缘、叶面等外偶有不定芽分化出来
可能原因：
细胞分裂素用量偏高，或表明该种植物适于该种再生方式。
改进措施：
适当减少细胞分裂素用量，或分阶段地利用这一再生方式
6.丛生苗过于细弱，不适于生根或移栽
可能原因：
细胞分裂素浓度过高或赤霉素使用不当，温度过高，光照短，光强不足，久不转移，生长空间窄。
改进措施：
减少细胞分裂素用量，免用赤霉素，延长光照时间，增强光照，及时转接，降低接种密度，更换封瓶纸的种类。
7.幼苗淡绿，部分失绿
可能原因：
无机盐含量不足，PH值不适宜，铁、锰、镁等缺少或比例失调，光照、温度不适。
改进措施：
针对营养元素亏缺情况调整培养基，调好PH值，调控温度、光照。
8.幼苗生长无力、发黄落叶、有黄叶、死苗夹于丛生苗中
可能原因：
瓶内气体状况恶化，PH值变化过大，久不转接导致糖已耗尽，营养元素亏缺失调，温度不适，激素配比不当。
改进措施：
及时转接、降低接种密度，调激素配比和营养元素浓度，改善瓶内气体状况，控温。
（三）、生根阶段
1.培养物久不生根，基部切口没有适宜的愈伤组织
可能原因：
生长素种类、用量不适宜；生根部位氧气不良；生根程序不当；PH值不适，无机盐浓度及配比不当。
改进措施：
改进培养程序，选用适宜的生长素或增加生长素用量，适当降低无机盐浓度，改用滤纸桥液培养生根等。
2.愈伤组织生长过快、过大，根茎部肿胀或畸形，几条根并联或愈合。
可能原因：
生长素种类不适，用量过高，或伴有细胞分裂素用量过高，生根诱导培养程序不对。
改进措施：
调换生长素种类或几种生长素配合使用，降低使用浓度减少愈伤。
四、组培常见问题及对策
（一）污染
含义：
在组培过程中培养基和培养材料滋生杂菌，导致培养失败的现象。
1.污染原因：
细菌、真菌为病源菌；污染途径有外植体带菌，培养基及器皿灭菌不彻底，操作人员未遵守操作规程，环境不清洁。
2.预防措施
（1）防止材料带菌：
（初代培养阶段）
选材：
不同材料带菌不一样；选嫩材料，地上部材料，预培养；
取材时间：
避免阴雨天在室外采集外植体，春秋季进行组培；
严格外植体灭菌：
材料一次不能消毒过多；材料消毒时间控制好。
（2）防止人为污染（初代与继代培养阶段）：
接种用具灭菌彻底；严守无菌操作规程；保持培养室清洁
（二）褐变的原因及预防（初代培养阶段）
1.含义：
外植体褐变是指在接种后，其表面开始褐变，有时甚至会使整个培养基褐变的现象。
它的出现是由于植物组织中的多酚氧化酶被激活，而使细胞的代谢发生变化所致。
在褐变过程中，会产生醌类物质，它们多呈棕褐色，当扩散到培养基后，就会抑制其它酶的活性，从而影响所接种外植体的培养。
2.褐变的原因
（1）植物品种（基因型）：
在不同品种间的褐变现象是不同的。
由于多酚氧化酶活性上的差异，因此，有些花卉品种的外植体在接种后较容易褐变，而有些花卉品种的外植体在接种后不容易褐变。
因此，在培养过程中应该有所选择，对不同的品种分别进行处理。
（2）生理状态：
一般来说，幼嫩的组织在接种后褐变程度并不明显，而老熟的组织在接种后褐变程度较为严重。
（3）季节：
冬季褐变少，夏秋季褐变重。
（4）培养基成分：
浓度过高无机盐使某些观赏植物的褐变程度增加，此外，细胞分裂素的水平过高也会刺激某些外植体的多酚氧化酶的活性，从而使褐变现象加深。
培养基成分
（5）培养条件不当如果光照过强、温度过高、培养时间过长等，均可使多酚氧化酶的活性提高，从而加速被培养的外植体的褐变程度。
3.褐变的防止措施
（1）选择适宜的外植体：
最好选择生长旺盛的外植体，可使褐变现象明显减轻。
（2）控制培养条件：
加活性炭或暗处培养。
（3）连续转接培养：
对容易褐变的材料可间隔12-24h的培养后，再转移到新的培养
基上，这样经过连续处理7-l0d后，褐变现象便会得到控制或大为减轻。
（4）先液体培养再固体培养：
（5）加抗氧化剂：
（VC、PVP、牛血清等）
（6）加活性炭：
0.1~0.5％活性炭对防止褐变有明显效果，尤其在茎尖和胚培养时。
（7）取材季节避开夏秋季
（三）玻璃化的原因及预防
1.玻璃化现象含义：
是组培特有的一种生理失调或生理病变。
形态解剖学特点：
玻璃苗矮化肿胀，节间很短或无节，叶片水渍状半透明，皱缩或纵向卷曲，脆弱。
无栅栏组织仅有海绵组织。
生理生化特点：
含水量高，叶绿素、蛋白质、纤维素和木质素等物质含量低，一些酶的性发生了改变。
2.形成原因：
产生玻璃化苗的因素主要有激素浓度、琼脂用量、温度、离子水平、光照时间、通风条件等。
（1）植物品种在不同的种类、品种间，试管苗的玻璃化程度也有所差异。
（2）激素浓度尤其CTK增加或CTK╱IAA高。
细胞分裂素的主要作用是促进芽的分化，打破顶端优势，促进腋芽发生，因而玻璃化苗也表现为茎节较短、分枝较多的特点。
使细胞分裂素增多的原因有以下几种：
一是培养基中一次性加入过多细胞分裂素，比如6—BA、ZT等；
二是细胞分裂素与生长素比例失调，细胞分裂素含量远远高于生长素，而使植物过多吸收细胞分裂素，体内激素比例严重失调，试管苗无法正常生长，而导致玻璃化；
三是在多次继代培养时愈伤组织和试管苗体内累积过量的细胞分裂素。
在初级培养相同的培养基，最初的几代玻璃化现象很少，多次继代培养后，便开始出现玻璃化现象，通常是继代次数越多玻璃化苗的比例越大。
（3）渗透势较低，通风条件不好，透气性差，瓶内湿度大：
玻璃化可能是对培养基内水
分状态不适应的一种生理变态。
琼脂浓度低，离子种类及比例不适。
（4）光弱和光照时间短：
不同植物对光照要求不同，满足植物的光照时间，试管苗才能生长正常。
大多数植物在10～12h光照下都能生长良好，光照时数大于15h时，玻璃化苗的比例明显增加。
（5）温度高：
（6）琼脂浓度低：
培养基中琼脂浓度低时玻璃化苗比例增加，水浸状严重，苗向上长。
随着琼脂浓度的增加，玻璃化苗比例减少，但由于硬化的培养基影响了养分的吸收，试管苗生长减慢，分蘖亦减少。
因此，琼脂的浓度一定要适当。
（7）通风条件：
试管苗生长期间，要求有足够的气体交换，气体交换的好坏取决于生长量、瓶内空间、培养时间和瓶盖种类。
在一定容量的培养瓶内，愈伤组织和试管苗生长越快，越容易形成玻璃化苗。
如果培养瓶容量小，气体交换不良，易发生玻璃化。
愈伤组织和试管苗长时间培养，不能及时转移，容易出现玻璃化苗。
组织培养所用瓶盖有棉塞、锡箔纸、滤纸、封口纸、牛皮纸、塑料膜等，其中棉塞、滤纸、封口纸、牛皮纸通气性较好，破璃化苗的比例较低；而锡纸不透气，影响气体交换，玻璃化苗增加。
用塑料膜封口时，玻璃化苗剧增。
3.玻璃化防止措施：
（1）适当控制培养基的溶质水平：
增加无机盐成分，适当提高蔗糖和琼脂浓度，减少含氮化
合物的用量，降低培养基的水势（即提高培养基的渗透势）。
（2）适当降低CTK和GA的浓度：
考虑加入适当的脱落酸。
（3）增加自然光照；增加容器通气，降低培养温度。
控制温度，适当低温处理，避免过高的培养温度，在昼夜变温交替的情况下比恒温效果好。
试验发现，玻璃苗放于自然光下几天后，茎、叶变红，玻璃化逐渐消失，因自然光中的紫外线能促进试管苗成熟，加快木质化。
（4）加入其他物质（如活性炭、多效唑、CCC）
（5）药物防治：
青霉素G钾（2－6mg/l）可防治菊花。
但不同植物不同条件下结果可能相反，更有效的玻璃化控制有待进一步研究。
四、试管苗增殖率的估算（继代培养阶段计算）
由于试管苗在接近理想的条件下生长分化，不受季节限制，并有人为提供的外源植物激素的促进，增殖速度很快。
在生长分化中经过几个周期的培养通常按接种的繁殖体块数，或按培养瓶计算，看看能得到多少块中间繁殖体，或得到了多少瓶繁殖体，这两种方法都比较准确。
但不能简单地按接种1个芽，培养后能数出多少个芽来，或按应能再切出多少块供再接种的材料来计算。
有了每一周期需要多少天，每一周期每一瓶能接种多少瓶（每周期都能稳定地达到），每瓶有多少苗，这几个基本数字，就可以根据几何增加的原理，按下面简单的公式计算出年增殖率的理论值：
Y=mxn
y：
年增殖率；x：
每周期增殖的倍数；
n：
全年可增殖的周期数：
365/每一周期的天数（从接种当天到下次接种的当天）；
m：
母瓶数乘以母瓶株数
从这一公式看出，培养周期愈短、每次增殖的倍数愈高，年增殖总倍数就更高。
只要每年能增殖8-10次，每次增殖3-4倍以上，就可以满足快速繁殖的要求。
例：
从100瓶开始，每瓶有10株苗，那么即使每次增殖3倍，每次45d，一年可增殖8次，年底即可达65.6万瓶，即656万株苗，许多植物都远远超过这一数值。
当然这是一理论值，它会受到许多因素的制约。
例：
现有组培苗10瓶，增殖周期为1个月，增殖倍数为4，每瓶产出8株苗，则年增殖苗数理论值为10×8×412。
五、培养反应的观察与统计：
1、愈伤组织的观察与统计出愈率（％）＝产生愈伤组织材料总数／接种材料总数
2、芽的观察与统计快繁倍数＝一瓶能转接出的瓶数
3、根的观察与统计20天生根率（％）＝20天生根苗数／接种苗数
4、移栽的观察与统计30天移栽成活率＝30天成活苗数／移栽总数
六、需注意的其他问题：
1、离体繁殖的适用范围
2、离体繁殖的遗传变异与控制：
外源生长调节剂、继代培养、增殖方式
思考题：
1.植物再生成苗途径?
2.污染、褐变和玻璃化产生的原因及预防对策？
3.如何估算试管苗增殖率？
4.利用植物组织培养进行快速繁殖的方法步骤？
参考资料：
实用植物组织培养技术教程（修订本）曹孜义刘国民主编（甘肃科学技术出版社出版
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