仪器分析实验讲义.docx

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仪器分析实验讲义

5.4分光光度法测定双组分混合物含量

5.4.1实验目的

1．掌握单波长紫外—可见分光光度计的使用；

2．学会用解联立方程组的方法，定量测定吸收曲线相互重叠的二元混合物。

5.4.2实验原理

根据朗伯—比尔定律，用紫外—可见分光光度法很容易定量测定在此光谱区内有吸收的单一成分。

由两种组分组成的混合物中，若彼此都不影响另一种物质的光吸收性质，可根据相互间光谱重叠的程度，采用相对应的方法来进行定量测定。

如：

当两组分吸收峰部分重叠时，选择适当的波长，仍可按测定单一组分的方法处理；当两组分吸收峰大部分重叠时，则宜采用解联立方程组或双波长法等方法进行测定。

解联立方程组的方法是以朗伯—比尔定律及吸光度的加合性为基础，同时测定吸收光谱曲线相互重叠的二元组分的一种方法。

从图中可以看出，混合组分在λ1的吸收等于A组分和B组分分别在λ1的吸光度之和Aλ1A+B，即

Aλ1A+B=ελ1A·bcA+ελ1B·bcB

同理，混合组分在λ2的吸光度之和Aλ2A+B应为

Aλ2A+B=ελ2A·bcA+ελ2B·bcB

若首先用A，B组分的标样，分别测得A，B两组分在λ1和λ2处的摩尔吸收系数ελ1A，ελ2A和ελ1B，ελ2B，当测得未知试样在λ1和λ2的吸光度Aλ1和Aλ2后，解下列二元一次方程组：

Aλ1=ελ1A·bcA+ελ1B·bcB

Aλ2=ελ2A·bcA+ελ2B·bcB

即可求得A，B两组分各自的浓度cA和cB。

一般来说，为了提高检测的灵敏度，λ1和λ2宜分别选择在A，B两组分最大吸收峰处或其附近。

5.4.3实验用品

SP-2100型分光光度计、比色皿（1cm）一套、吸量管、容量瓶、烧杯等；

0.020mol/LKMnO4溶液（含0.5mol/LH2SO4和2g/LKIO4）；

0.020mol/LK2Cr2O7溶液（含0.5mol/LH2SO4和2g/LKIO4）。

5.4.4实验内容

1．分别取一定量的0.020mol·L-1KMnO4溶液，稀释配制成浓度为0.0008mol·L-1，0.0016mol·L-1，0.0024mol·L-1，0.0032mol·L-1和0.0040mol·L-1的标准系列溶液。

2．分别取一定量的0.020mol·L-1K2Cr2O7溶液，稀释配制成浓度为0.0008mol·L-1，0.0016mol·L-1，0.0024mol·L-1，0.0032mol·L-1和0.0040mol·L-1的标准系列溶液。

3．在教师的指导下，开启分光光度计。

4．绘制上述10种标准系列溶液在375~625nm范围内的吸收光谱图，并测定它们在440nm和545nm处的吸光度。

5．测定教师给定的试样在440nm和545nm处的吸光度。

5.4.5数据记录与结果处理

1．由实验步骤4所得的吸光度，分别求得KMnO4和K2Cr2O7在440nm和545nm处的摩尔吸收系数ελ1A，ελ2A和ελ1B，ελ2B。

2．由实验步骤5所测得的吸光度A440和A545列出二元一次方程组，求得cA和cB的浓度。

5.4.6思考题

1．今有吸收光谱曲线相互重叠的三元体系混合物，能否用解联立方程组的方法测定它们各自的含量？

2．设计一个用双波长法测定本实验内容的实验方案0

5.5紫外分光光度法测定三氯苯酚存在下苯酚的含量

5.5.1.实验目的

1．掌握等吸光度测量法消除干扰的原理及实验方法。

2．掌握应用紫外分光光度计的基本操作和进行定量分析的方法。

5.5.2实验原理

苯酚是工业废水中的一种有害物质，如果流入江河，会使水质受到污染，因此在检测饮用水的卫生质量时，需对水中酚含量进行测定。

苯具有环状共轭体系，由π→π*跃迁在紫外吸收光区产生三个特征吸收带：

强度较高的E1带，出现在180nm左右；中等强度的E2带，出现在204nm左右；强度较弱的B带，出现在255nm。

有机溶剂、苯环上的取代基及其取代位置都可能对最大吸收峰的波长、强度和形状产生影响。

具有苯环结构的化合物在紫外光区均有较强的特征吸收峰，在苯环上的部分取代基（助色团）使吸收增强，而苯酚在270nm处有特征吸收峰，在一定范围内其吸收强度与苯酚的含量成正比，符合Lambert-Beer定律，因此，可用紫外分光光度法直接测定水中总酚的含量。

分光光度法测定多组份混合物时，通过解联立方程式，可求出各组份含量。

对吸收光谱相互重叠的两组份混合物，只要测定其中某一组份含量，可利用等吸光度测量法达到目的。

对含有N和M两组份的试样，设它们的吸收光谱相互重叠，如图6-1。

如要求测定M组份含量而消除N组份的干扰，则可从N的吸收光谱上选择两个波长λ1、λ2，在两波长处N组份具有相等的吸光度。

即对N来说，不论其浓度是多少，△AN＝Aλ1－Aλ2=0。

这样，可从两个波长测得M的吸光度差值△AM确定M组份的含量。

所选波长必须满足两个基本条件：

①两波长处干扰组份应具有相同的吸光度，即△AN等于零；②两波长处待测组份的吸光度差值△AM足够大。

为选择有利于测量的λ1、λ2，应先分别测绘它们单一组份时的吸收光谱，再用作图法确定λ1和λ2。

在待测组份M的吸收峰处或其附近选择一测定波长λ2，作一垂直于X轴的直线，交于干扰组份N的吸收光谱上的某一点，再从此点画一平行于X轴的直线，在组份N的吸收光谱上便可得到一个或几个交点，交点处的波长可作为参比波长λ1。

当λ1有几个位置可供选择时，所选择的λ1应能获得较大的待测组份的吸光度差值。

本实验中，三氯苯酚水溶液和苯酚水溶液的吸收光谱相互重叠，要求测定三氯苯酚存在下苯酚的含量。

5.5.3实验用品

岛津型紫外-可见分光光度计；石英比色皿2只，25毫升容量瓶7个，5毫升吸量管2支，25毫升烧杯2个；

苯酚水溶液（0.250g/L）。

2，4，6—三氯苯酚水溶液（0.10g／L）。

5.5.4实验内容

1．标准系列溶液的配制

取5只25mL容量瓶，分别加入1.00，2.00，3.00，4.00，5.00mL浓度为250mg·L-1的苯酚标准溶液，用去离子水稀释至刻度，摇匀。

计算其浓度（mg·L-1）。

2．吸收曲线的测定

苯酚水溶液及三氯苯酚水溶液吸收光谱的绘制：

分别用苯酚水溶液（30.0mg/L）及三氯苯酚水溶液（20.0mg/L），用1cm石英比色皿，以溶剂空白（去离子水）作参比，在220-350nm波长范围，用紫外分光光度计扫描测绘它们的吸收光谱。

得到两条吸收光谱绘于同一坐标上，选择合适的λ1及λ2。

在选择的波长λ1及λ2处，再用三氯苯酚溶液复测其吸光度是否相等。

3．苯酚水溶液的标准曲线绘制

在所选择的测定波长及λ2及参比波长λ1处，用去离子水作参比溶液，分别测定苯酚系列标准溶液中的吸光度，并得到两者的差值。

4．未知样的测定

在与上述测定标准曲线相同的条件下，取5.00mL样稀释至25.00mL测定含有三氯苯酚的未知试样溶液在两个波长下的吸光度和吸光度差。

5.5.5数据记录与结果处理

1．在同一坐标上绘制苯酚水溶液及三氯苯酚水溶液的吸收光谱，并选择合适的测定波长λ2及参比波长λ1。

以吸光度为纵坐标，波长为横坐标绘制吸收曲线，找出最大吸收波长λmax，并计算其εmax。

2．求出系列标准溶液在两波长处吸光度的差值△Aλ2-λ1。

以△Aλ2-λ1为纵坐标，苯酚水溶液的浓度c为横坐标，绘制标准曲线。

由未知试样溶液的△Aλ2-λ1值，从标准曲线上求得未知试样溶液中苯酚的浓度（mg／L）。

5.5.6思考题

1．紫外分光光度法与可见分光光度法有何异同？

2．紫外分光光度计与可见分光光度计的仪器部件有什么不同？

3．如需测定未知试样溶液中苯酚及三氯苯酚两组份的含量，应如何设计实验?

测量波长要如何选择？

附录：

UV-2450型紫外可见分光光度计使用操作指南：

1、打开仪器主机电源，再启动电脑。

2、点击电脑中的紫外分光光度计图标，启动紫外可见分光光度计。

3、点击界面工具栏中的“连接”按钮，仪器进行自检，自检通过后按“确定”按钮。

4、在窗口栏中选择测量方式，创建测定方法，选择[编辑]——[方法]，打开“光度测定方法向导”。

4.1设置测定波长——然后选择“点”，表示在固定波长点测定样品。

选择“范围”，表示在设置的波长范围内测量样品光谱的峰、谷、最大、最小或面积。

4.2设置方法创建校准曲线。

4.3输入文件的名称和信息。

5、输入样品信息：

在对话框中输入样品的ID和浓度。

6、测定：

在样品室中放入样品。

在标准样品测量时点击“标准表”，在未知样品测量时点击“样品表”。

7、测量完成后，保存图谱，关机。

5.11红外光谱法测定苯甲酸的结构

5.11.1实验目的

1．掌握红外光谱分析固体样品的制备技术。

2．了解如何根据红外光谱识别官能团，了解苯甲酸的红外光谱图。

5.11.2实验原理

将固体样品与卤化碱（通常是KBr）混合研细，并压成透明片状，然后放到红外光谱仪上进行分析，这种方法就是压片法。

压片法所用的碱金属的卤化物应尽可能的纯净和干燥，试剂纯度一般应达到分析纯，可以用的卤化物有NaCl、KCl、KBr、KI等。

由于NaCl的晶格能较大，不易压成透明薄片，而KI又不易精制，因此大多采用KBr或者KCl做样品载体。

由于氢键的作用，苯甲酸通常以二分子缔合体的形式存在。

只有在测定气态样品或非极性溶剂的稀溶液时，才能看到游离态苯甲酸的特征吸收。

用固体压片法得到的红外光谱中显示的是苯甲酸二分子缔合体的特征，在2400~3000cm－1处是O-H伸展振动峰，峰宽且散，由于受氢键和芳环共轭两方面的影响，苯甲酸缔合体的C=O伸缩振动吸收位移到1700~1800cm－1区（而游离C=0伸展振动吸收是在1710~1730cm－1区，苯环上的C=C仲展振动吸收出现在1480~1500cm－1和1590~1610cm－1），这两个峰是鉴别有无芳核存在的标志之一，一般后者峰较弱，前者峰较强。

5.11.3实验用品

带傅里叶变换红外光谱仪及附件、KBr压片模具及压片机、玛瑙研钵、红外烘箱等。

苯甲酸（分析纯）、KBr（分析纯）、无水乙醇等。

5.11.4实验内容

1．在玛瑙研钵中分别研磨KBr和苯甲酸至2μ细粉，然后置于烘箱中烘4~5h；烘干后的样品置于干燥器中待用。

2．取1~2mg的干燥苯甲酸和100~200mg的干燥KBr，一并倒入玛瑙研钵中进行研磨直至混合均匀。

3．取少许上述混合物粉末倒入压片模中压制成透明薄片，然后放到红外光谱仪上进行测试。

4．测定一个未知样的红外光谱图。

5.11.5数据记录与结果处理

1．解析苯甲酸红外谱图中的各官能团的特征吸收峰，并作出标记。

2．将未知化合物官能团区的峰位列表，并根据其他数据指出可能结构。

5.11.6思考题

1．测定苯甲酸的红外光谱，还可以用哪些制样方法？

2．影响样品红外光谱图质量的因素是什么？

5.16循环伏安法判断电极过程

5.16.1实验目的

1.了解电化学工作站仪器的基本构造和使用方法

2.掌握伏安扫描测定法,理解并掌握循环伏安法判断电极行为的原理和方法。

5.16.2实验原理

铁氰化钾溶液在循环伏安激励信号的作用下将发生氧化-还原反应：

O+e=R

峰电流可表示为

可见峰电流与被测物浓度成正比，与扫描速率v有关。

对一个氧化还原的可逆体系，氧化峰电流与还原峰电流之比：

氧化峰电位与还原峰电位之差：

Z为电极反应得失的电子数。

根据阳极峰电位和阴极峰电位之差和氧化峰电流与还原峰电流之比，可判断电极在铁氰化钾溶液中的可逆性。

5.16.3实验用品

仪器：

电化学分析仪（LK2005A，连接到计算机）；以铂电极为对电极，Ag|AgCl电极（或甘汞电极）为参比电极，玻碳电极为工作电极构成三电极系统。

试剂：

去离子水；无水乙醇（分析纯）；0.5mol/LKNO3溶液；1.00mmol/LK3Fe（CN）6溶液。

5.16.4实验内容

1.洗净电解池（小玻璃烧杯），加入0.5mol/LKNO3+1.00mmol/LK3Fe（CN）6溶液作为试液；

2.电极预处理：

用金相砂纸从粗到细逐渐磨光电极表面，再用Al2O3粉将铂电极表面抛光。

用丙酮、乙醇檫洗，用蒸馏水冲洗干净，用滤纸吸干电极面的水，将它接入电解池.接好各电极接线.

3.点击电化学系统图标，打开操作界面。

在测量技术中选择CV（循环伏安法）方法，在测量参数中输入合适的参数，以扫描速度60mV/s扫描+0.80～－0.20V的循环伏安图2圈。

记录结果。

4.不同扫描速率下体系的循环伏安曲线及峰值：

以不同扫描速率：

10、40、60、80、100和200mV/s进行扫描；分别记录从+0.80～－0.20V扫描的循环伏安图。

注意每次扫描之间，为使电极表面恢复初始条件，应将电极提起后再放入溶液中或用搅拌子搅拌溶液，等溶液静止1～2min再扫描。

5.选择LSV（线性扫描伏安法），改变扫描速度（从10mV/s～500mV/s）进行扫描.

5.16.5数据记录与结果处理

1.计算阳极峰与阴极峰的电位差和氧化峰电流与还原峰电流之比，判断其电极的行为。

2.计算该体系的得失电子数.

3.处理LSV的数据.

5.16.6思考题

1.该电极反应的可逆性如何？

2.从LSV数据能说明哪些问题？

实验归一化法测定分析环己烷、甲苯、正己烷混合物

一、实验原理

色谱定性分析的任务是确定色谱图上个色谱峰代表何种组分，根据各色谱峰的保留值进行定性分析。

在一定的色谱操作条件下，每种物质都有一确定不变的保留值（如保留时间），故可以作为定性分析的依据，只要在相同色谱条件下，对已知纯样和待测试样进行色谱分析，分别测量各组分峰的保留值，若某组分峰的保留值与已知纯样相同，则可以认为两者为同一物质。

这种色谱定性分析方法要求色谱条件稳定，保留值测定准确。

确定了各个色谱峰代表的组分后，即可对其进行定量分析。

色谱定量分析的依据是混合物中各组分的质量含量与其相应的响应信号（峰高或峰面积）成正比，利用归一法即可计算出各组分的含量。

二、实验步骤

1、纯样保留时间的测定分别用微量进样器吸取环己烷，甲苯，正己烷纯样0.1μL，直接由进样口注入色谱仪，测定各样品的保留时间。

2、环己烷、甲苯、正己烷混合物的分析用微量进样器吸取混合物样品0.2μL注入色谱仪，连续记录各组分的保留时间、峰高和峰面积。

3、数据处理混合物中各组分的保留时间与环己烷、甲苯、正己烷的保留时间做对照，若保留时间一致，表明混合物中有该成分存在。

归一法计算，由峰面积确定各组分质量含量。

4、实验完毕后，首先关闭氢气、空气，主机电源，待分离柱温降至室温后再关闭载气，关闭计算机。

附：

GC气相色谱仪及气相色谱工作站操作方法

1、打开载气（氮气）钢瓶，调节减压阀压力至0.3MPa，调节柱后载气压力为0.04MPa。

2、打开主机电源，设定好升温程序。

3、打开空压机，调节出口压力致0.2，通过空气流量调节阀调节空气流量为280（13.5圈）。

4、打开氢气钢瓶，调节氢气流量为30mL/min（0.05MPa）。

5、打开计算机，进入A5000气相色谱工作站。

5、点火按下点火开关约8秒即可。

6、用微量进样器吸取样品注入色谱仪（同时按下采样按钮）即可开始采样分析。

7、分析完毕后，点击“结束采样”即停止采样。

8，进入“分析计算”，进行“谱图积分”，“归一法计算”，即可得到各组分保留时间和相应质量含量。

9、工作完毕后按关机程序关闭仪器。

反相HPLC分析茶叶主要成分

一、实验目的

1、学习高效液相色谱仪的基本操作方法。

2、了解高效液相色谱法在天然产物分析中的应用。

3、了解指纹图谱的概念

二、实验原理

高效液相色谱法是以液体作为流动相，借助于高压输液泵获得相对较高流速的液流以提高分离速度、并采用颗粒极细的高效固定相制成的色谱柱进行分离和分析的一种色谱方法。

在高效液相色谱中，若采用非极性固定相，如十八烷基键合相，极性流动相，即构成反相色谱分离系统。

反之，则称为正相色谱分离系统。

反相色谱系统所使用的流动相成本较低，应用也更为广泛。

中国是茶的故乡，制茶、饮茶已有几千年历史，名品荟萃，主要品种有绿茶、红茶、乌龙茶、花茶、白茶、黄茶。

茶有健身、治疾之药物疗效，又富欣赏情趣，可陶冶情操。

茶叶的营养价值和药理作用是与它的化学成分分不开的。

它的化学组成约有四百多种，其中对人体营养价值与药理作用关系比较密切的是多酚类、生物碱和维生素。

茶多酚类物质是茶叶主要的呈味物质，苦味。

茶叶中含量比较高，总量占干茶物质的18％～36％，是茶叶药用价值的最主要的物质基础，具有降血脂、抗肿瘤、抗脂质过氧化、抗菌和抗病毒、调节免疫功能等功效。

茶多酚实际上是多种多酚类化合物的总称，其中最重要的是儿茶素类化合物，它占茶多酚总量的50％～70％。

茶叶指纹图谱是利用茶内含物质的秘密、茶树遗传的密码、用图谱的方式来表述具有不同特性的茶叶,可包含种类、产区、树龄、特性、制成品的年份等。

本实验用HPLC对茶叶的主要成分进行分离，是建立茶叶指纹图谱的基础。

实验过程中有可能会带入一些杂质，因此实验结束后必须清洗柱子。

三、仪器与试剂

Agilent1100高效液相色谱仪，50ul微量注射器。

甲醇（色谱纯）；乙腈（色谱纯）；甲酸（分析纯）。

四、实验步骤

1.色谱条件

色谱柱：

色谱柱：

XB-Phenyl,5μm,4.6x150mm

柱温：

室温

流动相：

乙腈+1%甲酸

检测器：

DAD。

检测波长：

276nm

进样体积：

20µL定量环，实际注射每次可控制在50µL。

梯度洗脱：

2.待测溶液的配制

取两种不同的绿茶，分别标记为绿茶1、绿茶2。

各取约0.8000g，用50mL沸水冲泡，分别在10min、30min取上清液，过0.45μm滤头，即得样品1（绿茶1冲泡10min）、样品2（绿茶1冲泡30min）、样品3（绿茶2冲泡10min）、样品4（绿茶2冲泡30min）。

3.色谱测定

（1）按操作规程开启电脑，开启脱气机、泵、检测器等的电源，启动Agilent1100在线工作软件，设定操作条件。

流量为1.00mL/min。

（2）待仪器稳定后，开始进样。

将进样阀柄置于“LOAD”位置，用微量注射器吸取混合物溶液50µL，注入仪器进样口，顺时针方向扳动进样阀至“INJECT”位置，此时显示屏显示进样标志。

（3）记下各组分色谱峰的保留时间及峰面积。

并将测试报告打印成htm式，以便直接贴到实验报告中。

（4）实验完毕，清洗系统及色谱柱。

五、思考题

1.流动相在使用前为什么要用砂芯漏斗过滤？

2.清洗柱子时，为什么要一步步清洗？

3.应如何选择流动相和柱子?

应如何控制样品的pH?

4.实验中遇到哪些实际问题?

有何体会