生物工程下游技术纳豆激酶提取实验.docx
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生物工程下游技术纳豆激酶提取实验
《生物工程下游技术》综合实验
——纳豆激酶的分离纯化
摘要
从纳豆发酵液中提取纳豆激酶，采用30~70%饱和度的硫酸铵盐析，SephadexG-75凝胶过滤层析对活性组分进行分离提纯。
然后检测各个步骤的样品的蛋白质含量，绘制凝胶层析图，得出峰值，最后对整个纯化方案进行评价。
结果表明，本次实验纯化回收率较低。
凝胶层析是生物化学中一种常用的分离手段，它具有设备简单、操作方便、样品回收率高、试验重复性好、特别是不改变样品生物学活性等优点，被广泛用于蛋白质（包括酶）、核酸、多糖等生物分子的分离纯化。
凝胶层析是依据分子大小这一物理性质进行分离纯化的，透明质酸（hyaluronicacid，简称HA），是一种国际上公认的生物大分子保湿剂，分子量达几十万到几百万，而蛋白质的分子量仅为几万，所以选择合适的凝胶可以起到分离纯化的效果。
关键词：
纳豆激酶硫酸铵盐析凝胶层析
目录
1前言4
2材料和仪器4
2.1仪器4
2.2材料4
2.3试剂及溶液配制4
3实验方法5
3.1纳豆的制作5
3.2纳豆激酶的粗提5
3.2.1浸提5
3.2.2硫酸铵盐析5
3.3SephadexG-75凝胶层析进行纯化6
3.4蛋白质含量的测定7
4结果与分析7
4.1蛋白质含量测定结果7
4.2层析收集液测定结果7
4.2.2绘制纳豆激酶的层析图8
4.2.3纯化方案进行评价9
5讨论9
5.1方法分析9
5.2问题及其猜想10
参考文献12
1前言
心脑血管疾病是危害人类健康的严重疾病，其死亡率已超过了癌症。
而血栓又是心脑血管疾病中致死率最高的疾病之一，虽然现在临床上有许多用于治疗血栓的药物,如链激酶、尿激酶、组织纤维蛋白溶酶原激活剂以及蛇毒栓溶剂等,但是它们大多为注射用药,使用不便,且副作用大、半衰期短,很难满足血栓治疗的需要。
纳豆激酶是日本的传统食品——纳豆（natto）在发酵过程中产生的，是一种由纳豆芽孢杆菌（Bacillusnatto）产生的具有纤溶活性的丝氨酸蛋白酶，该酶不但具有明显的溶栓活性，而且还可以激活体内的纤溶酶原，增加内源性溶纤酶的含量，具有降血压、抗氧化、抗肿瘤及溶血栓等医疗功效；且与传统的溶栓制剂相比，纳豆激酶有不易引起出血、无抗原性、半衰期长、安全无毒且成本低廉和能口服吸收溶栓等优点，因而具有广阔的开发前景，可能成为新一代的溶栓药物。
自1987年Dr．Sumi首次从日本传统发酵食品纳豆中发现并可分离出纳豆激酶以来，该酶便受到世界相关研究人员的广泛关注。
凝胶层析收集洗脱液，经紫外分光光度计测定A280nm光吸收值，并绘制层析图谱。
当出现第二个峰值过后即为实验终止，分析峰值数据，并以此对纳豆激酶纯化方案进行评价。
2材料和仪器
2.1仪器
紫外分光光度计，冷冻离心机，层析柱，离心管等。
2.2材料
葡聚糖凝胶（SephadexG-75）
2.3试剂及溶液配制
2.3.1硫酸铵饱和溶液
400g硫酸铵溶于预热的70～80℃500mL蒸馏水中，搅拌2h左右，冷却至室温至底部有结晶析出，NH4OH调pH7.8。
2.3.20.2mol/L，pH7.4磷酸盐缓冲液（PB）
0.2mol/LNaH2PO419ml
0.2mol/LNa2HPO481ml
2.3.30.01mol/L，pH7.4磷酸盐缓冲生理盐水（PBS）
0.2mol/LPB50mL
NaCl8.5—9g
加蒸馏水至1000mL
3实验方法
3.1纳豆的制作
将实验室保存的纳豆菌种接入斜面培养基，经37℃、24h活化培养。
挑取一环活化的菌种接种于营养肉汤中，37℃、120rpm过夜作为种子培养液。
纳豆制作：
大豆→清洗、浸泡→高压蒸煮（121℃，30min）→摊凉→接种（5％）→发酵（37℃、24h）→后熟（4℃、过夜）→成熟纳豆
3.2纳豆激酶的粗提
3.2.1浸提
取固体发酵新鲜纳豆，加入2倍体积的灭菌生理盐水，搅拌，浸提24h以上，浸提液7000r/min，冷冻离心15min，取上清液即为粗提液。
3.2.2硫酸铵盐析
取28ml的纳豆激酶粗提液，一边搅拌纳豆激酶粗提液，一边加入12ml的硫酸铵饱和溶液，采用30％饱和度的硫酸铵进行盐析，放置1h后，7000r/min离心10min，弃去沉淀，得到37ml的上清液，取36ml的上清液加48ml的硫酸铵饱和溶液至70％饱和度，放置1h后，7000r/min离心10min，弃上清，收集沉淀物用2ml（每管1ml）0.01mol/L，pH7.4的PBS溶解。
取其中0.5～1mL稀释后测定蛋白质的含量，其余样品留待进行后面的实验。
在盐析过程中，取1ml粗酶液，稀释50倍，取1ml30%硫酸铵盐析上清液，稀释20倍，取1ml70%硫酸铵盐析沉淀液，稀释20倍，经紫外分光光度计测定A280nm和A260nm的吸光值，并作记录。
3.3SephadexG-75凝胶层析进行纯化
3.3.1凝胶的处理
称取10gSephadexG-75于500mL的烧杯中，加入约400mL的蒸馏水室温溶胀1d，然后用倾泻法除去悬浮的细颗粒。
以0.01mol/L，pH7.4的PBS浸泡。
3.3.2装柱
将洗净的层析柱竖直固定，关闭出水口，向柱中加入约10mL0.01mol/L，pH7.4的PBS，把溶胀好的凝胶轻轻搅匀，用玻璃棒连续缓慢地引流入柱，同时打开出水口并不断向柱内补充凝胶，到凝胶自然沉降后的沉淀高度离管口约10cm处为止。
凝胶颗粒最好一次装完，以防分层。
3.3.3平衡
装柱完成后用0.01mol/L，pH7.4的PBS洗脱平衡，至少通过一倍柱床体积的洗脱液。
3.3.4上样
打开出水口排水，当凝胶层与上方水层的弯月面相距1mm时，关闭出水口，用滴管将纳豆激酶粗提液1mL沿柱内壁缓缓加入，勿冲动胶面。
上样完毕，打开出水口，使样品进入凝胶。
3.3.5洗脱
不断向柱内加洗脱液，控制流速为约0.8mL/min，每5min收集一管。
3.3.6收集样品及检测
各管收集液经紫外分光光度计测定A280nm光吸收值。
记录实验结果并绘制层析图谱。
3.3.7清洗
待所有样品流出层析柱后，加快流速，继续清洗层析柱10min。
3.4蛋白质含量的测定
采用紫外分光光度法。
稀释后分别测A280和A260
蛋白质含量（mg/mL）=（1.45×A280－0.74×A260）×稀释倍数
4结果与分析
4.1蛋白质含量测定结果
测定粗酶液、硫酸铵盐析后及凝胶分离后各样品的蛋白质含量，如表一所示。
表一不同样品的蛋白质含量测定结果表
样品
A280
A260
稀释倍数
蛋白质含量（mg/ml）
空白
0
0
0
0
粗酶液
0.271
0.2
50
12.2475
30%硫酸铵盐析上清液
0.16
0.209
50
3.867
70%硫酸铵盐析沉淀
0.038
0.023
50
1.904
凝胶层析峰1
0.411
0.465
1
0.25185
凝胶层析峰2
0.157
0.187
1
0.08927
4.2层析收集液测定结果
测定凝胶层析后各收集液的A280nm光吸收值，如表二所示。
表二层析收集液的A280nm光吸收值记录表
编号
A280nm光吸收值
1
0.02
2
-0.04
3
0
4
0.025
5
0.365
6
0.585
7
0.283
8
0.101
9
0.075
10
0.051
11
0.05
12
0.046
13
0.039
14
0.036
15
0.052
16
0.089
17
0.14
18
0.178
19
0.159
20
0.128
21
0.085
22
0.06
23
0.039
24
0.012
25
0
26
0
4.2.2绘制SephadexG-75凝胶层析分离纳豆激酶的层析图，如图一所示。
图一纳豆激酶凝胶层析图
由图一可知，已pH值为7.4的PBS作为洗脱液，经过凝胶柱层析共收集到2个蛋白质光吸收峰。
选定管5、管6及管7的样品作为第一峰，管17、管18及管19的样品作为第二峰，每管约有4ml的样品。
第一峰的宽度比第二峰小。
4.2.3纯化方案进行评价
计算分析每一步纯化步骤的总蛋白量和得率，其结果如表三所示。
表三纯化方案评价表
样品
体积（ml）
总蛋白量（mg）
步骤得率
总得率
粗酶液
35
428.6625
100%
100%
30%硫酸铵盐析上清液
40.8
161.6406
37.71%
37.71%
70%硫酸铵盐析沉淀
4
9.52
5.89%
2.22%
凝胶层析峰1
12
3.0222
31.75%
0.71%
凝胶层析峰2
12
1.07124
11.25%
0.25%
由表三可知，粗酶液经30%饱和度的硫酸铵盐析后，蛋白总得率有37.71%，比率比较小，损失较多。
上清液经70%饱和度的硫酸盐沉淀后，步骤得率及总得率大幅下降，只有2.22%，而凝胶层析峰1的步骤得率31.75%，总得率只有0.71%，凝胶层析峰2的步骤得率与峰1相近，总得率降至0.25%。
分离纯化所得的蛋白量较少。
纯化所得样品中的纳豆激酶的纯度及其酶活暂未测定。
图中第一个层析峰析出来的蛋白质含量较高，由此可以看出第一个层析峰析出来的是纳豆激酶，而第二个峰析出来的是一些小分子的杂质蛋白质。
5讨论
5.1过程分析
盐析：
1.提取到的纳豆激酶的含量比较少，可能是由于第二次用饱和硫酸铵溶液对蛋白质进行盐析的时间并没有足够长，导致一部的的纳豆激酶还没有析出来就用于下一步的分离和纯化中。
也可能是在第一次盐析时候将部分纳豆激酶也析出，离心后成沉淀弃去。
2.经过多步的盐析会导致一部份目标蛋白质的损失，如果能增加各个步骤之间的连续性，可能会提高目标蛋白质的含量。
3.温度也会影响到纳豆激酶的分离纯化，如果在低温下进行分离纯化，将会得到更高的回收率。
装柱与洗脱：
1.在装填凝胶柱的时候，由于凝胶装填中可能没有均匀的装填，使得层析柱上，有一定的空间是没有凝胶，所以在层析中，可能会因为一部的蛋白质滞留在空白区域中没有被洗下来，导致蛋白质得率不高。
2．在柱口有气泡的话，会导致洗脱的速度十分缓慢，本实验期间换了2次凝胶柱，才使得洗脱速度正常。
3.在经过几次不同时间分离出来在层析峰周围的蛋白质溶液，由于其受到多种因素的影响，相互混合在一起时会使得光吸收值会偏低，使得所要测得纳豆激酶的总蛋白量偏低，造成得率也相对偏低。
5.2问题及其猜想
5.2.1为什么不同小组的层析速度差异巨大？
答：
可能原因：
1.层析柱凝胶的高度和密度不一
2.柱中凝胶的含水率、纯度和粘度等不一
3.层析柱的开关孔径和隔膜孔径差异
4.填补凝胶柱的时候，层析柱开关下的空气没有排尽
5.层析柱出口的液柱高度不同，导致液体被牵引的力不同
5.2.2如何提高层析图的精确度？
答：
1.用更高的凝胶柱，或者控制开关，减慢洗脱液流速，令样品层析时间加长，则可以得到更加密集的点阵，更高的精确率。
2.在接到滤液的时候尽快测量分光光度值，以防空气氧化或者空气沉降物导致结果差异。
3.加大粗酶液用量，令峰值更高，拉大基准值，以减少误差。
5.2.3葡聚糖凝胶分离纯化的原理是什么？
答：
葡聚糖在一系列交联剂、引发剂的作用下，形成凝胶颗粒。
凝胶颗粒内部具有多孔网状结构，被分离的混合物流过层析柱时，比凝胶孔径大的分子不能进入凝胶孔内，在凝胶颗粒之间的空隙向下移动，并最先被洗脱出来；比网孔小的分子能不同程度的自由出入凝胶孔内外，在柱内经过的路程较长移动速度较慢，最后被洗脱出来。
5.2.4蛋白质盐析的原理是什么？
为什么粗酶液要采用30％饱和度的硫酸铵和60％饱和度的硫酸铵进行盐析？
为什么第一次盐析取上清液和第二次盐析取沉淀？
答：
蛋白质是亲水胶体,当加入适量的轻金属盐类时蛋白质分子即处于高渗透压的溶液中,使蛋白质外周水化膜被破坏，同时盐类的离子中和了蛋白质分子的电荷,结果蛋白质的胶体稳定性遭到破坏而沉淀，但是蛋白质自身结构不发生改变。
盐析的目的是为了把目标蛋白质从溶液中分离出来，但是溶液中含有杂质蛋白质。
于是我们利用不同饱和度的盐溶液可以让不同种类的蛋白质沉淀的原理，用30％饱和度的硫酸铵来盐析出杂质蛋白质，60％饱和度的硫酸铵来盐析我们要的蛋白酶，所以第一次盐析、离心后取上清，第二次才取沉淀溶解。
这是也就是纯化的过程。
5.2.5本次实验中PBS缓冲液的作用是什么？
答：
PBS缓冲溶液是pH为7.4的磷酸盐缓冲生理盐水，蛋白质要在适当的ph值，适当的渗透压下才能保持结构，否则容易凝集在一起，就分离不开了。
所以，PBS作为凝胶层析的平衡液、洗脱液，有稳定PH值、保持渗透压的作用，保证蛋白质在层析过程中保持原有状态。
参考文献
[1]刘超.凝胶层析分离提纯纳豆激酶研究[J].食品研究与开发，2010,31（8）:
173-176
[2]丁贵平,蔡正森,王正刚.纳豆激酶的分离提纯及生化研究[J].氨基酸和生物资源,2001,23（3）:
13-16
[3]朱建辉,杜连祥,路福平,刘晓兰,王萍.纳豆纤溶酶—纳豆激酶的分离提纯及稳定性研究[J],食品研究与开发,2005,26（5）:
45-48
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