微生物法高效综合利用植物秸秆新技术的研究进展.docx

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微生物法高效综合利用植物秸秆新技术的研究进展

微生物法高效综合利用植物秸秆新技术的研究进展

目前，植物秸秆的生物高效综合利用已成为研究的热点，开发潜力很大。

利用微生物产酶实现植物秸秆降解得到单糖和低聚糖，再通过微生物发酵得到人类亟需的能源、食物和化工原料，如乙醇、乳酸和香兰素等，从而取代目前用淀粉原料发酵生产的各种产品，以及由化工原料合成生产的部分有机产品。

这将有利于推动综合治理环境污染，缓解食物短缺和能源危机，具有重大的社会、经济和生态效益。

要实现微生物法综合利用植物秸秆，一方面可以先对植物秸秆组分进行有效分离，然后对各组分进行开发利用；另一方面，可从微生物生态学原理出发，筛选高效降解植物秸秆木质纤维类物质的菌株，科学组合菌株，合理构建混合生态体系（或者利用基因重组技术构建工程菌株），优化微生物菌株的发酵条件，获得各种高附加值的发酵产物，实现植物秸秆生物量的全利用。

1植物秸秆的组成及降解酶系

植物秸秆的主要组成是木质素、半纤维素和纤维素，合称木质纤维素。

木质素与半纤维素作为外围基质将植物秸秆纤维素包裹，起到保护作用。

因此，木质素和半纤维素势必影响纤维素酶与纤维素类物质的有效接触，只有充分降解木质素和半纤维素或解除外围基质的包裹才可实现植物秸秆纤维素的全降解。

1．1木质素及其降解酶系

    木质素是由类苯丙烷亚单位（主要是对香豆醇、松柏醇和芥子醇），以非线性方式随机组成的一类天然聚合物，其前体物种类和连接键类型的多样性意味着结构的异质性与不规则性，也决定了对其进行生物降解的复杂性和特殊性。

邓勋等利用平菇对稻草的木质素进行降解，发现产物为芳香醇类、脂肪醇类、酚类、芳香酸酯类及羧酸类等小分子化合物。

Glenn等和Tien等从黄孢原毛平革菌（Phanerochaetechrysosporium）的木质素降解培养液中分离到了两种依赖于H202的酶：

木质素过氧化物酶（简称LiP）和锰过氧化物酶（简称MnP），并在后续研究中证明了这两种酶在木质素降解过程中起关键作用。

Yoshida早在1883年于紫胶漆树（Rhusvernicif-era）的渗出液中，发现了漆酶（简称Lac），即对苯二酚氧化酶，但对该酶的降解机制和生理作用不是很清楚。

Ander等比较了Sporotrichumpulverulentum的野生型、酚氧化酶突变型和酚氧化酶正向回复突变型菌株降解木质素的能力，发现野生型与回复突变型菌株均具备降解木质素的能力，而突变型菌株只有在人为添加了漆酶后，才能将木质素降解，这充分证实了漆酶在木质素降解中的重要作用。

目前，普遍认为lAP、MnP和Lac为木质素降解酶系的主要组分。

1．2半纤维素及其降解酶系

    半纤维素是由戊糖和己糖等聚合而成的无定型生物高聚物，在温和条件下较容易水解成单糖。

主要降解产物为木糖，约占降解物的90％。

半纤维素酶系也是一种多酶体系，主要为木聚糖降解酶系和甘露聚糖酶系。

木聚糖降解酶系主要包括两种组分，其中B一1，4木聚糖酶以内切方式作用于木聚糖分子中的B-1，4木糖苷键，产物为木二糖等低聚寡糖，并伴有少量木糖和阿拉伯糖；B一木糖苷酶水解木寡糖产生单糖。

甘露聚糖酶系主要包括3种组分，其中内切甘露聚糖酶作用于高聚糖分子内部的非结晶区，随机水解甘露糖苷键，截短长链分子，产生大量带非还原性末端的小段糖链；外切甘露聚糖酶作用于高聚糖线性分子末端，水解产物为一个二糖分子；B一甘露糖苷酶将二糖彻底降解成单糖。

1．3纤维素及其降解酶系

    纤维素是由葡萄糖苷通过B一1，4糖苷键联接起来的链状高分子化合物，是地球上最丰富的生物聚合物，其水解产物是纤维二糖和葡萄糖。

    纤维素酶同样是一种多酶体系，主要由以下3类酶组成：

（1）内切葡聚糖酶（简称Cx），能随机地水解纤维素底物分子糖苷键，产生大量带非还原性末端的小分子纤维素；

（2）外切葡聚糖酶，又称纤维二糖水解酶（简称CBH），作用于纤维素线状分子的非还原性末端，释放出纤维二糖和葡萄糖；（3）p一葡萄糖苷酶（简称BG），也称纤维二糖酶，水解纤维二糖、纤维三糖，得到葡萄糖。

这3类酶的协同作用实现了天然纤维素的降解。

一般认为，首先是内切葡萄糖酶进攻纤维素的非结晶区，形成外切纤维素酶所需的新的游离末端，然后外切纤维素酶从非还原末端切下纤维二糖单位，最终B一葡萄糖苷酶水解纤维二糖单位，得到葡萄糖。

也有人认为，天然纤维素首先在一种非水解性质的解链因子或解氢键酶作用下，其链间和链内氢键被打开，形成无序的非结晶纤维素，然后在3种酶的协同作用下水解为纤维糊精和葡萄糖。

目前，纤维素酶的降解机理还需更深入的研究。

2微生物对植物秸秆分离组分的高效利用

    组分分离方法使得植物秸秆综合利用成为可能，即先通过一定的工艺实现植物秸秆木质素、半纤维素和纤维素三组分的有效分离，得到的各组分再采用微生物法转化得到不同的产物，从而使植物秸秆实现全生物量高效利用。

    Chen等采用蒸汽爆破技术与乙醇抽提相结合实现麦草组分分离。

Zhang等采用浓磷酸／丙酮萃取工艺在温和条件下进行木质纤维素的组分分离，得到了无定型纤维素、半纤维素和木质素。

黄仁亮等提出甲酸在常压中温下预处理玉米芯分离组分的工艺路线，在该体系中半纤维素迅速发生水解，大部分木质素被溶解，而纤维素基本不发生水解，经固液分离和甲酸回收实现了玉米芯三大组分的有效分离。

当甲酸浓度为88％（W）、反应温度为60℃、处理时间为3h时，纤维素、半纤维素和木质素回收率分别可达91．4％、88．5％和63．7％。

    研究发现，白腐菌和软真菌对木质素具有较强的降解作用。

细菌对木质素的降解作用也起着重大影响，因为细菌繁殖速度快，且能使木质素发生改性，以便于后期真菌降解木质素。

目前，用木质素生物降解法生产香兰素处在生产实验研究阶段。

木质素可用作肥料的载体，吸附或包裹肥料，从而达到肥料缓释的目的，这是因为木质素作为土壤腐殖质的前体物质，在土壤中被微生物降解的过程非常缓慢。

而且。

还可以对木质素进行化学加氨，提高其含氮量，得到优良缓释肥料，江启沛等制得的氨化草浆木质素总氮占11．62％，氨态氮占4．12％。

    分解半纤维素的微生物分布非常广泛，包括细菌、放线菌和真菌。

丝状真菌由于产木聚糖酶水平高于酵母和细菌，且为胞外分泌而备受关注。

另外，一些极端微生物因其具有极端特性如耐高温等，也逐渐受到关注。

利用微生物发酵半纤维素可得到木糖醇、单细胞蛋白、乙醇、2，3一丁二醇等。

丁兴红等发现假丝酵母ZU-04（Candidasp．ZU-04）在分阶段改变通气速率条件下，前期（O～24h）通气速率为3．75IMmin，后期（24～96h）通气速率为0．75IMmin，发酵半纤维素水解液产木糖醇的效果很好，木糖醇得率达76．O％，体积生产速率为0．76g／（L．h），该工艺为工业上利用半纤维素水解液大规模发酵生产木糖醇奠定了基础。

放线菌、细菌、真菌中都具有能分解利用纤维素能力的类群。

放线菌可耐高温和各种酸碱度，目前国内外的许多研究者正致力于放线菌产纤维素酶的研究。

细菌产纤维素酶量较低，而且主要是葡聚糖内切酶，对结晶纤维素没有活性。

真菌的纤维素酶系为全酶系，纤维素酶降解活性较强，所以目前关于真菌产纤维素酶的研究较多。

微生物发酵纤维素可以得到酒精、单细胞蛋白、乳酸等。

王丹等筛选到的粗糙脉孢菌（NeurosporacrassaAS3．1602）具有较好的直接转化纤维素生产酒精的能力，经过初步优化后，酒精产量和转化率分别达到6．7g／L和33．5％。

陈洪章等提出纤维素固相酶解一液体发酵相耦合的技术可以有效地提高纤维素酶解效率和乙醇发酵效率，降低纤维素酶解发酵乙醇的成本。

庄桂以稻草纤维素糖化液为主料进行乳酸发酵，温度为50~C，7d后发酵液中乳酸积累量为132g／L，乳酸转化率为88％，达到了同型乳酸发酵的转化率水平。

3构建微生物混合生态体系降解植物秸秆

人们发现许多微生物（如真菌和细菌）混合在一起，相互协作，发挥各菌群的不同酶解作用，从而达到植物秸秆木质纤维素降解的目的。

比如，细菌粘附在纤维素上后，从纤维的表面向内部增生，在接触点处纤维素被溶解；而丝状真菌是由内向外降解纤维素，使纤维逐渐被分解破坏，所以细菌与丝状真菌的混合发酵能够实现优势互补。

孟雷等从酶系组成、酶蛋白结构形式、理化性质、酶分子结构和功能等多方面分析了纤维素酶的多型性，这在某种程度上诠释了微生物协同降解木质纤维素的现象。

喻曼等用PLFA谱图分析法表征反应体系的生物量，发现稻草固态发酵过程中微生物群落结构呈动态变化，微生物对木质纤维素的降解表现出明显的阶段性，即首先利用最易降解的半纤维素，在生长稳定后开始降解纤维素，一定程度的降解后又开始木质素的代谢，这为研究混合发酵提供了一定的理论基础。

为了实现目的产物的最大化产出，我们需构建微生物不同种群的混合生态体系。

3．1  原核微生物混合生态体系协同降解植物秸秆

    高丽娟等将乳酸菌复合系SFC-2，植物乳杆菌（Lactobacillusplantarum）、发酵乳杆菌（Lactobacillusfermentum）和类干酪乳杆菌（Lactobacillusparacasei）．混合接入到含水量为70％（质量浓度）的水稻秸秆，研究发酵物饲料化的效果及发酵物中微生物群落的动态。

经混合菌发酵后，复合系中的乳酸菌迅速成为发酵料中的优势菌群，发酵15d后pH值降至3．8，发酵料中乳酸生成量增加，尤其是L-乳酸增加了约2倍，粗蛋白含量提高了10．16％，粗纤维含量降低了3．2％，发酵品质得到明显改善。

包红旭等的研究结果表明，梭杆菌（Clostridi—umsp．X9）和哈尔滨产乙醇杆菌B49（EthanoigenensharbinenseB49）混合发酵玉米秸秆产氢较X9单一菌株产氢表现出明显优势，当两菌种以体积比（1：

1）复配，接种量10％，40~C复合培养，24h的最大单位体积产氢量（Ym）和玉米秸秆降解率分别为1530mL／L和61．8％。

X9菌株单独降解玉米秸秆产氢时，在12h达到最大值，其产氢量（Ym）仅为786mL／L，之后产氢过程进入停滞期。

而B49菌株在单独降解玉米秸秆产氢时，氢气产量很少，最大的产氢量（Ym）只能达到21mL／L，可见两菌种间存在协同降解产氢效应。

3．2真核微生物混合生态体系协同降解植物秸秆

    司美茹等研究了假丝酵母（Candida）对黑曲霉（Aspergillusniger）、烟曲霉（AspergiUus丘migalus）固态发酵中相关酶系的影响。

结果表明，接入少量假丝酵母可大幅度提高两种曲霉纤维素酶体系中滤纸酶（FPA）、羧甲基纤维素酶（CMCase）、微晶纤维素酶（AVI）及淀粉酶的活性，这4种酶活较黑曲霉单独培养时分别提高了36．1％、11．1％、16．2％和41．8％，较烟曲霉单独培养时分别提高了24．9％、52．8％、40．8％和163．5％。

而且此时酶蛋白的合成和分泌量大幅增加。

分析认为，是酵母菌利用了水解形成的葡萄糖、纤维二糖等小分子还原糖，从而解除了还原糖对纤维素酶和淀粉酶合成的阻遏。

    李爱华等以玉米秸、麦秸、稻草为碳源，配合10％麦麸、40％麦芽粉、3％豆饼粉和3％玉米面，将白地霉、米曲霉按10％接种量接入，在28~（2条件下发酵3d，玉米秸秆粗蛋白由5．62％提高到19．6％，稻草粗蛋白由5．7％提高到17．31％，麦秸粗蛋白由5．06％提高到16．7％，分别提高了2．29倍、2．3倍和2．04倍。

    王振宇等构建的二元混菌体系一黑曲霉（As—pergillusniger）和绿色木霉（Trichodermaviride）在最佳产酶条件（菌种比例为l：

1，起始pH值为5，秸秆颗粒度为0．2461／11n，麸皮与秸秆比l：

4）下混合发酵时，FPA酶和CMC酶活力较单菌绿色木霉发酵提高了48．9％和43．4％。

黄茜等采用平菇（Pteurorusostreatus）和康氏木霉（Trichodermakoningii）二步混合发酵法有效实现稻草的降解。

首先于稻草固态培养基中接人生长优势较弱的平菇，待其生长一定时间后，再接入康氏木霉。

实验发现，H6-TIO组合（两种菌株接种的时间间隔为6d）的降解效果最好，稻草木质素降解率达到44．77％，纤维素降解率达到41．48％。

3．3原核与真核微生物混合生态体系降解植物秸秆

    史玉英等发现细菌与真菌之间具有比较强的相互作用，当芽孢杆菌（Bacillus）单独接在滤纸上时，不能扩散生长，分解滤纸能力较弱；当同时接人木霉（Trichoderma）时，滤纸的分解速度则明显加快，原因在于细菌能随着真菌的生长而扩散。

    赵小蓉等的研究也证实了细菌与真菌之间存在较强的相互作用，且作用效果并不是简单的加和效应。

他们将分解纤维素能力较强的3株菌：

产黄纤维单胞菌W9801Bn（CellulomonasflavigenaW9801Bn）、康氏木霉W9803Fn（Tr／chodermakonigiiW9803Fn）和反曲毛壳W9804Fw（ChaetomiumreflexumW9804Fw），混合接种于稻草发酵培养基中，发现混合菌分解纤维素的能力强于单一菌株，稻草失重率增加了2．13％～25．50％。

当产黄纤维单胞菌与康氏木霉混合发酵时，对稻草纤维素的分解能力，比单菌株增加了25．50％。

    蒲一涛等对棕色固氮菌M-15（Azotobactervine—landiiM-15）和拟康木霉M103（Tr／chodermaPseadokoningiiM103）做了混合培养与单菌株培养，研究菌数目与菌液含氮量的变化情况。

结果发现在混合培养条件下，两种菌能相互利用、相互促进，二菌数目增加，固氮能力提高，与二菌株单独培养相比较，均具有极显著性差异。

    任佐华采用黑曲霉（Aspergillusniger）、枯草芽孢杆菌（Bacillussubtilis）、产朊假丝酵母（Candidauti-lis）对水稻秸秆进行混菌协同发酵研究，发酵工艺为先接种10％的枯草芽孢杆菌培养液，在32~C恒温条件下培养24h，再接l％黑曲霉培养物培养48h，最后接入30％酵母菌培养液培养48h。

结果显示发酵后秸秆的蛋白质、氨基酸含量得到提高，测得发酵终产物粗蛋白含量为15．22％，达到了产蛋鸡饲料的粗蛋白含量（14％～16％）要求。

刘薇等选用串珠霉（Moniliasp．）与链霉菌（Streptomycesp．）进行了二菌株混合发酵产纤维素酶的研究。

发现二菌株混合发酵产CMC酶、FPA酶、B一葡萄糖苷酶酶活分别是单菌发酵的2．79～4．25倍、1．47～2．39倍、5．4～7．13倍。

摸索出二菌株混合发酵产纤维素酶的最佳条件：

起始pH值为4．5，串珠霉与链霉菌的接种比例为2mL：

3mL，先37~C发酵4d再28℃发酵2d。

产CMC酶、FPA酶和B一葡萄糖苷酶酶活分别为3．83IU／mL、1．56IU／mL和2．56IU／mL，比优化前提高1．1l～5．57倍、1．01～1．63倍和1．1l～9．68倍。

4构建可降解利用植物秸秆的工程菌株

    从生理、代谢和遗传角度对混合菌间关系和协同作用机制进行深人研究，对构建重组菌以实现混菌培养效果的理论研究和应用技术的突破有重大价值。

以具有共生或互生关系的微生物为宿主，利用细胞融合或基因工程技术构建工程菌，可使得工程菌具有混合培养的功能，同时又拥有纯培养菌株营养要求单一，生理代谢稳定，易于调控等优点。

木质纤维素发酵产酒精能够缓解能源危机，开发具有高效转化木质纤维素得到酒精能力的工程菌株成为研究的热点。

传统的乙醇生产菌株酿酒酵母（Saccharomyceseerevisiac）不能发酵木糖，用DNA重组技术构建同化木糖基因工程菌可以解决这一问题。

张清等成功构建了重组表达质粒pYX-sXY-LAXKSl（sXYLA为木糖异构酶基因，源自定点突变改造后的TheFlnusthermophilus；XKSl为木酮糖激酶基因，源自Saccharomycescerevisiae），并在酿酒酵母YPH499中实现了组成型共表达。

以葡萄糖和木糖为混合碳源初步进行半通氧发酵，代谢产物分析表明重组酿酒酵母木糖的消耗为4．75g／L，乙醇的产量为0．839g／L，分别比出发菌提高20．9％和14．8％。

Mat—sushika等将毕赤树干酵母（Pichiastipitis）中编码代谢木糖的木糖还原酶和木糖醇脱氢酶的基因整合到酿酒酵母（Saccharomycescerevisiae）中，同时使得内源性的木酮糖激酶超量表达，所得重组酵母菌株不仅能够代谢葡萄糖，而且能够代谢木糖。

最终筛选到3株活力很强的重组菌株MA-R4、MA-S4和MA-T4，其利用木质纤维素水解产物发酵产乙醇量分别为理论值的93．2％、92．8％和91．7％。

5展望

    我国植物秸秆资源丰富，微生物法综合利用植物秸秆具有其他物理化学方法不可替代的优点，对提高植物秸秆资源利用率，保护环境具有重大的意义。

如何实现植物秸秆各组分的有效分离及生物转化，如何提高植物秸秆的降解速率及目的降解产物量是实现植物秸秆产业化综合利用的关键所在。

国内外已有人进行利用混合发酵方法提高木质纤维素类酶活性的探索，但都是较为简单和随机的混合。

若能够从自然界的生物质腐败现象中找出其腐败的规律，并以此为依据建立人工干预机制，构建植物秸秆快速降解微生物生态体系或利用基因重组手段构建工程菌株，这将极大推动植物秸秆高效综合利用，大大提高植物秸秆的附加价值。