0901班杨科勉精氨酸激酶的表达及纯化模板1.docx

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0901班杨科勉精氨酸激酶的表达及纯化模板1

精氨酸激酶（AK）的表达及其纯化

报告题目

精氨酸激酶（AK）的表达及其纯化

作者姓名

王小珍

班级学号

0802/2008114010223

指导教师

汪劲松

完成时间

2011年7月

生物学实验教学中心

目录

引言2

1实验材料、试剂、仪器4

2实验方法5

2.1配制LB液体培养基5

2.2活化菌种5

2.3扩大培养5

2.4IPTG诱导AK的表达6

2.5蛋白质提取6

2.6His-tagNi亲和层析法纯化融合蛋白6

2.7SDS-PAGE电泳鉴定纯化程度7

3结果与分析8

3.1层析谱图8

3.2SDS-PAGE电泳带型分析9

总结10

参考文献11

致谢12

精氨酸激酶（AK）的表达及其纯化

王小珍

（指导老师：

汪劲松）

（湖北师范学院生命科学学院生物科学0802班湖北黄石435002）

摘要：

目的：

研究精氨酸激酶（AK）的表达及其纯化。

方法：

用含卡那霉素的LB液体培养基活化并扩大培养菌种，利用IPTG诱导精氨酸激酶（AK）的表达，经离心、超声波破壁获得AK粗提液。

粗提液用His-tagNi亲和层析纯化，用SDS-PAGE电泳鉴定纯化结果。

结果：

层析谱图典型，SDS-PAGE电泳带型清晰，实验已分离得到了一定含量的AK，而且纯化程度较好

关键词：

精氨酸激酶（AK）表达亲和层析纯化电泳鉴定

精氨酸激酶（AK）的表达及其纯化

王小珍

（指导老师：

汪劲松）

（湖北师范学院生命科学学院生物科学0802班湖北黄石435002）

引言

精氨酸激酶

无脊椎动物的精氨酸激酶（Argininekinase,AK）（ATP:

N-精氨酸磷酸转移酶E.C.2.7.3.3）类似于脊椎动物中的肌酸激酶（creatinekinase，CK）（ATP:

N-肌酸磷酸转移酶E.C.2.7.3.3），是细胞代谢中的磷酸激酶，它将Mg2+ATP上的磷酸基转移到精氨酸上，产生磷酸精氨酸和Mg2+ADP，在无脊椎动物的能量代谢中起着重要作用。

AK在体内催化反应方程式如下：

Mg2++ADP+Argininephosphate←→Mg2++ATP+Arginine

某些物种的精氨酸激酶的晶体结构已经被解析出来，AK是由一个小的α螺旋组成的N端结构域和一个大的C端结构域组成的，C端结构域与Glu合成酶的C端结构域相似，8股串起来的反平行β折叠被7个α螺旋所包绕。

过渡态类似物的结合部位不在两个结构域之间，而是在C端结构域的内部。

如图所示：

亲和层析法

亲和层析法（aflinitychromatography）是分离蛋白质的一种极为有效的方法，它经常只需经过一步处理即可使某种待提纯的蛋白质从很复杂的蛋白质混合物中分离出来，而且纯度很高。

这种方法是根据某些蛋白质与另一种称为配体（Ligand）的分子能特异而非共价地结合。

His-tag所用层析凝胶的基质上连接了一个氨基三乙酸，可以与Ni离子结合，而Ni离子与融合蛋白的6Xhis之间产生吸引力，从而将带有组氨酸标签的融合蛋白与其他蛋白区分开来。

加样后，用平衡液可以将杂蛋白洗脱下来，再用可溶的竞争性螯合剂洗脱可回收靶蛋白。

电泳

电泳分离蛋白质是根据蛋白质在电场中的迁移差别达到分离目的的。

蛋白质样品加到一块预先制好的凝胶介质上，只要在凝胶的两端加上电场，就可以达到分离蛋白质的目的。

一般凝胶介质中的pH维持在碱性区，目的是使大多数蛋白质都带有负电荷，这样他们可以向阳极迁移。

本实验我们做了以下工作：

用含卡那霉素的LB液体培养基活化并扩大培养菌种，利用IPTG诱导精氨酸激酶（AK）的表达，经离心、超声波破壁获得AK粗提液。

粗提液用His-tagNi亲和层析纯化，用SDS-PAGE电泳鉴定纯化结果。

1实验材料、试剂、仪器

1.1材料

含AK基因的质粒的大肠杆菌

1.2试剂

LB液体培养基（100mL）：

蛋白胨1g，酵母提取物0.5g，Nacl1g

50mg/mL卡那霉素（kanamycin）

IPTG

BindingBuffer:

Tris（20mM），Nacl（500mM），加Hcl调PH至8.0

咪唑（10mM、250mM）

12%的分离胶（5mL）:

成分

体积（mL）

水

1.60

30%丙烯酰胺

2.00

1.5MTris（PH8.8）

1.30

10%SDS

0.05

10%过硫酸铵

0.05

TEMED

0.002

浓缩胶（2mL）

成分

体积（mL）

水

1.40

30%丙烯酰胺

0.33

1.0MTris（PH6.8）

0.25

10%SDS

0.02

10%过硫酸铵

0.02

TEMED

0.002

样品缓冲液

考马斯亮蓝R-250

1.3仪器

电子天平、高压灭菌锅、单人单面净化工作台、振荡培养箱、雪山制冰机、冷冻离心机、超声破壁仪、低温恒温槽电泳仪。

纯化过程中系列装置：

HL-2S恒流泵、HD-3紫外检测仪、SBS100数控计滴自动部分收集器、HD-A电脑采集器、电脑。

2实验方法

2.1配制LB液体培养基

称取NaCl1g、蛋白胨1g、酵母提取物0.5g，加入蒸馏水，配制成100mL的LB液体培养基，放入高压灭菌锅中灭菌。

2.2活化菌种

向6mLLB液体培养基中加入6uL50mg/mL卡那霉素（工作浓度为50ug/mL），再接入100uL表达菌种，于37℃摇床振荡培养8-12小时。

2.3扩大培养

向100mLLB液体培养基中加入100uL50mg/mL卡那霉素（工作浓度为50ug/mL），再加入6mL活化的菌液，于37℃恒温培养箱中培养2—3小时。

2.4IPTG诱导AK的表达

加入IPTG培养3---4h诱导表达。

2.5蛋白质提取

（1）将菌液置于离心管4℃，5000r/m离心10min。

（2）弃上清液，向沉淀中加入蒸馏水，用漩涡混合器混匀。

（3）4℃，5000r/m离心10min。

（4）弃上清，向沉淀中加入裂解液，用漩涡混合器混匀。

（5）在冰上进行10min（工作时间为2s，间隔为3s）的超声波破壁，一共三次，每两次间间隔5min。

（6）于4℃，12000rpm，离心10min，取上清，得到AK的粗提液。

2.6His-tagNi亲和层析法纯化融合蛋白

（1）用BindingBuffer预洗Ni柱。

（2）打开采集器；打开电脑蛋白核酸检测系统，保存文档并按开始采集。

将粗提液上柱。

（3）上样完后，用BindingBuffer（pH=8.0）淋洗。

待杂蛋白峰回落走平之后开始用不同梯度的咪唑（10mM、250mM）洗脱，在280nm处进行连续紫外检测，根据微电脑记录仪显示曲线。

分别收集峰值的洗脱液根据波峰对每管收集蛋白测活并留样、电泳检测纯化程度。

用BindingBuffer（pH=8.0）淋洗出的洗脱液称为穿流液，10mM咪唑洗脱出的洗脱液收集于①号管中，250mM咪唑洗脱出的洗脱液收集于③号管中，②号管洗脱液的收集时间介于①号管和③号管之间。

2.7SDS-PAGE电泳鉴定纯化程度

（1）安装双垂直板电泳槽；

（2）配12%的分离胶5mL，浓缩胶2mL；

（3）制样：

取样品30µL与样品缓冲液30µL混合，100℃加热5分钟；

（4）上样：

用微量注射器加样。

1—5孔的样品分别取自粗提液、穿流液、①号管、②号管、③号管;

（5）电泳：

在凝胶上加80V/cm电压，待染料进入分离胶后将电压提高到140V/cm继续电泳直到染料到达底部;

（6）固定和染色：

用考马斯亮蓝R-250染色液浸泡;

（7）脱色处理。

3结果与分析

3.1层析谱图

图1微电脑记录仪显示的His-tagNi亲和层析法纯化AK的谱图

分析以上的谱图知：

上样开始后，00:

00到00:

06阶段被洗脱下来的溶液的吸光度基本上是持平的，流经下来的大部分是BindingBuffer。

00:

06时吸光值基本上是沿直线上升的，直达至峰值，表明AK粗提液流经穿流柱后有蛋白质（杂蛋白）被洗脱下来了，经过一段时间后，杂蛋白的峰回落并且基本上是持平的，显示杂蛋白已经被洗脱完了。

最后，再分别用10mM、250mM的咪唑液洗脱，得到两次的峰值，显示AK已经被洗脱下来了，而且高浓度的咪唑液洗脱出来的目标蛋白（AK）纯度相对更高。

3.2SDS-PAGE电泳带型分析

图2SDS-PAGE电泳图

1—4孔的样品分别是依次取自粗提液、穿流液、①号管、②号管。

（1）箭头所指的为AK相对应的相对分子质量处。

（2）第2孔中的样品（穿流液）为大量除AK以外的杂蛋白，故第2个条带在箭头所指处比第一个条带颜色要浅，其余条带颜色的深浅基本上一致；

（3）第3孔中的样品是用低浓度的咪唑液（10mM）洗脱所得的，AK在此时才刚开始出现，故第3组在箭头所指处条带的颜色要较浅一些；

（4）第4孔中的样品是用高浓度的咪唑液洗脱下来的，AK的量大而且纯度很高，故第5组在箭头所指处条带的颜色很深。

总结

实验结果说明我们所做的实验已分离得到了一定含量的AK，而且纯化程度较好，即本实验结果较好，达到了预期的结果。

通过本实验，我已对蛋白质的提取、His-tagNi亲和层析法及SDS-PAGE电泳有了深刻的了解。

还见识并使用了一些以前未曾使用过的仪器。

本实验巩固并增加了我的理论知识，也锻炼了我的实验动手操作能力，更提高了我的实验素质及与他人协作的能力。

此次实验在老师的悉心指导和同学的帮助下，我学会了很多实验操作技术，也提升了实验技能。

以前做实验，人太多自己也缺乏主动性，所以很多步骤都会让同学代劳，此次实验我提醒自己不要偷懒，很多能参与的步骤我都是自己动手。

试验中我学会了用微量移液器及其使用时的注意事项。

为了弄清实验的目的、原理、步骤，我上网查了关于该实验的资料并查阅了相关论文，期间领略了大家的风范，受益匪浅。

过程中有不懂的内容我会与同学一同去探讨，有时我们也有争执但更多的是在摩擦中增进了友谊。

以前做实验每次我都抱着完成任务的心态，每次都是“混”过来的，此次实验在老师的倡导和同学们的影响下我端正了实验态度，几天下来觉得做实验其实没有想象中的那么无聊，踏实地探索反而会让自己的心境变得平静。

以前做实验我都是按图索骥而毫无思考，此次试验我学会了思考也学会了分析问题，也许这才是实验中最重要的。

参考文献

[1]雷婧,万华涛,汪劲松,王卫东,潘继承.精氨酸激酶C端结构域的克隆及其表达纯化[J].化学与生物工程,2010,27（6）

[2]周灵德,闫玉华,袁琳,李世普.大鼠骨粘连蛋白在大肠杆菌中的表达及纯化[J].武汉理工大学学报,2008,30（5）

[3]薄慧杰,卢长明,吴刚,武玉花.草胺膦抗性基因bar的原核表达与蛋白质纯化[J].西北农林科技大学学报,2007,35

（2）

[4]文征宇,侯文韬,杨龙雨,陈鹏.牛痘病毒拓扑异构酶I的原核表达与纯化[J].西北农林科技大学学报,2011,39（3）

致谢

衷心地感谢老师对本实验的细心指导，并感谢同组同学的合作帮助。

感谢老师在实验过程中的指导，老师规范了我们的实验操作。

记得有一次老师为我们示范了在无菌操作台中的操作步骤，之后还要求每位同学都要操作一次，每个同学操作完后老师都一一指正，让我们都能看清自己的不足并得到彻底的改正。

老师是一位认真负责的老师，记得老师刚开始介绍实验时，大多同学都听得心不在焉，老师多次停下来提醒我们跟上思路去熟悉实验背景及原理。

在以前的生化课上我一直都不太懂的知识点经老师一一指点后都已理得很清楚了。

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