western转膜条件讲解学习.docx
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western转膜条件讲解学习
western转膜条件
western转膜条件
蛋白来源:
RAW264.7总蛋白
蛋白名称(可保密):
一些转录因子
蛋白分子量:
40~70KD
WB用膜类型、孔径:
0.45NC
转膜方式(恒压、恒流):
湿转恒流400mA
转膜时间:
60~90min
PS.其实吧,以我的经验来看,除非目的蛋白特别小,或者特别大,不然转膜时间真的不是那么重要, 曾经因为失误,转了15min就拆下来了,但从丽春红染色来看,跟平常实验也没有太大的区别。
蛋白来源:
内皮细胞总蛋白
蛋白名称(可保密):
occludin&AKT
蛋白分子量:
65KD&56KD
WB用膜类型、孔径:
0.45PVDF
转膜方式(恒压、恒流):
湿转恒压100V
转膜时间:
60~70min
设备名字是“Bio-Radmini”。
蛋白来源:
乳鼠心肌细胞和成年鼠心肌组织总蛋白和核蛋白
蛋白名称(可保密):
保密
蛋白分子量:
65KD&55KD
WB用膜类型、孔径:
PVDF(预先用甲醇处理)
转膜方式(恒压、恒流):
半干转恒压12V
转膜时间:
30-40min
设备:
“Bio-Radmini”
建议:
最开始做过湿转(过夜的那种),太费事费时,效果也不如半干转。
蛋白来源:
293T细胞
蛋白名称(可保密):
蛋白分子量:
95KD&35KD
WB用膜类型、孔径:
PVDF
转膜方式(恒压、恒流):
湿转恒压90V-110V,控制电流不要超过300mA。
转膜时间:
70min
蛋白来源:
肿瘤手术标本
蛋白名称(可保密):
转录因子
蛋白分子量:
33KDa
WB用膜类型、孔径:
PVDF膜
转膜方式(恒压、恒流):
350mA恒流
转膜时间:
150min
转膜设备:
湿转Bio-Rad
说明:
相同条件曾用于数个30-70KDa的蛋白,都能成功转上,不过没有试缩短时间效果如何; 实验时没为转膜条件苦恼,倒是电泳时胶的浓度及时间根据不同分子量而有区别。
蛋白来源:
成纤维细胞
蛋白名称(可保密):
smad3
蛋白分子量:
54KDa
WB用膜类型、孔径:
PVDF膜
转膜方式(恒压、恒流):
350mA恒流
转膜时间:
150min
转膜设备:
湿转Bio-Rad
蛋白来源:
胰腺癌细胞
蛋白名称(可保密):
蛋白分子量:
16KDaand42KDa
WB用膜类型、孔径:
PVDF膜
转膜方式(恒压、恒流):
120V恒压
转膜时间:
90min
转膜设备:
湿转Bio-Rad
蛋白来源:
大鼠血管平滑肌细胞
蛋白名称(可保密):
保密
蛋白分子量:
72KD,42KD和22KD
WB用膜类型、孔径:
一般的PVDF膜
转膜方式(恒压、恒流):
湿转,恒流一张膜0.26A,两张膜0.3A。
转膜时间:
90min
设备:
“Bio-Radmini”
建议:
转膜缓冲液最多用3次,最好现用现配,我们用的没有加SDS,转的时候最好能用冰块一类的东西降一下温,这样转的效果要好一些,转的时候一定要把三明治每层之间的气泡除去,同时使滤纸大于膜,膜大于胶,以免烧坏电极。
蛋白来源:
大鼠PBMC
蛋白名称(可保密):
保密
蛋白分子量:
55KD
WB用膜类型、孔径:
0.22的PVDF膜
转膜方式(恒流):
湿转转膜时间:
60-90min
设备:
“Bio-Radmini”
建议:
转膜液用过两三次之后转膜效果就很差了其它按照常规就好了 其实0.22的膜一般不怕转过头以我们的经验,转膜时间、电压其实 也有很大范围的调整,并不是非要固定于哪一个最合适,曾经做过 一张膜转,17KD的和170KD的,按照170KD的条件,17KD的转膜也很好的。
蛋白来源:
人非小细胞肺癌细胞系
蛋白名称(可保密):
保密
蛋白分子量:
大于250kD
WB用膜类型、孔径:
milliporePVDF膜0.45um
转膜方式(恒压、恒流):
湿转,恒流0.3A。
转膜时间:
180min
设备:
“Bio-Rad”
建议:
电转保持电压在70V以上,保持低温,如果电压低过70就需要换缓冲液了。
蛋白来源:
白血病细胞
蛋白名称(可保密):
保密
蛋白分子量:
28KD
WB用膜类型、孔径:
0.45的NC膜
转膜方式(恒流):
湿转,90min,0.25A
设备:
“Bio-Rad”
建议:
海绵厚度要合适,一次转磨用的海绵太薄,导致三明治没夹紧,转膜后拿出来一看,marker都变得七扭八歪。
但是有前辈说垫的海绵太厚可能将胶压断,没经历过,不知道是不是会有这种情况。
蛋白来源:
肿瘤细胞
蛋白名称(可保密):
磷酸化蛋白
蛋白分子量:
10-200KDa
WB用膜类型、孔径:
milliporePVDF膜0.45um
转膜方式(恒压、恒流):
120v恒压
转膜时间:
120min
转膜设备:
湿转Bio-Rad
建议:
转膜缓冲液只用2次,基本都转上,5%BSA封闭,减少背景。
蛋白来源:
胰腺β细胞
蛋白名称(可保密):
******
蛋白分子量:
90-130KDa
WB用膜类型、孔径:
PVDF膜
转膜方式(恒压、恒流):
250mA恒流
转膜时间:
150min
转膜设备:
湿转
蛋白来源:
原核表达
蛋白名称(可保密):
保密
蛋白分子量:
38KD
WB用膜类型、孔径:
0.45NC
转膜方式(恒压、恒流):
湿转恒压:
100V
转膜时间:
120min
蛋白来源:
心脏
蛋白名称(可保密):
蛋白分子量:
220kDa,130kDa,70kDa,41kDa
WB用膜类型、孔径:
PVDF
转膜方式(恒压、恒流):
恒压
转膜时间:
70v120min,180min,5-6h
转膜设备:
伯乐湿转
建议改进方向(可选):
40kDa一下,70v,60-90min足够,40-70kDa90-120min即可。
70-120kDa,70v,120-180min足够,120-180kDa,180-240min,180kDa以上建议6h。
蛋白来源:
卵巢癌细胞膜蛋白
蛋白名称(可保密):
蛋白分子量:
53KD
WB用膜类型、孔径:
PVDF膜0.45um
转膜方式(恒压、恒流):
恒压
转膜时间:
80V100min
转膜设备:
湿转Bio-Rad
蛋白来源:
人宫颈癌HELA细胞总蛋白
蛋白名称(可保密):
β-actin
蛋白分子量:
42
WB用膜类型、孔径:
PVDF膜0.45um
转膜方式(恒压、恒流):
恒压
转膜时间:
504h
转膜设备:
湿转Bio-Rad
蛋白来源:
脑组织
蛋白名称(可保密):
蛋白分子量:
16KD、27KD、32KD、42KD
WB用膜类型、孔径:
PVDF0.22um
转膜方式(恒压、恒流):
半干转恒流1mA/cm2或2mA/cm2
转膜时间:
不定
转膜设备:
北京六一仪器
建议:
我共做了六个蛋白,所以总在想节约时间的方式。
在预试时我会观察电压数与转膜效率的关系,所以我不会按时间来定何时转完,而是按电压来定。
通过染胶来确定电压数与转移蛋白分子量上限的关系。
这样有的5分钟就转完了,不用多浪费时间。
并且六一的半干转膜仪随着使用次数的增多,效率也会下降,所以时间和转膜效率(尤其是使用后期)的关系并不稳定,单纯依靠时间有时会有问题。
蛋白来源:
CHOcell
蛋白名称(可保密):
酶原
蛋白分子量:
40KD
WB用膜类型、孔径:
0.22的PVDF膜(Biorad)
转膜方式(恒压):
100V,湿转,转膜时间:
60min。
设备:
Tanon(上海天能)
建议:
1. 转膜液现用现配,用完倒掉。
2. 转膜时间,电压可以适当调整。
分子量大或者小一些的蛋白,采用此条件一样转膜效率很高。
蛋白来源:
Hepg2
蛋白名称(可保密):
EGFR
蛋白分子量:
170kd
WB用膜类型、孔径:
pvdf0.45
转膜方式(恒压、恒流):
24V
转膜时间:
2个半小时
转膜设备:
伯乐半干转
蛋白来源:
肝癌细胞
蛋白名称:
HIF-1α
蛋白分子量:
120kD
WB用膜类型、孔径:
NC膜
转膜方式(恒压):
80伏,湿转转膜时间:
150分钟
设备:
“Bio-Radmini”
建议:
湿转,转膜液特别重要,否则会导致电压或者电流不稳影响转膜条带。
转膜均现配先用,不重复利用。
转膜时间一般是150分钟,80伏恒压。
经李春红染色,靠近蛋白胶的一侧膜上蛋白染色深,膜另外一面染色浅,说明蛋白未转过。
该湿转条件自己做过的蛋白分子量范围:
170-36kD。
蛋白来源:
心肌细胞总和膜
蛋白名称(可保密):
蛋白分子量:
128KD,100,60,55,43KD
WB用膜类型、孔径:
NC膜0.2um
转膜方式(恒压、恒流):
恒压
转膜时间:
70V200min
转膜设备:
湿转Bio-Rad
建议:
转膜液最好现配现现用,或配成母液,最好不重复使用,70V电压下,电流约154mA。
甲醇可以加到150ml。
对大分子量如200KD转膜时间延长6-8h。
蛋白来源:
肺脏
蛋白名称(可保密):
ICAM-1
蛋白分子量:
85~110KD
WB用膜类型、孔径:
0.22NC
转膜方式(恒压、恒流):
湿转恒流300mA
转膜时间:
120min
设备名字Bio-Radmini
一抗用的santacruz1mL包装的。
比例调整到1:
800做出很好的条带。
效价会一直降低的。
去年做的这个指标,今年夏天做就不行了。
蛋白来源:
成纤维细胞
蛋白名称(可保密):
蛋白分子量:
16KDa
WB用膜类型、孔径:
0.2umPVDF膜
转膜方式(恒压、恒流):
0.2A恒流
转膜时间:
65min
转膜设备:
湿转Bio-Rad
蛋白来源:
成纤维细胞
蛋白名称(可保密):
蛋白分子量:
28KDa
WB用膜类型、孔径:
0.2umPVDF膜
转膜方式(恒压、恒流):
0.25A恒流
转膜时间:
60min
转膜设备:
湿转Bio-Rad
蛋白来源:
人肿瘤细胞
蛋白名称(可保密):
保密
蛋白分子量:
80KD
WB用膜类型、孔径:
0.45umPVDF膜
转膜方式(恒压、恒流):
半干转移系统恒流,勿超过0.85mA/cm2,同时转多张膜电流需累加(串联)
转膜时间:
60-90min
设备:
Bio-Rad
其实有些东西并不是非常严格的,要转移的目的蛋白分子量小,那么转移的时间就短一些,反之,则长一点;蛋白量充足,可以多转一会,蛋白量较少,则要少转一下,免得蛋白穿膜而过到了滤纸上而前功尽弃。
蛋白来源:
人和鼠肝癌细胞总蛋白、胞浆、胞核蛋白
蛋白名称(可保密):
***
蛋白分子量:
17--116kd
WB用膜类型、孔径:
PVDF膜0.45um
转膜方式(恒压、恒流):
恒流200mA
转膜时间:
3h
转膜设备:
湿转北京六一24Dmini
蛋白来源:
COCOS7293T
蛋白名称(可保密):
保密
蛋白分子量:
80725652482518KD
WB用膜类型、孔径:
0.45umPVDF膜
转膜方式(恒压、恒流):
湿转90V电流约为230--280mA之间。
两张膜串联叠加。
转膜时间:
40min
设备:
Bio-Rad法码西亚
蛋白来源:
人肿瘤细胞
蛋白名称(可保密):
磷酸化蛋白
蛋白分子量:
30-60KDa
WB用膜类型、孔径:
pallNC膜0.45um
转膜方式(恒压、恒流):
恒流0.85-1mA/平方厘米膜
转膜时间:
60-90min
转膜设备:
北京六一半干转
建议:
转膜缓冲液用新鲜配制的,可先配成2倍的母液,转膜液的多少会影响电转的效率,一般将吸水纸润湿即可,不要和膜一起浸泡,这样效果很好。
蛋白来源:
人肝癌肿瘤细胞
蛋白名称(可保密):
notch
蛋白分子量:
60-120KDa
WB用膜类型、孔径:
pallNC膜0.45um
转膜方式(恒压、恒流):
恒流0.3A
转膜时间:
-20度冰柜120min
转膜设备:
湿转Bio-Rad
建议:
转膜缓冲液用新鲜配制的,可先配成10倍或5倍的母液,保持低温是转膜效果的一个保证,这样效果很好。
蛋白来源:
胶质瘤细胞总蛋白和核蛋白
蛋白名称(可保密):
蛋白分子量:
18KDa、36KDa、55KDa、98KDa
WB用膜类型、孔径:
NC膜PALL
转膜方式(恒压、恒流):
0.35恒流
转膜时间:
60min
转膜设备:
湿转Bio-Radmini
转缓液的配制有点讲究。
如果蛋白大于一百多,一般加入SDS,时间延长结果会更好些。
由于,目前试验的蛋白就都不大,所以,我们都采用不加SDS的转缓液,跑出来的条带也很整齐、干净。
蛋白来源大肠癌205
蛋白名称(可保密):
保密
蛋白分子量:
92kd,43kd
WB用膜类型、孔径:
0.45pvdf
转膜方式(恒压、恒流):
恒压
转膜时间:
90min
转膜设备:
湿转,天能。
蛋白来源:
大鼠脑组织
蛋白名称(可保密):
BDNF(28KDa)、Bactin(42KDa)、LaminB(72KDa),以及磷酸化蛋白(保密43KDa)
WB用膜类型、孔径:
PVDF(0.45)膜
转膜方式(恒压、恒流):
300mA恒流
转膜时间:
60min
转膜设备:
湿转Bio-RadMini
转膜缓冲液:
25%甲醛觉得这个浓度的甲醛可以有效降低电转的热量,而且使膜对蛋白的吸附效果较好,Marker转到膜上很鲜艳。
用立春红染色效果也很好。
蛋白来源:
表达产物
蛋白名称(可保密):
蛋白分子量:
29KDa
WB用膜类型、孔径:
PVDF
转膜方式(恒压、恒流):
0.3A恒流
转膜时间:
80min
转膜设备:
湿转Bio-Rad
蛋白来源:
celllysate,culturemedium
蛋白名称(可保密):
蛋白分子量:
15-50kD
WB用膜类型、孔径:
NC,PVDF,0.45um
转膜方式(恒压、恒流):
恒压,semi-dry
转膜时间:
about2hisokiftheproteinissmallandthevoltagecankeep100V,ifnotincreaseto3-4h。
转膜设备:
Bio-Rad
蛋白来源:
肺脏、肝脏等。
蛋白名称(可保密):
actin
蛋白分子量:
43kD
WB用膜类型、孔径:
NC膜PALL0.22um
转膜方式(恒压、恒流):
湿转恒流200mA
转膜时间:
45~60min
设备名字Bio-Radmini
用的santacruz分装和整装的都可以。
效价一般1:
1000-1:
3000左右,可稳定较长一段时间。
蛋白来源肺脏
蛋白名称(可保密):
保密
蛋白分子量:
19kd,35kd
WB用膜类型、孔径:
0.2pvdf
转膜方式(恒压、恒流):
恒流250
转膜时间:
150min
转膜设备:
湿转Bio-Radmini
蛋白来源:
大鼠血管
蛋白名称(可保密):
保密
蛋白分子量:
140kd
WB用膜类型、孔径:
0.45pvdf
转膜方式(恒压、恒流):
恒流,200mA
转膜时间:
210min
转膜设备:
湿转,北京六一
蛋白来源:
心肌
蛋白名称(可保密):
蛋白分子量:
90kDa,70kDa,12.6kDa
WB用膜类型、孔径:
NC
转膜方式(恒压、恒流):
恒压
转膜时间:
70v240min,120min,60min
转膜设备:
伯乐湿转
蛋白来源:
脑
蛋白名称(可保密):
保密
蛋白分子量:
16KD60KD
WB用膜类型、孔径:
16的用0.22的PVDF,60的用0.45的NC
转膜方式(恒压、恒流):
20V
转膜时间:
16的30min,60的90min
转膜设备:
Bio-Rad半干
蛋白来源:
子宫内膜癌组织
蛋白名称(可保密):
蛋白分子量:
156.8
WB用膜类型、孔径:
NC膜
转膜方式(恒压、恒流):
恒流400mA
转膜时间:
90min
转膜设备:
湿转Bio-Rad
蛋白来源:
真核表达
蛋白名称(可保密):
(多种,30个以上)
蛋白分子量:
40-200kD
WB用膜类型、孔径:
PVDF
转膜方式(恒压、恒流):
恒压100V(电流在280mA至350mA之间)
转膜时间:
60min(M<100kD),60-100min(100kD转膜设备:
湿转
蛋白来源:
大鼠肾脏
蛋白名称(可保密):
保密
蛋白分子量:
130kD
WB用膜类型、孔径:
0.45NC膜PALL
转膜方式(恒压、恒流):
湿转恒流350mA转膜时间:
120min
设备名字Bio-Radmini
一抗用的sigma羊抗大鼠,0.2mL包装的,打折后价格3000多,有些贵哦。
比例调整到1:
1500左右条带可,用BSA封闭。
但是背景稍高。
蛋白来源:
脑组织
蛋白名称(可保密):
蛋白分子量:
38KDa
WB用膜类型、孔径:
PVDF膜,
转膜方式(恒压、恒流):
80v恒压
转膜时间:
180min
转膜设备:
湿转Bio-Radmini
蛋白来源:
真核表达
蛋白名称(可保密):
蛋白分子量:
约35kD(双亚基)
WB用膜类型、孔径:
0.22umPVDF
转膜方式(恒压、恒流):
恒流200mA
转膜时间:
60min
转膜设备:
湿转Bio-rad,天能,六一
转膜时间其实不需要那么长的,转膜没转上一般原因不在这里,可能是转膜液的原因:
有些蛋白SDS可能影响其与膜的结合,还原型电泳因巯基乙醇的原因也可能导致后面的抗体不结合(这是我最近的经验教训),还有一抗的选择很重要,一定要选识别线性表位的抗体,才能用于做WB。
蛋白来源:
细菌蛋白
蛋白名称(可保密):
全部的可溶性蛋白
蛋白分子量:
11-170KD
WB用膜类型、孔径:
0.45NC
转膜方式(恒压、恒流):
湿转恒流300mA
转膜时间:
80min
蛋白来源:
骨肉瘤细胞
蛋白名称(可保密):
蛋白分子量:
72kDa
WB用膜类型、孔径:
PVDF膜(0.45um)
转膜方式(恒压、恒流):
半干转恒流200mA
转膜时间:
20-30min
转膜设备:
Bio-Rad型号忘了,就是有4个插孔的电泳仪。
建议改进方向:
低温很重要,新鲜的电转液也很重要。
蛋白来源:
骨肉瘤CELLLINE
蛋白名称(可保密):
Betaactin
蛋白分子量:
42kDa
WB用膜类型、孔径:
NitrocelluloseMembrane0.2umPoreSize(Invitrogen)
转膜方式(恒压、恒流):
湿转,恒压22v
转膜时间:
90min
转膜设备:
X-cellSureLockMini-cell(Invitrogen)
建议改进方向:
转膜过程冰水浴,保持低温,TransferBuffer重复使用。
蛋白来源:
肾瘤细胞
蛋白分子量:
39kDa
WB用膜类型、孔径:
NitrocelluloseMembrane0.2umPoreSize(Invitrogen)
转膜方式(恒压、恒流):
湿转恒压100v
转膜时间:
50min
蛋白来源:
MCF7
蛋白名称(可保密):
蛋白分子量:
70kDa
WB用膜类型、孔径:
PVDF膜(GE)
转膜方式(恒压、恒流):
湿转100伏
转膜时间:
60min
转膜设备:
伯乐小转膜仪
蛋白来源:
pichia分泌表达
蛋白名称(可保密):
细胞因子等
蛋白分子量:
17到30kDa
WB用膜类型、孔径:
milliporePVDF0.45um
转膜方式(恒压、恒流):
湿转恒压:
100V
转膜时间:
60min
这个条件除了100KDa的预染maker转的不好,剩下的条带都非常清晰。
正向前面ycwzq说的,感觉时间不是很重要,只要蛋白别太小或太大,在一个比较宽的时间和电压范围都能转上。
当然这些还有一个重要的影响因素就是所用的蛋白转印缓冲液。
所以建议把自己用的转印缓冲液的配方也贴上,便于分析交流。
我先说我的吧,是大师兄师姐的配方,我用了感觉还不错,但是100KDa以上的转的不好。
蛋白转印缓冲液pH8.2:
Tris碱1.93g,甘氨酸9g,甲醇200ml,加水定容至1000ml。
蛋白来源:
大鼠坐骨神经
蛋白名称(可保密):
蛋白分子量:
30kDa
WB用膜类型、孔径:
PVDF膜(0.2um)
转膜方式(恒压、恒流):
湿转恒流300mA
转膜时间:
45min
转膜设备:
Bio-Rad
蛋白来源:
小鼠胚胎成纤维
蛋白名称(可保密):
蛋白分子量:
36KDa、55KDa
WB用膜类型、孔径:
PVDF膜0.45
转膜方式(恒压、恒流):
0.3A恒流
转膜时间:
60min
转膜设备:
湿转Bio-Radmini
垫子变薄时,可用三层纤维垫,也没问题。
蛋白来源:
小鼠前列腺癌细胞
蛋白名称(可保密):
P53P21RAD51GAPDH
蛋白分子量:
53KDa、21KDa、37KDa、36KDa
WB用膜类型、孔径:
PVDF膜0.45
转膜方式(恒压、恒流):
恒压110v
转膜时间:
60min
转膜设备:
湿转Bio-Radmini
蛋白来源:
HEK293总蛋白
蛋白名称(可保密):
***
蛋白分子量:
~200KD
WB用膜类型、孔径:
PVDF膜0.2um(用甲醇预先处理)
转膜方式(恒压、恒流):
恒压25V
转膜时间:
过夜(~16-20hours)
转膜设备:
bioradmini
蛋白来源:
人前列腺癌细胞
蛋白名称(可保密):
***
蛋白分子量:
~40KD
WB用膜类型、孔径:
PVDF膜0.45um(用甲醇预先处理)
转膜方式(恒压、恒流):
恒压20V,限制最高电流0.3A。
转膜时间:
过夜(~16-20hours)
转膜设备:
bioradsemi-dry
蛋白来源:
组织
蛋白名称(可保密)
蛋白分子量:
42KDa
WB用膜类型、孔径:
PVDF膜(0.22)
转膜方式(恒压、恒流):
350mA恒流
转膜时间:
60-90min
转膜设备:
湿转Bio-Rad
蛋白来源:
E.ColiBL21
蛋白名称(可保密):
蛋白分子量:
4kd
WB用膜类型、孔径:
PVDF0.22um
转膜方式(恒压、恒流):
恒压15v
转膜时间:
O/N
转膜设备:
Bio-RadMini湿转
转膜液的配制:
for