细胞工程复习重点.docx

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细胞工程复习重点

细胞工程复习重点

第一代生物工程:

以酿酒为代表

近代生物工程：

以抗生素的大规模生产为标志

现代生物工程：

以DNA重组技术为代表

组成：

发酵工程、酶工程、细胞工程、基因工程、生物化学工程、蛋白质工程等

基因工程是核心和关键

细胞工程是基础

酶工程是条件

发酵工程和生物化学工程是手段

细胞工程：

应用生命科学理论，借助工程学原理与技术，有目的地利用或改造生物遗传性状，以获得特定的细胞、组织产品或新型物种的一门综合性科学技术。

探索期：

19世纪末至20世纪初

动物：

哈里森开创先河，青蛙神经细胞在淋巴液培养几周，长出神经纤维

植物：

温特，高特里特，诺比考特奠基人（高特里特，诺比考特同时离体培养胡萝卜）

特点：

对植物、动物组织细胞培养进行初步尝试，技术不完善，方法不成熟，成功率低。

动物细胞工程包括：

细胞培养技术；干细胞技术；细胞融合技术；染色体工程；胚胎工程技术（试管婴儿-体外受精、胚胎移植、胚胎分割等）；克隆技术。

细胞融合的概念：

采用自然或人工的方法使两个或几个不同细胞融合为一个细胞。

意义：

产生新的物种或品系。

干细胞（stemcells）工程和再生医学

干细胞特性：

具有一定或无限的增殖能力；具有向各个组织细胞分化的能力。

存在部位：

几乎任何一个组织器官中均存在干细胞。

染色体工程：

就是按人们的需要来添加、消减或替换生物的染色体的一种技术。

胚胎工程对哺乳动物的早期胚胎进行某种人为的工程技术操作获得人们所需要的成个体。

体外受精技术（试管婴儿）、胚胎移植（代孕母亲）、性别鉴定技术（疾病诊断）、胚胎冷冻技术。

细胞工程应用：

优质植物的快速培育与繁殖

优质动物资源的培养与繁殖，濒危动物的保护；

生产活性产物与药物；

新型动植物品种的培育；

再生医学；

转基因动植物生物反应器。

动物细胞培养

特征

哺乳动物细胞

植物细胞

微生物细胞

大小/um

10-100

10-100

1-10

生长形式

悬浮，贴壁

悬浮

悬浮

营养要求

很复杂

较复杂

简单

倍增时间/h

12-60

20-120

0.5-2

细胞分化

有

有限分化

无

环境影响

非常敏感

敏感

一般

细胞壁

无

有

有

调节方式

内部和外部

内部和外部

内部

动物细胞培养：

模拟动物体内生理环境使细胞分裂增殖的一种技术。

特点：

动物细胞培养（亦称组织培养）既有别于植物细胞培养，又与微生物的培养完全不同。

进化程度高、结构和成分更复杂，功能也更全面。

细胞培养：

将动物组织或细胞分散成单个细胞，在模拟机体内的生长环境条件下，使其在体外环境下（invitro）继续生长增殖的过程。

组织培养：

把生物机体内的组织、器官等在模拟体内环境的条件下使其存活、生长、繁殖、传代

原代培养或初代培养:

将机体取出的细胞或组织进行初次培养的过程。

初次培养的细胞大约增殖10代左右，这样的细胞称为原代细胞。

传代培养或继代培养:

从原代培养的细胞继续转接培养称为传代培养。

invitro条件下持续传代培养的细胞称为传代细胞。

Cellline:

从原代培养产生的能进行无限次传代的细胞群。

体外培养的动物细胞生长方式

1）贴附生长：

必须贴附于支持物表面才能生长，这种细胞叫贴壁依赖型细胞。

a.成纤维型细胞b.上皮型细胞

c.游走型细胞d.多形型细胞

2）悬浮生长：

在悬浮状态下即可生长，不需要贴附于支持物表面。

见于各种造血系统肿瘤细胞。

这种细胞叫非贴壁依赖型细胞。

基本技术

特点：

对环境敏感；营养要求高；容易污染。

培养工具：

实验室：

培养皿、培养瓶，培养板工业化：

如微载体。

培养条件：

7个

1）无菌条件：

取材之前最好用消毒液处理如75%的酒精消毒；处理材料的过程中在超净工作台里完成；培养的过程中可以添加一定的抗生素；此外培养液也需要无菌。

2）温度

与多数哺乳动物体内温度相似，培养细胞的最适温度为37oC+0.5oC。

高温对细胞的威胁大。

3）pH值

细胞培养的PH最适为7.2一7.4间，当PH低于6.0或高于7.6时，细胞的生长会受到影响，甚至导致死亡。

但是，多数类型的细胞对偏酸性的耐受性较强，而在偏碱性的情况下则会很快死亡。

4）气体

细胞的生长代谢自然离不开气体，容器空间中的O2及CO2足以保证细胞体内的代谢活动的进行

5）渗透压

细胞培养液的渗透压应控制在300mOsm;

6）营养成分

培养液里的成分要满足细胞进行糖代谢、脂代谢、蛋白质代谢及核酸代谢所需要的各种组成，如包括十几种必需氨基酸及其它多种非必需氨基酸、维生素、碳水化合物及无机盐类等。

常用的培养细胞的培养基：

合成培养基+天然培养基

天然培养基：

合成培养基

无血清培养基

7）水的质量

要求超纯水；至少要求3蒸馏水。

培养箱二氧化碳培养箱：

可满足pH,温度,饱和湿度等条件。

细胞培养技术

原代培养

是指直接从机体取下细胞、组织和器官后立即进行培养。

通常把第一代至第十代以内的培养细胞统称为原代细胞。

最常用的原代培养有组织块培养和分散细胞培养。

原代培养的实质就是初次培养，培养细胞不再分割，不换器皿

原代培养中的“代”非细胞的“代”数

不分割培养物不等于不换培养液

1）组织块培养

取材

容易培养的组织：

幼体组织尤其是胚胎组织

分化程度低的组织

肿瘤组织

注意：

a.存放时间不宜过长（<24h）b.严格无菌。

c.避开紫外照射、接触化学试剂及有害药物如碘、汞

缺点：

组织块有时候贴壁后容易再重新悬浮起来；不能得到数量较多的细胞。

优点：

对细胞损伤小；细胞可从组织块周围长出来，细胞状态维持较好。

实际应用较少。

2）组织消化培养（细胞培养）

a、将从机体某部位取下的组织经无菌处理后先放入一个培养皿中用Hank’s液洗3次—无菌取材

b、然后用小剪刀剪成约1立方毫米的组织块

c、加入适量PBS,用吸管吹打洗涤

处理材料

d.加入消化酶消化组织块—消化

e.静止3-5分钟,收集上清液,细胞计数.

f.1200转/分钟,离心5分钟使细胞沉淀

所使用的消化液

a.胰蛋白酶-EDTA

0.25%胰蛋白酶-0.04%EDTA,→37℃搅拌消化5-10min

适用：

细胞间质较少的软组织、传代细胞

注意：

钙、镁离子对其作用有抑止，配液时应注意;血清可终止其作用

b.胶原酶消化法

胶原酶（2000U/ml）,pH6.5→36.5℃1－48h

适用：

纤维组织、上皮组织、癌组织

注：

钙、镁离子对其作用无影响，血清不会抑活性

g.倒掉上清液,收集沉淀的细胞

h.加入适量培养基,转移入培养瓶中培养--培养

优缺点刚好与组织培养相反

2）细胞传代方法

根据细胞生长的恃点，传代方法有2种。

1.悬浮生长细胞传代

离心法传代：

离心（1000转/分）去上清，沉淀物加新培养液后再混匀传代。

直接传代法：

悬浮细胞沉淀在瓶壁时，将上清培养液去除l／2一2／3，然后用吸管直接吹打形成细胞悬液再传代。

2.贴壁生长细胞传代

采用酶消化法传代。

常用的消化液有0.25％的胰蛋白酶液。

培养过程

a.接种培养,及时更换培养液

b.常规检查

-检查细胞形态及活力（增殖能力）检查营养液pH及污染

1）污染途径：

操作方法、培养液、培养环境

2）污染的来源：

真菌污染；细菌污染；支原体污染

3）污染的处理

轻微污染:

可先用培养液冲洗细胞3-5遍,然后加2-3倍的抗生素于培养液中;

贴附生长细胞的生长过程

1潜伏期—细胞游离、贴壁、开始生长2对数生长期---细胞快速生长3平台期---细胞停止生长

3）细胞冻存和复苏

冻存和复苏的原则：

慢冻快融

细胞复苏方法

（l）从液氮中取出冷冻管，迅速投入37～38℃水浴中，使其融化（1分钟左右）。

（2）5分钟内用培养液稀释至原体积的10倍以上。

（3）低速离心10分钟。

（4）去上清，加新鲜培养液培养刚复苏的细胞。

细胞冻存方法

在细胞冻存时加入低温保护剂，能大大提高冻存效果。

常用的低温保护剂是DMSO，它是一种渗透性保护剂，可迅速透入细胞，提高胞膜对水的通透性，降低冰点，延缓冻结过程，能使细胞内水分在冻结前透出细胞外，在胞外形成冰晶，减少胞内冰晶，从而减少冰晶对细胞的损伤。

组织工程

定义:

应用生命科学和工程学原理，单独或组合地利用细胞、生物材料、细胞因子实现组织修复或器官再生的一门技术。

三要素

1，种子细胞：

自体分化细胞异体分化细胞干细胞

自体分化细胞

优点：

自体细胞可避免受者免疫系统的排斥反应。

缺点：

来源和数量有限，培养后老化

异体分化细胞

优点：

有望可解决种子细胞来源问题。

缺点：

免疫排斥、携带潜在病毒

干细胞

最理想的种子细胞

支架材料支架要求

良好的组织相容性—跟人体器官相容；

良好的表面活性—细胞容易存活；

具有可塑性（大部分）—弹性较好；

生物可降解性—降解容易；

具有三维立体结构—模拟体内环境；

无毒。

功能：

为细胞提供生存空间；

为细胞提供足够的营养成分和空气交换；

使细胞三维生长。

天然可降解生物材料

包括胶原，壳聚糖，透明质酸等。

优点是无毒，亲细胞，容易使细胞生长，增殖。

缺点：

重复性差，价格昂贵

来源：

结构分子：

作用：

用途：

人工可降解生物材料

包括聚乳酸，聚羟基乙酸，聚羟基丁酸酯等。

无机材料

n氧化铝陶瓷

n玻璃陶瓷

n羟基磷石灰

主要用于骨，牙齿硬质材料。

复合材料

3.细胞因子

皮肤细胞工程

干细胞

☞具有自我更新和分化潜能的细胞

分类

胚胎细胞的培养技术

形态：

小鼠干细胞形态上通常呈圆形，体积小，核大，核质比高，核仁多。

集落成

鸟巢状。

胚胎干细胞分化潜能的评价

流程

成体干细胞

胚胎干细胞继续进行分化，形成具有特定功能的干细胞，这些专门化的干细胞统称成体干细胞。

成体干细胞是指一群分布在成体组织或胎儿组织中尚未分化的、具有自我更新、并负有构建和补充某种组织的各种类型细胞潜能的干细胞.

几乎人体的任何一个组织和器官，均发现相应的干细胞，如神经干细胞，造血干细胞，间充质干细胞，皮肤干细胞等

一般特性：

组织中的细胞数量少；但有不同于分化细胞的表型特征；

有很强的增殖能力，但一般不能在体外无限增殖；

能分化成与该组织相关的分化细胞;

致瘤性（？

）。

间质干细胞---一种具有临床价值的干细胞

.定义存在于多种组织内的细胞亚群，细胞形态成纤维状，它们可以在体外扩增，在体外经诱导分化为成骨细胞、软骨细胞、肌腱细胞、神经细胞等

来源来源于中胚层，主要存在于全身结缔组织和器官间质中，例如人的外周血，脂肪，皮肤，肌肉，脑，胎肾，甚至存在于胎盘和羊水中；其中以骨髓中最多。

数量数量很少，混杂在其他成体细胞中

间充质干细胞的基本生物学特性

4.1形态

单个细胞：

呈成纤维外观，圆形或者纺锤形；其中以成纤维性居多；其中形态较小为增殖能力较强的干细胞；

细胞群：

呈集落状生长，细胞群呈心圆状或菊花状集落。

间充质干细胞的基本生物学特性

4.2表型特征

MSCs主要表达细胞表面蛋白CD105，CD73，CD90，不表达CD45，CD34等。

但这些表型并不是MSCs所特有的。

间充质干细胞的基本生物学特性

4.3增殖潜能

依据是自我更新，即单克隆形成能力；单细胞克隆能力越强，自我更新能力越强，增殖潜能越高。

4.4分化潜能

至少在体外能分化为：

成骨细胞，脂肪细胞及软骨细胞。

判定MSCs细胞的标准，需要从四个方面入手：

形态，表型，增殖和分化潜能。

其中以增殖和分化潜能作为主要指标，形态和表型作为参考。

5.1免疫逃逸和免疫抑制

免疫逃逸--MSCs在体内外可以逃过免疫系统的监视，也不激发同种异型反应，并能逃过杀伤性T细胞和NK细胞的溶解作用

MSCs是一种具有临床价值的干细胞

1）来源方便，扩增简单；

2）重复性高；

3）具有多向分化潜能；

4）不存在免疫排除的同时，还具有损伤修复能力。

肿瘤干细胞

定义存在于肿瘤组织中、极小一部分具有干细胞性质的细胞群体，是形成不同分化程度肿瘤细胞及肿瘤不断扩大的源泉。

极强的自我复制更新能力；

不断的分化能力，能够产生不同表型的肿瘤细胞，并在体内形成新的肿瘤；

具有与非致瘤细胞不同的表面标志；

在肿瘤中的所占的比例较少；

能对某些药物产生特异性的抗性。

研究肿瘤干细胞的意义

有望代替肿瘤细胞系，成为更加理想的肿瘤研究工具。

用于研究肿瘤的发生机制，有助于研究观念的转变及对肿瘤本质的理解。

为临床有效地诊断出恶性生长细胞的存在部位并进行有效治疗，提供了新的思路