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黄艳维的论文

云南中医学院

2010届攻读学士学位本科生毕业论文（设计）

何首乌发酵产物中磷脂含量的测定

学院中药学院

学生姓名黄艳维

专业食品科学与工程

实习单位功能食品教研室

导师姓名赵荣华（副教授）

2010年5月10日

目录

摘要2

1.引言2

2.仪器与试剂3

2.1仪器3

2.2试剂3

2.3试剂的配制3

3.实验方法3

3.1样品的预处理3

3.2磷脂的提取流程3

3.3测定波长的选择4

3.4加热时间的选择4

3.5卵磷脂标准曲线的制备4

3.6精密度实验5

3.7稳定性实验6

3.8样品测定6

3.9何首乌提取工艺的优化7

3.9.1提取时间的选择7

3.9.2比较冷提和热提对磷脂提取率的影响8

3.9.3提取溶剂用量的选择8

4磷脂的研究9

5结论与讨论12

参考文献:

13

致谢14

生首乌及其炮制品的磷脂含量测定

实习学生：

黄艳维（2006级食品科学与工程）

指导教师：

赵荣华（副教授云南中医学院功能（健康）食品实验室）

摘要:

目的用紫外分光光度法测定生首乌及其炮制品中磷脂的含量，并对其进行分析。

结果：

700nm处有最大吸收峰，线性范围在0.017mg/ml～0.085mg/ml,最佳显色时间20分钟，最适显色温度70℃，吸光度与浓度间有良好的线性关系，生首乌中磷脂含量为1.311%。

何首乌炮制品中磷脂的含量低于生品何首乌中磷脂的含量。

关键词:

何首乌;何首乌炮制品;磷脂;钼蓝比色法;含量测定

1.引言

何首乌为蓼科植物何首乌Polygonummultiflo2rumThunb.的干燥块根，是常用中药材之一!

养血益肝,固精益肾,健筋骨,乌髭发,为滋补良药[1]。

具有解毒,消痈,润肠通便之功效,黑豆汁制后则能补肝肾、益精血、乌须发、强筋骨,主治血虚萎黄、眩晕耳鸣,须发早白、腰膝酸软、肢体麻木、崩漏带下、久疟体虚。

生品性平，味苦涩、微甘，生津润燥，解毒散结；炮制后性变温，味转甘，具补肝肾、益精血、强筋骨、乌须发的作用。

二者均为临床常用中药饮片。

其炮制方法起源于唐代[２]。

其炮制方法不同又有生何首乌与制何首乌之分。

生首乌：

味苦；涩；性平。

具有润肠，解毒和截疟之功!

制何首乌：

味苦；甘；涩；性温。

具有补肝肾；益经血；壮筋骨；乌须发之效。

何首乌多星不规则纺锤形或团块状，长约5--15era，直径3—12em，外表红棕色或红褐色，有不整齐的纵沟，凹凸不平，多皱缩，并有横长皮孔及细根痕。

体重、质坚实、不易折断，断面淡红色或淡黄棕色，显粉性。

中心木部较大，周围伴有4—11个类圆形的异型维管束环列，形成“云锦状花纹”。

蒸过的何首乌片横断厦呈黄棕色至深褐色，星鲜明胶状光泽，“云锦花纹”明显[3]。

何首乌中主要含有蒽醌类、二苯乙烯苷、卵磷酯、糖类等成分。

卵磷脂类是何首乌中的重要活性成分，具有显著的医疗和保健功能。

卵磷酯是构成神经组织，非凡是脑脊髓的主要成分，也是血球和其他细胞膜的原料，能促进血流中细胞的新生，具有良好的滋补作用，在降血脂，抗动脉硬化，促智，抗衰老，保肝，增强免疫功能等方面具有重要作用[４]。

本文采用钼蓝比色法按文献[4]中的方法对何首乌炮制前后磷脂含量进行了比较分析。

2.实验材料、仪器与试剂

2.1材料：

生何首乌：

云南省禄劝县产何首乌生品

制何首乌：

取云南省禄劝县产何首乌生品经各种炮制方法制得

2.2仪器：

DFY-800摇摆式高速中药粉碎机（浙江温岭市林大机械有限公司）；UV-480ZH型紫外可见分光光度计（上海尤尼柯仪器有限公司）；电子分析天平（北京赛多利斯仪器系统有限公司）；精密电子天平（江苏常熟双杰测试仪器厂）；数显恒温水浴锅（国华电器有限公司）：

电热鼓风干燥箱（重庆实验设备厂）；电炉

2.3试剂:

卵磷脂（进口试剂）；钼酸铵（成都化学试剂厂）；无水醋酸钠；抗坏血酸（天津市化学试剂三厂）；浓硫酸（云南杨林工业开发区汕滇药业有限公司）；高氯酸；氯仿（云南杨林工业开发区汕滇药业有限公司）；甲醇（天津市风船化学试剂科技有限公司）

2.4试剂的配制：

消化剂：

将140ml浓硫酸加入到盛有250ml蒸馏水的容量瓶中，摇匀后再加入32.5ml高氯酸，用蒸馏水定容至500ml。

显色剂：

临用时A液与B液9：

1混合

A液：

钼酸铵1.25g,无水醋酸钠4.1g，用蒸馏水溶解稀释至500ml。

B液：

抗坏血酸10g,用蒸馏水稀释至100ml

卵磷脂标准溶液的配制：

精密称取卵磷脂85mg,用氯仿定容至10ml,得卵磷脂储备液,精密吸取上储备液0.1ml于10ml容量瓶中,用氯仿一甲醇（5:

1）混合溶剂稀释至刻度,成标准溶液。

（卵磷脂0.0085mg/ml）

3.实验方法

3.1样品的预处理

何首乌样品粉碎过60目筛,于60℃干燥4h后置干燥器中备用。

3.2磷脂的提取流程

精密称取何首乌样品粉末0.2g，精确加入10ml氯仿-甲醇（5:

1）混合溶剂，称重，回流提取2h,冷却后补充溶剂至原重，过滤，滤渣再加10ml氯仿-甲醇（5:

1）混合溶剂回流提取2h，合并2次滤液。

3.3测定波长的选择

精密吸取标准品液和供试品液各1ml于25ml比色管中，加消化剂0.4ml,在电炉上消化至无色澄明,冷却后精密加入显色剂4ml,70℃水浴保温；取1ml氯仿一甲醇（5:

1）混合溶剂,同法操作,作空白对照。

分光光度计上于400～800nm波长之间进行扫描。

结果标准品和供试品均在700nm处有最大吸收，确定700nm为测定波长。

3.4加热时间的选择

精密吸取标准品液和供试品液各1ml于25ml比色管中，加消化剂0.4ml,在电炉上消化至无色澄明,冷却后精密加入显色剂4ml,70℃水浴保温0，5，10,15,20,25,30min；取1ml氯仿一甲醇（5:

1）混合溶剂,同法操作,作空白对照。

在700nm波长处分别测定吸收值，结果显示在10min时有最大吸收，见表1.

表1不同加热时间所对应的吸光度

加热时间（min）供试品吸光度标准品吸光度

00.5400.335

50.5420.341

100.5590.348

150.5520.344

200.5490.341

250.5430.341

300.5410.338

3.5标准曲线的制备：

分别吸取标准溶液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6ml于具塞试管中,加消化剂0.4ml,在电炉上消化至无色澄明,冷却后精密加入显色剂4ml,70℃水浴保温10min后取出冷却至室温,取1ml氯仿一甲醇（5:

1）混合溶剂,同法操作,作空白对照,以空白液调零，于700nm波长处测定吸收值.

表2.不同取样量的吸光度

标液体积（ml）取样量（mg/ml）

吸光度

0.20.017

0.40.034

0.60.051

0.80.068

1.00.085

1.20.102

1.40.119

1.60.136

0.157

0.331

0.527

0.698

0.881

1.461

1.538

1.735

3.6精密度实验

精密吸取标准溶液1ml,按上述方法连续测定6次，，测定吸光度并计算RSD值，结果测得吸光度分别为1.092，1.093，1.094，1.090，1.094，1.093，平均值＝1.093，RSD值=0.151%（n=6）.以上结果表明，本试验方法精密度良好。

3.7稳定性实验

取同一份供试品溶液，每间隔5min测定一次吸光度，结果表明，该样品体系在20min内稳定性良好，见表3

表3不同时间所对应的吸光度

间隔时间（min）吸光度平均值RSD值（n=7）

50.653

100.648

150.647

0.6282.69%

200.645

250.622

300.598

350.586

3.8样品测定

精密吸取样品液1ml，置于具塞试管中，加入0.4ml消化液，在电炉上消化至无色澄清，冷却后加入4ml显色剂，70℃水浴保温10min，取1ml氯仿一甲醇混合溶剂,同法操作,作空白对照,于700nm波长处测定吸收值

表4

黑豆蒸制时间（h）0.51.01.52.02.53.03.5

称样量（g）0.20520.20110.21030.20540.22130.21460.2217

磷脂含量（mg/ml）0.0630.0590.0570.0560.0510.0480.035

磷脂含量（%）0.6140.5870.5420.5450.4610.4470.316

表5

何首乌样品称样量（g）吸光度磷脂含量（mg/ml）磷脂含量（%）

生品0.20121.3760.1321.311

清蒸何首乌0.20560.6950.0670.652

黑豆蒸0.21330.8720.0840.788

何霉变10.21240.5460.0520.490

何霉变20.22080.5490.0530.481

何霉变30.20530.5370.0520.507

何表皮0.20360.6280.0600.589

何根皮0.21260.6110.0590.577

毛霉0.21230.7330.0700.659

表土（洋）真菌C0.20230.7930.0760.751

表土（洋）真菌B0.20590.6150.0590.575

3.9何首乌提取工艺的优化

3.9.1提取时间的选择

提取时间的选择固定提取溶剂用量，改变提取时间，考察了对磷脂的提取情况。

结果如图所示。

结果表明，提取时间为3h时，磷脂类化合物可较好地提取.

表6

提取时间（h）磷脂含量（mg/g）

0.50.699

1.00.759

1.50.821

2.00.899

2.50.961

3.01.17

3.51.16

4.01.19

3.9.2比较冷提和热提对磷脂提取率的影响

精密称取0.2g同一何首乌样品粉末4份，精确加入10ml氯仿-甲醇（5:

1）混合溶剂，称重，其中2份回流提取4h；另2份震荡后放置24h.对4份提取液进行磷脂含量测定，结果回流提取的磷脂含量较高，表明热回流提取较冷浸提取更完全。

3.9.3提取溶剂用量的选择

采用氯仿-甲醇（5:

1）混合溶剂对何首乌中磷脂类化合物进行提取，固提取时间，考察了试剂用量在5—35mL范围内磷脂类化合物提取情况，结果如图l所示。

图l表明，提取溶剂用量大于10．0mL，提取效果较好.

表7

提取溶剂（ml）磷脂含量（mg/g）

50.627100.936

150.974

201.047

251.093

301.075

4．磷脂的研究

4.1磷脂

磷脂是含磷酸根的单脂衍生物，属于天然类脂化合物。

在植物的种子、动物血液、脏器、蛋黄及细菌中与油脂并存，是构成细胞基本结构的必需物质，也是生命的基础物质之一。

至今，人们已发现磷脂几乎存在于所有机体细胞中。

植物磷脂主要存在于油料种子，并与蛋白质糖类脂肪酸维生素等物质以结合状态存在，是一类重要的油脂伴随物。

磷脂酰胆碱（phosphotidylcholine，PC）是磷脂中起重要营养保健作用的主要成分，具有非常重要的生物学活性。

磷脂酰胆碱，俗名卵磷脂，由甘油基、脂肪酸基团、磷酸基和胆碱构成。

不仅为人体生长发育提供必需的磷元素，而且还是胆碱和必需脂肪酸的主要来源，而胆碱对于人脑的发育形成和维持脑正常功能不可缺少。

它还含有亲水的磷脂基团和亲油的脂肪酸基团，是典型的两性化合物，有着良好的乳化功能。

在医学上有很高的医用价值，能预防和治疗高血脂、高胆固醇、脂肪肝，在保护细胞膜、抗氧化、抗衰老等方面起着重要作用。

另外，在化工、轻工、食品工业等方面应用很广。

4.2磷脂的种类及结构

按照分子结构可将磷脂分为两大类，即鞘磷脂和磷酸甘油酯。

甘油磷脂是含磷酰基有机物的甘油二脂肪酸酯，即甘油中的三个羟基有两个与脂肪酸结合成酯，另外一个与含磷的有机物以酯键相结合，其结构通式[6]如下：

式中R1、R2代表脂肪酸残基，其碳原子数一般在12～18之闻，置以偶碳数居多。

R1、R2W以相同也可以不同，但磷脂2位（B位）大多为不饱和脂肪酸，如油酸、亚油酸、亚麻酸及花生四烯酸等。

根据分子结构中X的不同，磷脂又可分为多种类型[７]，常见的磷脂种类及结构如下：

4.3磷脂的理化性质

一般的磷脂产品呈黄色，这通常是卵磷脂、脑磷脂以及肌醇等的混合物。

纯净的磷脂为白色蜡状固体，在低温下可结晶。

磷脂不耐高温，磷脂易吸水、易氧化。

易溶于很多有机溶剂，如氯仿、乙醚、石油醚、苯、乙醇等.

4.3.1磷脂的提取方法

目前，磷脂的提取方法主要有：

溶剂法、超声波提取法、微波辅助萃取法、超临界C02法等。

在天然产物中，磷脂多与蛋白质以复合物的形式存在，要提取磷脂，首先要破坏这种复合物。

所用的溶剂必须对脂质有较好的溶解能力且能破坏这种复合物。

非极性溶剂如氯仿、乙醚等不能破坏脂蛋白复合物，而极性溶剂如甲醇、乙醇等对脂质的溶解能力较差，因此把极性溶剂与非极性溶剂结合使用则可以扬长避短。

在提取磷脂时常选用二元混合溶剂，溶剂的种类、比例以及用量对磷脂的提取率有很大影响。

中药材中磷脂成分的提取分离方法普遍采用氯仿一甲醇混合溶剂提取[8]，李树立等[9]用乙醚、氯仿、石油醚、氯仿一甲醇混合溶剂作溶剂提取食品中磷脂，研究的不同溶剂对磷脂提取率的影响，得到氯仿一甲醇混合溶剂的提取率最高。

4.3.2磷脂的分析方法

钼蓝比色法是将样品与金属氧化物灰化，试样中的有机磷变为磷酸盐，加酸溶解而得磷酸根，再加入钼酸盐生成磷钼酸盐，磷钼酸盐被还原而产生钼蓝，其颜色深浅与磷的含量成正比关系，由此可进行比色定量。

万楚筠[10]等对国标（GB5537--1985）中钼蓝比色法测定磷脂的方法进行了改进，采用混酸湿法消解样品，并用抗坏血酸代替具有致癌性的硫酸肼作为显色还原剂。

对显色反应条件进行优化。

4.3.3磷脂的发展历史及展望

1850年,德国人格林最先从鸡蛋的卵黄中单离出脂质,因其源于希腊语的“卵黄”,在1884年被命名磷脂。

而在此之前,磷脂大多是以鸡蛋和蛋黄的形式来使用的。

随后,人们又相继发现了与动植物脂质类似结构的磷脂,其中,胆囊中的含氮化合物的脂质因源于希腊语的胆汁被命名为胆碱,脑中的磷脂因源于希腊语的“头”而被命名为脑磷脂。

磷脂的化学研究证实,磷脂可在生物体中生成,并在人体发育中存在于所有的细胞中。

由以动物为来源获取的磷脂,最先被人们用于治疗佝偻病,镇静药,催眠剂,以及做为神经强壮药等医疗用制剂。

最初,这些以含有磷脂酰胆碱的所有的混合物都统称之谓磷脂。

从1910年,以磷脂及磷脂和可可混合物为基础的各种医药品在欧洲广泛地使用。

[8]

在食品业中,利用磷脂的乳化,分散,湿润以及改善食品的起泡性与操作性能,磷脂在人造奶油、起酥油、巧克力、面包、点心、饼干、太妃糖、糖果、冰激棱、奶油类、可可、速溶粉末食品、肉类产品及水产品等方面有极为广泛的应用。

利用磷脂中磷脂胆碱,磷脂酰肌醇,必需脂肪酸等营养源,以及磷脂对防止老化,改善质脂代谢,改善神经,肝脏,心脏血管系统等的机能,可作为营养健康食品的强化剂。

5结论与讨论

5.1关于磷脂的测定方法，文献报道较多。

如薄层扫描法，薄层色谱法，红外光谱法，31P棱磁共振光谱法等[20]但所需仪器都很昂贵，目前尚难推广普及。

本文采用钼酸铵比色法，方法简单、准确

5.2本方法是将样品中的磷脂通过用有机溶剂萃取而与无机磷化合物分离!

然后将磷脂转化为无机磷化合物!

用经典的钼蓝比色法测定磷脂含量方法简单!

快速!

便于操作!

准确度较高!

能满足日常检验工作的需要

5.3生何首乌与制何首乌相比可发现制何首乌中卵磷脂含量低于生何首乌，与文献报道相同[5]。

建议在何首乌的炮制过程中应注意炮制方法、工艺条件的选择，尽可能减少药用活性成分的损失。

5.4清蒸何首乌与黑豆汁伴蒸何首乌的磷脂含量不同。

黑豆汁伴蒸何首乌的磷脂含量大于清蒸何首乌，黑豆汁伴蒸炮制时间对制何首乌饮片中磷脂含量有较大影响，随蒸制时间的增加，制何首乌饮片中的磷脂含量减少。

5.5供试品样液在显色后应尽快进行测定,显色稳定性试验结果表明显色后在20min内稳定，过久放置会使磷脂含量降低。

参考文献：

[1]本草纲目

[2]赖荣汉,刘晓云,王毅兵.何首乌炮制沿革及工艺研究

[3]姚琥．何首乌的生药学鉴定[J]．中国药业，2007，l6

（2）：

59-61．

[4]李军，徐国均，徐路珊等．中药首乌类的研究．磷脂的含量测定[Ｊ]

中草药，1994,25（11）：

578-579

[5]马长华，王金星．何首乌炮制前后磷脂成分比较[Ｊ]中国中药志，1991,16（11）:

663．

[6]吴世芳.何首乌中磷脂类化合物的提取分离及分析方法研究[J]南昌大学,2007

[7]田志茗，安红，薛红艳．磷麟的特性、应用及化学改性[Ｊ]．表面活性剂工业，1998,（3）：

22-25．

[8]粮油加工与食品机械2003年第4期

[9]李树立，鞠国泉，庞津霞．食品中磷脂测定方法的探讨[Ｊ]食品工业科技，2004|，25（9）：

133—134．

[10]万楚筠，黄凤洪，李文林．抗坏血酸一钼蓝光度法测定油脂中磷脂含量地研究[Ｊ]．中国油脂，2006，3l（4）：

46-49．，

[11]施邑屏,核磁共振光谱及薄层色谱分析针剂大豆卵磷脂[J]．分析化学．199I，19（7）：

733，

致谢

转眼间大学四年的学习生涯即将结束，回想所经历的点点滴滴，让我觉得每天都过得很充实、很快乐、很富足，所以要感谢母校给我如此美好的回忆。

本论文是在导师赵荣华教授的悉心指导之下完成的。

三个月来，导师渊博的专业知识，严谨的治学态度，精益求精的工作作风，诲人不倦的高尚师德，朴实无华、平易近人的人格魅力对我影响深远。

导师不仅授我以文，而且教我做人，虽历时三个月，却赋予我终生受益无穷之道。

“授人以鱼，不如授之以渔”赵老师正是这样以言传身教来教导着我们。

他教会我如何查找文献、阅读文献，教会我基本的科研思维和方法，是赵老师孜孜不倦的教诲和细心指导，使我学到了很多从书本上无法学到的知识、生活经验以及实验技巧，让我在大学生活的最后三个月受益匪浅，本论文从选题到完成，每一步都是在赵荣华老师的指导下完成的，倾注了导师大量的心血,借此机会，向他表示我诚挚的敬意和衷心的感谢，谢谢您——赵老师，您辛苦了！

其次，我还要感谢本次论文中给我很大帮助的师兄师姐们，因为有了他们,我在本次论文的设计中遇到的困难才能得以及时的解决，感谢这三个月来他们对我的爱护、包容和帮助，在此我向他们致以诚挚的敬意和衷心的感谢！

然后，我还要感谢大学四年来所有的老师，为我们打下了扎实的专业知识基础；同时我还要感谢所有的同学们，正是因为有了你们的支持和鼓励。

此次毕业设计才会得以顺利完成。

最后，感谢各位论文评阅专家和教授在百忙之中抽出时间来评阅我的论文，并给予我了莫大的帮助和指导。

2006级食品科学与工程

黄艳维

2010年5月10日