微柱凝胶法检测孕妇血清IgG抗体效价参考值的临床研究.docx

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微柱凝胶法检测孕妇血清IgG抗体效价参考值的临床研究

微柱凝胶法检测孕妇血清IgG抗体效价参考值的临床研究

　　[摘要]目的探讨使用微柱凝胶抗人球法建立O型孕妇血清IgG抗A（B）效价的参考值。

方法选择2011年10月～2013年12月在深圳市龙华新区人民医院就诊的夫妇ABO血型不合O型孕妇3038例，采用国产微柱凝胶抗人球卡对孕妇（丈夫为A型、B型、AB型）作不规则抗体筛查和IgG抗A（B）效价的测定，以1+凝集强度的血清最高稀释倍数的倒数为效价，并与209例临床诊断为ABO血型不合溶血病（ABO-HDN）的新生儿做相关性分析。

结果206例临床诊断为ABO-HDN新生儿的母体血清免疫性IgG抗体效价均≥256。

结论国产微柱凝胶抗人球法检测孕妇血清IgG抗体效价的正常参考值应设为<256较为合理，对临床预测、诊断、防治ABO-HDN有实用意义。

　　[关键词]微柱凝胶法；孕妇；IgG抗体效价；新生儿溶血病

　　[中图分类号]R446.61[文献标识码]A[文章编号]1673-7210（2015）06（a）-0157-04

　　ClinicalresearchofreferencevalueofmaternalserumIgGantibodytiterbymicrocolumngelassay

　　LUOGuosheng1ZHUCaiyun1XIYajuan1WEIYu'e1WUXianglan2FENGChunyan1LILingbo3▲

　　1.DepartmentofClinicalLaboratory，LonghuaDistrictPeople'sHospitalofShenzhenCity，GuangdongProvince，Shenzhen518109，China；2.DepartmentofNewPediatric，LonghuaDistrictPeople'sHospitalofShenzhenCity，GuangdongProvince，Shenzhen518109，China；3.DepartmentofResearchandDevelopment，ChangchunBioxunBiotechnologyLimitedCompany，JilinProvince，Changchun130012，China

　　[Abstract]ObjectiveToinvestigatethereferencevalueofIgGanti-A（B）titreinserumofpregnantwomenwithbloodtypeObymicrocolumngelCoombs'test.Methods3038pregnantwomenwithcoupleabo-incompatibilityfromOctober2011toDecember2013inLonghuaDistrictPeople'sHospitalofShenzhenCitywereselected.ThetitersofirregularantibodyandIgGanti-A（B）ofthosepregnantwomen（whosehusbandwasA，BorABbloodtypegroup）withObloodtypeweredetectedbydomesticmicrocolumngelCoombs′testcards.Thetiterofantibodywasthereciprocalofhighestdilutionofserum1+agglutination.Atthesametime，the209casesofnewbornswithaclinicaldiagnosisofABO-HDNwereanalyzed.ResultsTheimmunematernalserumIgGantibodytitersof206casesofABO-HDNnewbornwere≥256.ConclusionThenormalreferencevaluesofdomesticmicrocolumngelCoombs′testcardsmaternalserumantibodytitershouldbe<256.Ithaspracticalsignificanceinclinicalprediction，diagnosis，preventionandtreatmentofABO-HDN.

　　[Keywords]Microcolumngelassay；Pregnantwomen；IgGantibodytiter；Hemolyticdiseaseofthenewborn

　　新生儿溶血病（hemolyticdiseaseofthenewborn，HDN）是由于经胎盘传播的母体免疫球蛋白（Ig）G抗体与胎儿红细胞上不同于母体（即遗传自父系）的抗原结合，结果导致胎儿和/或新生儿红细胞寿命缩短的一种疾病[1]。

临床因母婴ABO血型不合引起的HDN最为常见，IgG是唯一能通过胎盘进入胎儿血液循环的抗体，该抗体进入胎儿血液循环后破坏胎儿红细胞而致新生儿ABO溶血病（ABO-HDN），可出现胎儿黄疸、贫血、水肿、流产、早产，严重者将造成新生儿生理缺陷甚至死亡。

由于ABO-HDN的发病程度与母体内IgG抗A（B）的效价有一定相关性[2-3]，因此可通过定期检测孕妇体内IgG抗A（B）的效价来判断胎儿受累情况，并根据IgG抗体水平及早采取相应的防治措施，这对优生优育、提高人口素质具有重要意义。

本研究采用国产微柱凝胶试验技术对夫妇ABO血型不合的3038例O型孕妇检测其血清IgG抗A（B）效价，并分析其与209例产后临床诊断为ABO-HDN新生儿的关系。

现将研究结果报道如下：

　　1对象与方法

　　1.1研究对象

　　选择2011年10月～2013年12月在广东省深圳市龙华新区人民医院（以下简称“我院”）产科门诊就诊的夫妇ABO血型不合O型孕妇3038例，夫妇血型为A-O型的1355例，B-O型1209例，AB-O型474例。

孕妇年龄17～44岁，平均（27.6±1.1）岁，孕16～40周，上述所有孕妇均无输血史。

孕妇Rh（D）血型阴性9例，其余均为阳性，除1例血清不规则抗体筛查为阳性（后经鉴定为IgG抗D且效价<2）外，其余均为阴性，故本研究不考虑ABO血型系统以外IgG抗体的效价。

上述O型血孕妇所分娩的新生儿209例，均以黄疸或进行性黄疸加重为主要症状，出生72h后总血清胆红素水平均≥257μmol/L（15mg/dL），临床诊断ABO-HDN依据文献[4-5]。

　　1.2试剂和仪器

　　0.2mol/L2-ME应用液、0.8%ABO血型反定型试剂盒（人血红细胞）、ABO、RhD血型定型检测卡（单克隆抗体）、抗人球蛋白检测卡（不规则抗体筛检）、HDN母体IgG抗体效价检测卡均由长春博迅生物技术有限责任公司提供；不规则抗体检测试剂（人红细胞）由长春博德生物技术有限责任公司提供。

以上所有试剂均在效期内使用。

FYQ型免疫微柱孵育器、TD-3A型血型血清学用离心机（长春博研科学生物仪器有限公司）、DK-600型电热恒温水槽（上海申贤恒温设备厂）。

　　1.3检测方法

　　1.3.1母体血清不规则抗体筛检采用抗人球蛋白检测卡（不规则抗体筛检）进行不规则抗体筛查，按厂家使用说明书进行操作和判读。

　　1.3.2母体IgG抗A（B）抗体效价检测400μL血清标本与0.2mol/L2-ME应用液400μL充分混匀，封口膜封紧试管口，37℃60min，充分裂解血清中IgM类抗体。

标记两组10mm×60mm的试管各12个，第12管为阴性对照（生理盐水），吸经2-ME处理后血清用生理盐水做倍比稀释，稀释度分别为1∶2、1∶4、1∶8、1∶16、1∶32、1∶64、1∶128、1∶256、1∶512、1∶1024、1∶2048，用盐水法确定1∶2稀释度管IgM抗体已被破坏[6-7]。

以HDN母体IgG抗体效价检测卡检测IgG抗A（B）血型抗体效价，取检测卡做好标记，在微管内各加入50μL与孕妇丈夫同型的0.8%标准红细胞悬液（测定孕妇ABO系统IgG血型抗体），再依次加入处理过的稀释度为1∶2、1∶4、1∶8、1∶16、1∶32、1∶64、1∶128、1∶256、1∶512、1∶1024、1∶2048的血清及阴性对照（生理盐水）各50μL，37℃孵育15min，专用离心机离心5min（900r/min，2min；1500r/min，3min）。

以出现1+凝集强度的血清最高稀释度为阳性判断标准，并以此血清稀释度的倒数为效价[6]。

　　1.3.3O型血孕妇所分娩的新生儿血清学检测对新生儿进行HDN血型血清学三项试验（包括直接抗人球蛋白试验、游离抗体试验、抗体放散试验，分别简称“直抗试验”、“游离试验”、“放散试验”）均采用微柱凝胶技术。

具体方法参照文献[3]。

　　1.3.4通过新生儿溶血病3项试验判断ABO-HDN直抗试验以出现凝集为阳性，游离和放散试验以检出可以和新生儿红细胞反应的抗体为阳性，单项放散试验阳性及其他项目阳性同时合并放散试验阳性的结果均可判为ABO-HDN，直抗及游离试验1项阳性只能判定为ABO-HDN可疑阳性，两者同时阳性可判为ABO-HDN[8]。

　　2结果

　　2.1O型孕妇IgG抗A（B）效价分布

　　3038例O型孕妇中，IgG抗体效价≥256（异常例数）者1388例，占45.69%。

其中，夫妇为A-O型的异常例数有681例，占总例数（1355例）的50.26%，夫妇B-O型的异常例数有507例，占总例数（1209例）的41.94%，夫妇AB-O型的异常例数有200例，占总例数（474例）的42.19%。

见表1。

　　2.2临床诊断为ABO-HDN的新生儿血清学三项试验结果

　　临床诊断为ABO-HDN的新生儿血清学三项试验结果显示，209例患者均为放散试验阳性，其次游离试验阳性率也高达86.12%，而游离+放散+直抗实验阳性率为32.54%。

见表2。

　　表2临床诊断ABO-HDN新生儿血清学三项试验结果

　　2.3临床诊断为ABO-HDN的新生儿母体IgG抗体效价分布

　　209例中效价≥256的有206例，另有3例合并有红细胞葡萄糖-6-磷酸脱氢酶（G-6-PD酶）缺乏新生儿的母体IgG抗体效价均为128。

见表3。

　　表3临床诊断ABO-HDN新生儿母体IgG抗体效价分布

　　注：

ABO-HDN：

新生儿ABO溶血病

　　3讨论

　　母婴血型不合可以引起HDN，溶血结果可致胎儿及新生儿贫血及发生显著的新生儿黄疸，严重黄疸引起的高胆红素血症是该病的常见并发症之一。

早期严重的高胆红素血症可能引起核黄疸，从而留下听力丧失、脑性瘫痪、智力发育障碍等后遗症，给社会及家庭带来沉重负担。

与HDN相关的血型抗原超过50种以上，其中以ABO-HDN最为常见，但大多数ABO-HDN症状较轻，通常可表现为产后24h内出现轻微黄疸，但由于特定族群中二磷酸尿苷葡萄糖醛基转移酶基因启动子变异导致了亚洲部分国家高胆红素血症的高发[7]。

　　导致新生儿胆红素升高的原因有多种，如ABO及Rh溶血症、G-6-PD缺陷症、早产因素、败血症等。

近年来有研究指出，我国核黄疸的发生率高于西方国家，且高胆红素血症导致核黄疸的新生患儿中伴发ABO溶血的概率为29.9%[9]，可见母婴ABO血型不合溶血病是胆红素升高的主要病因。

另据报道，我国ABO-HDN约占新生儿溶血病的85.3%[5]，ABO-HDN治疗的重点是降低血清胆红素，防止核黄疸的发生[4]。

一般认为，在产前通过测定孕妇血清中的免疫性抗体效价是预测母婴血型不合溶血病发生及程度的重要依据之一[2-3]，本研究显示，采用国产微柱凝胶试验技术对夫妇ABO血型不合的3038例O型孕妇产前检测其血清IgG抗A（B）效价，效价≥256的为1388例，占45.69%，与姚文娟等[10]的研究结果48.60%相接近。

产后临床诊断为ABO-HDN的209例新生儿均为上述1388例中的孕妇所分娩。

对此209例新生儿出生后监测其血清胆红素并及时做HDN三项试验，本研究结果表明，209例全部放散试验阳性，放散合并游离试验阳性的113例，放散合并直抗+游离试验阳性的为63例，可见免疫试验结果支持了临床诊断，放散试验可作为确诊ABO-HDN的重要依据，以便对ABO-HDN及早发现和治疗，保护新生儿健康。

　　研究表明，ABO-HDN发病风险与母血清IgG抗A（B）效价有一定相关性，随其水平的升高而递增[11-12]。

一般认为，以试管法检测孕妇IgG抗A（B）效价达到64时[2-3]，则有发病的可能，如果其水平持续性升高，应及时采取临床干预措施。

以往常用于产前孕妇IgG血型抗体效价检测的方法主要是试管抗人球蛋白试验，用该法测得孕妇IgG抗体效价为64时，即是预防ABO-HDN有临床意义的参考值。

微柱凝胶法以其较高的灵敏度、更简便的操作，目前已逐步取代传统的试管法应用于ABO-HDN的产前检测[6，11]，鉴于微柱凝胶技术用于产前IgG抗体效价检测比试管法具有更高的灵敏度，研究认为各实验室应在试验基础上确立微柱凝胶技术相应的参考值[2，7，13]，以避免灵敏度过高对正确分析病情造成干扰。

对微柱凝胶技术参考值的确定，已有的研究报道观点不尽相同，有学者认为与传统试管抗人球蛋白法差别不大，即以效价64为参考值[14-15]；另有学者则认为应将效价设在128左右[13，16]；还有学者认为应设在256附近[17-18]。

本研究显示，产后检测确诊的209例ABO-HDN患儿母体血清IgG抗体效价，除3例合并有G-6-PD酶缺乏新生儿的母体抗体效价为128外，其余的206例抗体效价均≥256，考虑G-6-PD缺乏是由于红细胞不能激活戊糖磷酸的代谢途径，并降低抗氧化能力，从而伴发高胆红素血症。

综合上述结果，笔者提出应用国产微柱凝胶技术产前检测ABO-HDN母体IgG抗体效价以256作为参考值是恰当的，而正常参考范围为<256较为合理。

当然，各实验室在将不同的微柱凝胶卡用于母体抗体效价检测时，不同的操作程序及人员，也会导致其参考值出现差异。

因此，有必要根据试验建立各实验室的临床参考值，根据各自科室的情况设立标准，并把相关信息通知产科或新生儿科医生。

　　当前，临床实验室常用于检测母体IgG类抗体的方法是传统的试管法抗人球蛋白试验[6]。

1945年，科学家Coombs发明制备了抗IgG类抗体的抗人免疫球蛋白抗体，以此搭桥使盐水介质中的相应IgG抗体和红细胞发生肉眼可见的凝集反应。

该技术也被称之Coombs实验，由此发现了很多新生儿溶血性疾病和输血反应是IgG类抗体所致，而应用传统的盐水血凝试验无法检测。

半个多世纪以来，Coombs试验始终是最经典、最准确检测不完全抗体（主要是IgG类）的方法。

但由于传统试管法Coombs试验方法复杂，孵育时间长等原因，不适用于大批量样本的检测。

1990年，Lapierre等[19]报道了检测红细胞抗原抗体反应的一种新方法―微柱凝胶试验。

至今，在一些国家该方法已成为输血相容性及HDN相关抗体检测的一种常规方法[20-21]。

微柱凝胶免疫检测新技术是将抗原抗体反应与凝胶分子筛技术相结合，即微柱凝胶免疫实验。

该技术的本质是血凝试验，即红细胞抗原抗体在微柱腔内的凝胶介质中发生肉眼可见的免疫凝集反应。

微柱凝胶Coombs试验孵育后的红细胞不需三洗，且该法孵育时间只需15min，具有操作简便、影响因素少、结果可保存等优点，尤其提高了免疫凝集试验的敏感性，使其能更广泛地应用在HDN相关的母体IgG类抗体检测中[13]。

本研究显示，确诊的209例ABO-HDN中，206例其患儿母血清IgG抗体效价均达到或超过256，也说明了应用微柱凝胶技术进行产前效价的检测确能对HDN的发生发展趋势做出一定的预判，微柱凝胶法检测孕妇IgG血型抗体效价可作为评估HDN发生风险的指标之一[22]。

　　同时，本文检测结果表明，IgG抗体效价≥256（异常例数）的有1388例，但确诊的仅206例，约85%的新生儿并未发病。

由此也表明，IgG血型抗体效价并非判断HDN严重程度的唯一性指标，HDN的严重程度可能与很多因素有关，如母体抗体的IgG亚型和糖基化、血型抗原的结构、位点密度、发育成熟程度及在其他组织中的分布、IgG抗体经胎盘转运的速率、胎儿脾脏功能成熟度、Fc受体功能多态性的影响、人类白细胞抗原相关抑制抗体的影响等[7]。

因此有研究认为，对于产前检测效价持续升高者，还应结合其他检测项目，如羊水、B超检查等及孕妇临床状况综合分析，做出判断[12]。

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　　（收稿日期：

2015-01-26本文编辑：

任念）