应用DNA改组技术构建水蛭素突变体库.docx

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应用DNA改组技术构建水蛭素突变体库

湖北生物科技职业学院

学生毕业论文

论文题目：

应用DNA改组技术构

建水蛭素突变体库

系别：

生物工程系

专业：

生物技术及应用年级：

0510

姓名：

宁晓微学号：

0501011018

指导老师：

艾炎军

 2007年11月18日 

摘要

水蛭索是水蛭中抗凝血蛋白质的一种，它对凝血酶有强烈抑制作用：

水蛭索的三维构象与水蛭中作用于血小板糖蛋白Ⅱb—Ⅲa的拈抗剂decorsin十分相似，而该拮抗剂是以RGD保守序列作为识别序列的。

本文试图通过水蛭素定向进化获得既抑制凝血酶又抑制血小板凝集的双功能抗凝剂。

因此，本文运用DNA改组技术，在重组反应中掺入含RGD基序的化学合成的寡聚核苷酸，得到水蛭素各种变异体基因，然后将此突变体基因片段插入噬菌质粒pCANTAB5\G8，转化大肠杆菌，建立水蛭索突变体噬菌体表面展示库。

建库后，分别用凝血酶和血小板对这个库进行亲和淘选，初步结果显示，在实验定向进化中可看出选出的突变体抗凝血酶活性与血小板结合能力都随着淘选而提高。

并且当一种选择压力消失时，在该压力下选择出的某性状也会随之减弱。

因此，在适宜选择条件下有希望从突变体库中选择出既抑制凝血酶又与血小板有结台能力的双功能水蛭素突变基因。

进一步的淘选工作和DNA测序鉴定工作正在进行中。

、

关键词：

水蛭素；DNA改组；亲和淘选。

目录

摘要……………………………………………………………………………………………1

目录……………………………………………………………………………………………2

引言……………………………………………………………………………………………3

1材料和方法………………………………………………………………………………………5

1.1材料…………………………………………………………………………………………5

1.1.1试剂和菌种………………………………………………………………………5

1.1.2器材………………………………………………………………………………6

1.2方法………………………………………………………………………………6

1.2.1改组联合随机片段的插入………………………………………………………6

1.2.2pCANTAB5VG8／HIndⅢ,BamHI大片段与水蛭素基因的连接……………………8

1.2.3构建水蛭素突变体库…………………………………………………………9

结论………………………………………………………………………………………………12

致谢………………………………………………………………………………………………15

参考文献………………………………………………………………………………………16

引言

 水蛭是我国的传统中药，早在1800年前的《神农本草经>中就有记载。

中医认为水蛭有破血、逐瘀、通经等功效。

1884年Havcraft发现医用水蛭的提取物中含有抗凝血的物质。

1955年Markwardt从水蛭头部分离纯化出一种蛋白质,命名为水蛭素（Hirudin），并于1970年确定为凝血酶的特异性抑制剂，由此开始了对吸血水蛭中抗凝血物质的多方面研究。

一系列的动物实验和临床研究表明，水蛭素能高效抗凝血，抗血栓形成，阻止凝血酶催化的凝血因子活化和血小板反应，抑制凝血酶诱导的多种细胞增殖，水蛭素可用于治疗各种血栓性疾病，尤其是治疗静脉血栓，弥漫型血管内凝血，促进手术后伤口愈合和预防动脉血栓等。

研究还表明，水蛭素能阻止许多肿瘤细胞的转移，在肿瘤治疗中也能发挥一定的作用。

水蛭素是水蛭唾液腺分泌的一种具有强烈抗凝血作用的小分子蛋白质。

水蛭素通常是由65或66个氨基酸残基组成的单链多肽，分子量为7000道尔顿左右。

分子中不含精氨酸、甲硫氨酸和色氨酸。

水蛭素分子N端区域有三对二硫键（C6—C14，C16—C28，C22一C39），使其形成紧密的空间构象。

水蛭素的C端是一酸性区，其最后九个氨基酸残基中有五个是酸性氨基酸，并有一个硫酸酯化的酪氨酸（第63位）。

水蛭素是凝血酶的天然抑制剂，它和凝血酶以l：

l的比例形成紧密的非共价结合的稳定复合物，解离常数为10-11mol／L～10-14mol／L。

水蛭素-凝血酶复合物的三维结构显示：

水蛭素的N端结合域覆盖在凝血酶的活性位点，C端与带正电的血纤维蛋白原结合位点呈多点结合，其中N端三个氨基酸与凝血酶活性位点的接触至关重要。

许多研究表明，水蛭素是一多位点作用的抑制剂，其N端和C端结构域分别都有抗凝血活性，二者通过接头区（49～54）协同作用，从而表现出对凝血酶高度特异的抑制作用。

水蛭素是水蛭中抗凝血蛋白质与多肽的一种，这类蛋白具有相似的基序，因而选择水蛭素作为原型开展实验定向进化的研究，应用分子生物学的手段实现蛋白质性质的改造。

自然界中，生物大分子的进化是一个突变和选择的过程，经历漫长的岁月，每一个分子都包含复杂的结构和功能信息，生物大分子之间相互作用形成一个相互制约、共同进化的平衡体系，对生物大分子结构和功能关系的了解是认识生物分子进化的基础.蛋白质工程在已知蛋白质的某些结构和功能基础上，利用定位诱变进行氨基酸残基的置换,试图改变蛋白质的某些特性，这方面的工作对深入了解结构功能关系起了很大作用，同时也获得了许多具有新特性的蛋白质,但由于对蛋白质结构功能了解的欠缺,很多改造工作没有达到预期目的。

随机诱变和特异选择在某种程度上克服了上述困难，尤其是噬菌体展示技术与DNA改组技术的建立，使蛋白质改性方面的工作有了较大的突破。

在某种意义上，随机诱变和选择过程模拟了自然界进化的历程。

因此，我们可以在实验室条件下，通过随机诱变并施加特定的选择压力来筛选特定的生物大分子，实现生物大分子的体外快速进化，并且有可能创造新的基因、新的蛋白质，乃至新的物种。

目前，主要有三种诱变方法应用于实验定向进化：

错误倾向PCR（error-pronePCR）是在PCR中改变反应条件,采用无校正功能的TaqDNA聚合酶，从而提高PCR反应的错误率的一种随机诱变的方法.它比较简便，易于操作，但对于大于0.5Kb的大片段很难运作，因此无法用来研究有机体的全长基因组。

盒式诱变是在基因的某个区域插入变异密码子．造成一个区域的完全随机编码，该方法主要用于研究蛋白质局部的结构和功能.DNA改组一定程度上弥补了以上两种方法的缺陷，是现阶段比较普遍的研究实验定向进化的一种强有力的手段。

它能提高定向进化的材料的丰度,用于人工选择和自然选择，从而将单个基因中的有利突变积累起来，并通过重组产生多样性,在同源序列区产生交叉，促进了基因组的复杂化：

1994年StemmerPC首先应用此方法实现了β-半乳糖苷酶向β-岩藻糖苷酶的性质转化，发现它在提高突变率上优于前述的另两种方法。

Singtegene_______________

RandomFragmentation

Poolofrandom-----------------------------

-----------------------------

DNAfragments-----------------------------

-----------------------------

-----------------------------

-----------------------------

-----------------------------

-----------------------------

ReassemblyPCR

Mutagenic&Recomomogenic

图1DNA改组近程图示

DNA改组的实现需经三个步骤：

第一步是将某DNA分子的变异群（DNAvariants）用DNA处理使之随机片段化（randomfragmentation），第二步是将这些随机片段进行自身引物PCR反应（selfprimingPCR）重新得到全长基因。

由于同源性，各个片段能互为引物，当某一个DNA分子的片段作为另一个DNA分子的片段的引物时，则发生了模板交错。

这样，以此为模板的重组合PCR反应（reassemblyPCR）就能扩增出我们需要的具有一定突变的基因片段了（见图l）。

近几年来，DNA改组技术得到了广泛的应用和发展，并体现出广阔的前景，主要有以下几个方面：

（1）将一族高同源的基因片段经DNA酶消化以后，回收小片段．再重组回原来的大小，并得到有利变异。

这是改组技术运用得最广泛的一个方面，用于积累有利变异、构建突变体厍、实现快速定向进化等。

（2）分子量较大的质粒经重排得到两个大小不同的标记片段的完全重组，这两个标记片段原来在不同的基因上。

（3）化学合成的、与消化片段有3～5个同源的寡聚核苷酸能整合到重组基因中。

（4）DNA改组技术运用于回交等遗传模拟实验中。

（5）用于研究抗体等同源基因的结构和功能关系。

在实验设计中，由于曾有人在吸血水蛭Macrobdelladeeora中分离到血小板糖蛋白Ⅱb—Ⅲa的拮抗剂，其三维构象与水蛭素很相似，其C端RGD序列与GPⅡb一Ⅲa相识别而介导它们之间的相互作用，从而抑制了血纤维蛋白原介导的血小板聚集，我们希望通过在水蛭素基因中引入RGD基序使水蛭素具有与血小板结合的能力。

具体方法是，应用DNA改组技术使水蛭素野生型基因与随机物同源重组，借助噬菌体展示构建变异体重组噬菌体库，通过凝血酶和血小板的亲和淘选得到改进性能的变异体。

目前已构建了变异体库，选择工作正在进行中。

需要说明的是，这项改造工作已经有人在从事并且取得一定的成效，而本实验除了希望得到具有有利变异的突变体以外。

还希望能够探索一种有效的实验定向进化方法，具体言之就是运用DNA改组技术来建立突变体库，为实现水蛭素的快速定向进化提供丰富的材料。

另外，水蛭素N端的三个氨基酸与凝血酶活性位点的接触至关重要。

据文献报导，在水蛭素基因中引入RGD基序时，一般是在突环部位进行定位诱变或盒式诱变。

本实验的另一个任务即是探索RGD肽结合在水蛭素别的部位时是否能产生相同或相似的功效，而且不需要在RGD基序的两端引入限制性酶切位点。

1材料和方法

流程

水蛭素野生型基因

PCR方法扩增

DNasel消化

回收10-50bp片段

自身引物PCR反应得到全长基因提取pCANTAB5VGG8-Hir质粒

掺人化学合成的寡聚核苷酸PN21

BamHⅠ,HindⅢ双酶切

重组PCR反应扩增此全长基因

检验

BamHI．HindⅢ双酶切

插入载体生段

连接、转化

测定转化库的活性测定重组噬菌体的滴度

随机挑选单个克隆凝血酶的亲和淘选

提质粒，酶切检测

并测定抗凝血酶活性血小板的亲和淘选

1.1材料

1.1.1试剂和菌种

TaqDNA聚合酶．HindⅢ．BamHI等限制性内切酶，pGEM7zf（+）／HaeⅢ及入DNA／HindⅢ等分子量标准均购自华美生物工程公司。

dNTP、标准水蛭素等均购自Sigma公司。

DNaseI购自英国ColnbrookBucks公司。

Tris购自fluka公司。

生色底物ChromozymTH（T0s—Gly—Pro—Arg一nitroanilide）购自Boehringer公司。

PCR产物纯化试剂盒购自Promega公司。

随机引物X3．68以及募聚核苷酸PN21由Gibco公司合成。

其他试剂均为国产分析纯。

大肠杆菌DH5α、TG1等菌种，以及质粒pCANTAB5VG8一Hir由本实验室提供。

1.1.2器材

PCR-90AD型PCA代，中科院生物物理所技术服务公司

QZX-C空气浴振荡器，哈尔滨东明医疗仪器厂

JT-7B洁净工作台。

北京半导体设备一厂

WTGL-14L型台式高速冷冻离心机,中科院生物物理所技术服务公司

高速冷冻离心机，日立公司

DF-C型恒压恒流电泳仪，北京崇文东方仪器厂

WC09-05小型超级恒温器，重庆实验设备厂

5986-62型微量pH计，上海市第三分析仪器厂

752C型紫外可见分光光度计

1.2方法

1.2.1NA改组联合随机片段的插入

1、PCR反应扩增水蛭素基因

（1）PCR反应

PCR100μA反应体系如下：

模板R8单链DNA（40ng/μl）2μl

引物（+）X3（15pmol/μl）4μl

引物（-）68（15pmol/μl）4μl

dNTs（2.5mmol/Leach）8μl

10xTaqbuffer10μl

ddH2072μl

上述体系5份分别在O．5mlEppendorf管中加样混匀后，在PCR仪上93℃下变性10min，后加入1μpTaq酶（5U／μl），再滴加100μl石蜡油，盖上盖子，在PCR仪上进行35个循环：

变性温度93℃，45s；退火温度60℃，45s；延伸温度72℃，45s。

循环结束后，72℃延伸10min。

取lOμl反应液进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，溴乙锭染色，紫外灯下检查PCR结果。

（2）PCR产物的回收处理

PCR产物中加入等体积氯仿，抽提液体石蜡油，水相中加入1／10体积的NaAc（3mol／L，DH为5.2）、2倍体积无水乙醇，在-20℃下沉淀过夜，在4℃，12000rpm下离心15min．DNA沉淀用70％乙醇洗2遍，干燥后将各管（共5管）沉淀各溶于20μLddH20中，合并得100μL溶液。

用PCR产物纯化试剂盒来纯化，加50μL出纯化缓冲液快速振荡．加入lml纯化介质快速振荡3次，共1min,再组装针筒、小柱子、三歧管、橡皮座，并与过滤瓶连接。

然后将介质与PCR产物的混合注入针筒，打开水泵使其进入柱子中，用80％异丙醇洗一次，持续抽30s使介质干燥，移去针筒，柱子转移到1.5mlEppendorf管上，在10000rpm下2min，再转移到一个新的Eppendorf管上，并在柱子中加入25μLddH20，浸泡1min，在10000rpm下20s，Eppendorf管中即为纯化好的PCR产物（Promega，TechnicalMannual）。

2．DNaseI消化水蛭素基因

（1）25μL纯化好的PCR产物做成5个20μL消化体系

DnaseI（10ng/µl）5.5µl

5x缓冲液4µl

纯化好的水蛭素片段5µl

ddH2O5.5µl

上述体系在0.5mlEppendorf管中加样混匀后，于37℃水浴中反应45min后，EDTA终止，全部反应液进行聚丙烯酰胺凝胶电泳。

（2）压碎浸泡法回收10—50bp片段

电泳结束后，溴乙锭染色，在紫外灯下切下10一50bp的片段。

在1．5mlEppendorf管中捣碎，加入2倍体积洗脱缓冲液，在37℃空气浴振荡器中振荡4小时，再在10000rpm下离心lmin.收集上清，沉淀中再加入200μL洗脱缓冲液，剧烈振荡在10000rpm下离心1min。

合并上清，加入等体积的酚与氯仿的混合液（1：

1），振荡混匀，在4℃，12000rpm下离心2min。

转移上清至另一离心管，用2倍体积无水乙醇沉淀DNA，4℃。

lh。

然后,在4℃，12000rpm下离心10min。

弃上清，DNA沉淀用70％乙醇洗涤2次，室温干燥，溶于30μlddH2O中。

3．PCR反应重新得到全长基因

（1） 自身引物PCR反应得到全长基因

PCR50µl反应阵系如下：

10～50bp片段30µl

dNTPs（2．5nmol／L）4µl

10xTaqbuffer5µl

化学合成寡聚核苷酸PN21（1.10nmol／μl10.5µl

上述体系在0.5mLEppendorf管中加样混匀后,在PCR仪中于93℃下变性2min，然后加入0.5μLTaq（5U／μL）混匀，再滴加50μL石蜡油，盖上盖子。

在PCR仪上进行45个循环：

变性温度93℃。

30s；退火温度37℃，30s；延伸温度72℃，30s。

循环结束后，72℃延伸lOmin。

（2）重组合PCR反应扩增全长基因

PCR100μl反应体系如下：

自身PCR反应产物4µl

引物（+）X3（15pmol／µl）4µl

引物（-）68（15pmol／µl）4µl

dNTPs（2.5／mmol／L）8µl

10xTaqbuffer10µl

ddH2O69µl

上述体系5份分别在O.5mlEppendorf管中加样混匀后，在PCR仪中干93℃下变性2min后加入1µlTaq酶（5U／UL）混匀，再滴加100µl石蜡油,盖上盖子。

在PCR仪上进行15个循环：

变性温度93℃，30s；退火温度50℃，30s；延伸温度72℃,30s。

循环结束后,72℃延伸10min。

（3）PCR产物的回收处理

PCR产物中加入等体积氯仿。

抽提液体石蜡油，合并水相并加入1／10体积的NaAc（3mol／L，pH为5.2）2倍体积无水乙醇，在-20℃下沉淀过夜。

后在4℃，12000rpm下离心15min，DNA沉淀用70％乙醇洗2遍．干燥后将沉淀溶于30µlddH20中，全部用于聚丙烯酰氨凝胶电泳，溴乙锭染色后用压碎浸泡法（同上）回收229bp的片段。

4．PCR产物HindⅢ．BaraHl双酶切

（1）Klenow酶补PCR产物

回收片段干燥后溶于下列50μL出反应体系：

Klenow酶的NE缓冲液5µl

Klenow酶（10U／µl）1µl

dNrPs（2.5mmol／µl）1µl

ddH2043µl

上述体系在0．5mlEppendorf管中混匀，在37℃水浴中反应30min，再在75℃水浴中放置lOmin。

使体系酶失活，加入等体积的酚与氯仿的混合液（1：

1），振荡混匀。

在4℃，12000rpm下离心2min。

转移水相至另一离心管，再加入等体积的ddH2O振荡混匀，在4℃．12000rpm下离心2min。

合并水相并加入1／10体积的NaAc（3mol／L。

pH为5.2）、2倍体积无水乙醇，在-20℃下沉淀过夜，后在4℃，12OO0rpm下离心15min，DNA沉淀用70％乙醇洗2遍，干燥后将沉淀溶于20μLddH20中。

（2）HindⅢ．BamHI双酶切

25μl酶切反应体系如下：

补平产物10µl

10x缓冲液E2.5µl

BamHⅠ（28U／µl）1µl

HindⅢ（20U／µl）lµl

ddH2O20.5µl

上述体系在O．5mlEppendorf管中混匀，在37℃水浴中反应过夜。

加入等体积的酚与氯仿的混合液（1：

1），振荡混匀，在4℃，12000rpm下离心2min。

转移水相至另一离心管，再加入等体积的ddH20振荡混匀，在4℃，12000rpm下离心2min。

合并水相并加入1／10体积的NaAc（3mol／L．pH为5.2）、2倍体积无水乙醇，在-20℃下沉淀过夜。

后在4℃，12000rpm下离心15min，DNA沉淀用70％乙醇洗2遍，干燥后将沉淀溶于20μLddH2O中。

1.2.2pCANTAB5VG8／HIndⅢ,BamHI大片段与水蛭素基因的连接

1．pCANTAB5VG8质粒的提取

pCANTAB5VG8的单菌落在5mlLB培养基（含Amp100μg／ml）中于37℃下培养过夜，在12000rpm下离心2min收集菌体。

上述细胞沉淀重悬于0．5mlSTE（0.1mol／LGlucose．10mmol／LEDTA。

25mmol／LTris-HCI（pH为8．0）），在12000rpm下离心2min收集菌体。

沉淀重悬于100µl用冰预冷的溶液I（50mmol／LGlucose，10mmol／LEDTA．25mmol／LTris-HCI（pH为8.O）。

剧烈振荡。

加200μl新配制的溶液Ⅱ（0.2mol／LNaOH．1％SDS），盖紧管盖。

快速颠倒离心管5次，以混合内容物，应确保离心管的整个内表面均与溶液Ⅱ接触。

不要振荡，将离心管放置于冰上3min，然后加入150μL用冰预冷的溶液Ⅲ（3mol／LKAc，pH为4.8），混匀后，在冰上放置5min，在4℃，12000rpm离心10min。

转移上清至另一离心管中，加等体积的酚与氯仿的混合液（1：

1），振荡混匀．在40℃，12000rpm下离心2min。

转移水相至另一离心管，再加人2倍体积无水乙醇沉淀DNA．4℃，30min。

然后．在4℃，12000rpm下离心10min，弃上清．DNA沉淀用70％乙醇洗2遍，干燥后将沉淀溶于lOμlddH20（含RNase20ng／μl）。

取1μl进行O．8％Agarose电泳检测。

（1）电泳回收pCANTAB5V／HIndⅢ，BamHI大片段

取1μgpCANTAB5V质粒DNA在50μl反应体系中（1xBufferE，70UHindIII，50UBamHl），于37℃下酶解过夜。

加入等体积酚与氯仿的混合液（1：

1），振荡混匀，离心取水相，再用酚、氯仿抽提一遍，合并水相。

水相中加入等体积氯仿，振荡混匀，离心取水相，记下体积，加入1／10体积NaAc（3mol／L）、2倍体积无水乙醇，在-20℃下沉淀过夜。

DNA沉淀干燥后溶于50μLddH2O．全部上样进行O.8％Agarose／TAEBuffer电泳检测。

电泳结束后，在紫外灯下，切胶回收所需DNA片段。

（2）玻璃奶从琼脂糖凝胶中回收DNA大片段

切下的胶在Eppendorf管中捣碎，加入3倍体积的溶胶液，在60℃水浴5min,其间轻摇Eppendorf管数次使胶完全熔化。

加入10μl玻璃奶，用加样器混匀，，室温静置5min，在8000rpm下离心15s，吸弃上清。

加125μl漂洗液，用加样器吸漂洗液将玻璃奶冲散均匀，离心弃上清。

重复上一步2次，加lOμlddH20混匀后，在60℃下水浴5min，后在15000rpm下离心10s．回收上清备用。

取1μl经0．8％Agamse电泳检测回收效率并测定DNA浓度。

2．DNA片段连接

50μl反应体系，pCANTAB5V／HIndⅢ，BamHI大片段300ng，重组水蛭素基因PCR扩增回收处理后产物60ng，l×T4DNA连接酶Buffer．T4DNA连接酶6U，16℃，4h。

3．转化

（1）E．coliDH5α感受态细胞的制备

挑取TG1单菌落于3mlLB培养基中，在37℃下振荡培养6～8h；l：

100稀释至3mlLB培养中，在37℃下振荡培养至0.D600=O.25。

在4℃，4000rpm下离心5min，弃上清，加入预冷的0.lmol／LCaCl21.5ml重悬菌体，在冰上放置30min。

在4℃，6000rpm下离心5min．弃上清，加入预冷的0.1mol／LCaCl2300μL重悬菌体,在4℃冰箱中保存，在感受态细胞制好后12～24h内用于转化。

（2）转化感受态细胞

取新鲜的感受态细胞350μL，与上述20μL连接反应液混合，冰上放置45min．在42℃下热激2min，再在冰上放置2min