高中生物技术与生物工程基因工程和蛋白质工程第1节基因工程的原理学案.docx
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高中生物技术与生物工程基因工程和蛋白质工程第1节基因工程的原理学案
第一章 基因工程和蛋白质工程
第一节 基因工程的原理
1.简述基因工程的诞生。
2.简述基因工程的原理及技术。
(重点)
3.尝试DNA的提取与鉴定。
(难点)
基因工程的诞生与操作工具
1.诞生历程
时间
科学家
事件
1967年
发现了DNA连接酶
1970年
史密斯等
首次提取出核酸限制性内切酶
提取了T4DNA连接酶
1972年
伯格等
构建了世界首例体外重组的杂合DNA分子
1973年
科恩等
成功培育出双重抗性大肠杆菌
2.操作工具
(1)核酸限制性内切酶——“基因手术刀”
(2)DNA连接酶——“基因缝纫针”
①作用:
将两个DNA片段连接起来,修复被限制性内切酶切开的切口,拼接成新的DNA分子。
②种类:
T4DNA连接酶(把限制性内切酶切开的黏性末端的缝隙“缝合”起来)。
(3)载体——“分子运输车”
①载体的特点
ⅰ.外源DNA的插入不影响载体在宿主细胞内的自我复制。
ⅱ.有适宜的限制性内切酶酶切位点,最好是对多种限制性内切酶有单一切点。
ⅲ.具有某些标记基因。
ⅳ.载体应对受体细胞无害。
②载体的种类:
ⅰ.质粒:
它是细菌中独立于细菌DNA之外的小型环状DNA分子。
ⅱ.噬菌体或其他一些病毒。
探讨
:
下图表示限制性内切酶切割某DNA分子的过程,从下图中可知,该限制性内切酶能识别的碱基序列及其切割位点是什么?
提示:
GAATTC,切点在G和A之间。
探讨
:
结合DNA复制的过程分析,限制性内切酶和DNA解旋酶的作用部位有何不同?
提示:
限制性内切酶作用于磷酸和脱氧核糖之间的磷酸二酯键,DNA解旋酶作用于两个碱基之间的氢键。
探讨
:
如图,两个核酸片段在适宜条件下,经X酶的催化作用,发生了下述变化,则X酶是什么?
提示:
DNA连接酶。
1.核酸限制性内切酶
(1)来源和种类
切割DNA的工具是核酸限制性内切酶,又叫限制酶,这类酶主要是从原核生物中分离纯化出来的。
迄今已分离出的约有4000种。
(2)作用
限制酶能够识别双链DNA分子的某种特定核苷酸序列,并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开。
(3)识别序列的组成
一般由6个核苷酸组成,少数由4、5或8个核苷酸组成。
(4)作用结果
当限制酶在它识别序列的中心轴线两侧将DNA的两条链分别切开时,产生的是黏性末端;而当限制酶在它识别序列的中心轴线处切开时,产生的则是平末端。
【特别提示】 ①限制酶作用的结果通常有两种形式——黏性末端或平末端;
②限制酶的作用特点体现了酶的专一性。
2.DNA连接酶
(1)分类
根据DNA连接酶的来源不同,可以将这些酶分为两类:
①从大肠杆菌中分离得到的DNA连接酶,称为E·coliDNA连接酶;
②从T4噬菌体中分离出来的DNA连接酶,称为T4DNA连接酶。
(2)作用
这两类酶都是将双链DNA片段“缝合”起来,恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键。
【特别提示】 E·coliDNA连接酶只能将双链DNA片段互补的黏性末端之间连接起来,不能将双链DNA片段平末端之间进行连接。
而T4DNA连接酶既可以“缝合”双链DNA片段互补的黏性末端,又可以“缝合”双链DNA片段的平末端,但连接平末端之间的效率比较低。
3.载体
(1)常用载体——质粒
质粒是一种裸露的、结构简单、独立于细菌拟核DNA之外,并具有自我复制能力的小型环状DNA分子。
(2)载体的条件
①能够在宿主细胞中稳定地保存,并能够复制,以便提供大量的目的基因;
②具有多个限制酶切割位点,便于与外源基因结合;
③具有标记基因,便于进行检测和筛选。
(3)其他载体
在基因工程中使用的载体除质粒外,还有λ噬菌体的衍生物、动植物病毒等。
1.下列关于限制酶和DNA连接酶的理解正确的是( )
A.其化学本质都是蛋白质
B.DNA连接酶可以恢复DNA分子中的氢键
C.在基因工程操作中可以用DNA聚合酶代替DNA连接酶
D.它们不能被反复使用
【解析】 限制酶和DNA连接酶的化学本质均为蛋白质,DNA连接酶的作用是将两个DNA片段连接起来,DNA聚合酶的作用是把单个脱氧核苷酸连成脱氧核苷酸链。
【答案】 A
2.核酸限制性内切酶Ⅰ的识别序列和切点是—G↓GATCC—,核酸限制性内切酶Ⅱ的识别序列和切点是—↓GATC—。
在质粒上有酶Ⅰ的一个切点,在目的基因的两侧各有一个酶Ⅱ的切点。
(1)请画出质粒被限制酶Ⅰ切割后所形成的黏性末端。
(2)请画出目的基因两侧被限制酶Ⅱ切割后所形成的黏性末端。
(3)在DNA连接酶的作用下,上述两种不同限制酶切割后的片段是否可以连接?
为什么?
【解析】 本题考查核酸限制性内切酶切割DNA的方式,将限制酶能识别的序列写出,再将限制酶切点处标出,可用虚线画出,然后可沿着虚线将片段一分为二,这样便能正确画出核酸限制性内切酶将DNA切出的黏性末端了。
若限制酶切割后产生的黏性末端能互补配对,形成的黏性末端便能连接,否则不能。
【答案】
(1)
目的基因
(2)
目的基因
(3)可以连接;因为由两种不同限制酶切割后形成的黏性末端是相同的(或是可以互补的)。
基因工程的概念与一般程序
1.概念
基因工程是指按照人们的意愿,将一种生物的基因在体外剪切,并与特殊的运载工具进行重新组合,然后转入另一种生物的体内进行扩增,并使之表达产生所需蛋白质的技术。
它可以在分子水平上定向改造生物的遗传性状。
2.一般程序
(1)目的基因的获得
①目的基因:
在基因操作中使用的外源基因。
②获取方法
ⅰ.直接分离法:
直接从基因组中获取目的基因,最常用的方法是“鸟枪法”,又称“霰弹法”。
ⅱ.人工合成法:
主要包括反转录法和化学合成法两种。
(2)重组载体的构建
①方法:
用同一种限制性内切酶分别切割质粒和目的基因,再用DNA连接酶将它们连接起来。
②重组载体的作用:
携带外源DNA分子片段进入受体细胞。
(3)重组载体的导入和筛选
①转化:
将带有目的基因的重组载体与相应的受体细胞放在一起培养,通过一定的方式进行诱导,使之进入受体细胞的过程。
②转化方法
ⅰ.运用载体进行转化。
ⅱ.基因枪法。
ⅲ.显微注射法。
ⅳ.花粉管通道法。
③筛选方法:
利用选择培养基培养转化后的受体细胞。
(4)目的基因的表达和鉴定
通过检测转化的生物有没有显示出目的基因控制的性状来进行鉴定。
探讨
:
依据某一蛋白质的氨基酸序列合成的目的基因,其脱氧核苷酸序列是否是唯一的?
提示:
不是。
因为一种氨基酸可能有多种密码子来决定。
探讨
:
采用基因工程的方法培育抗虫棉,下列导入目的基因的做法正确的有哪些?
①将毒蛋白注射到棉受精卵中 ②将编码毒蛋白的DNA序列注射到棉受精卵中 ③将编码毒蛋白的DNA序列与质粒重组,导入细菌,用该细菌感染棉的体细胞,再进行组织培养 ④将编码毒蛋白的DNA序列与细菌质粒重组,注射到棉的子房并进入受精卵
提示:
③④。
探讨
:
如何检测抗虫棉中的毒蛋白基因是否表达?
提示:
让棉铃虫取食抗虫棉,若棉铃虫食后死亡,说明毒蛋白基因表达。
1.目的基因的获取
(1)从基因文库中获取目的基因
①基因组文库:
如果一个基因文库中包含了一种生物所有的基因,这种基因文库就叫做基因组文库。
②部分基因文库:
如果一个基因文库中只包含了一种生物的一部分基因,这种基因文库就叫做部分基因文库,如cDNA文库。
(2)人工合成目的基因有两个途径:
①反转录法:
就是以目的基因转录成的mRNA为模板,反转录成单链DNA,再合成双链DNA。
②直接合成法:
就是以已知蛋白质的氨基酸序列为基础,推出mRNA的核苷酸序列,再推出目的基因序列,然后进行人工合成。
(3)利用PCR技术扩增目的基因
PCR技术扩增目的基因与DNA复制的比较
PCR技术
DNA复制
相同点
原理
碱基互补配对
原料
四种脱氧核苷酸
条件
模板、ATP、酶
不同点
解旋方式
DNA在高温下变性解旋
解旋酶催化
场所
体外复制
细胞核内
酶
热稳定的DNA聚合酶(Taq酶)
细胞内含有的DNA聚合酶
结果
在短时间内形成大量的DNA片段
形成整个DNA分子
【特别提示】 从基因文库中获取目的基因和利用PCR技术扩增目的基因时,目的基因已存在。
人工合成目的基因时,目的基因从无到有。
2.重组载体的构建
(1)构建目的
其目的是使目的基因在受体细胞中稳定存在,并且可以遗传给下一代,同时使目的基因能够表达和发挥作用。
(2)构建零件及其作用
①目的基因
②启动子:
一段有特殊结构的DNA片段,位于基因的首端,它是RNA聚合酶识别和结合的部位,有了它才能驱动基因转录出mRNA,最终获得所需要的蛋白质。
③终止子:
相当于一盏红色信号灯,使转录在所需要的地方停止下来。
终止子位于基因的尾端,也是一段有特殊结构的DNA短片段。
④标记基因:
其作用是为了鉴别受体细胞中是否含有目的基因,从而将含有目的基因的细胞筛选出来,如抗生素抗性基因就可以作为这种基因。
【特别提示】 由于受体细胞有植物、动物、微生物之分,以及目的基因导入受体细胞的方法不同,因此,基因表达载体的构建也会有所差别,不可能是千篇一律的。
3.重组载体的导入与筛选
(1)转化:
将带有目的基因的重组载体导入受体细胞的过程。
①过程图解
【特别提示】 上图中b与a相比,b会使目的基因的遗传特性得以稳定维持和表达,原因是:
在进行细胞分裂时,细胞核上的DNA经复制后平均分配到两个子细胞中,保证了亲子代遗传性状的稳定性;而a细胞分裂时,细胞质是不均分的,子细胞不一定含有目的基因,其优越性在于能有效预防基因污染。
②不同细胞转化的比较
生物种类
植物细胞
动物细胞
微生物细胞
常用方法
花粉管通道法
显微注射法
Ca2+处理法
受体细胞
体细胞
受精卵
原核细胞
转化
过程
a.用目的基因转化花粉→受精→获得转化植株
b.将目的基因滴在剪开的柱头上,使其沿花粉管进入胚囊,完成转化
将重组DNA分子提纯→取卵(受精卵)→显微注射→受精卵发育→获得具有新性状的动物
Ca2+处理细胞→感受态细胞→重组DNA分子与感受态细胞混合→感受态细胞吸收DNA分子
(2)筛选含有目的基因的受体细胞
①原理:
质粒上有抗生素的抗性基因。
②方法:
利用选择培养基筛选。
4.目的基因的表达和鉴定
目的基因导入受体细胞是否能够表达要通过检测来确认,检测的方法有:
(1)分子水平检测:
①导入检测:
DNA分子杂交技术,即使用放射性同位素标记的含目的基因的DNA片段作为探针检测。
②表达检测
(2)个体生物学水平鉴定:
对转基因生物进行抗虫或抗病的接种实验。
1.下列不属于获取目的基因方法的是( )
A.从基因文库中获取目的基因
B.转录法
C.反转录法
D.根据已知氨基酸序列合成法
【解析】 解答此题从如下两个方面入手分析:
①获取目的基因的途径有两条:
一条是直接分离基因,另一条是人工合成基因。
直接分离基因也就是“鸟枪法”,人工合成基因又有两条途径,一条是“逆转录法”,另一条是根据已知氨基酸序列合成基因。
②所谓转录是指以DNA的一条链为模板,遵循碱基互补配对原则,合成mRNA的过程。
此过程不能获得DNA(基因)。
【答案】 B
2.下图是将人的生长激素基因导入细菌B细胞内制造“工程菌”的示意图,所用载体为质粒A。
已知细菌B细胞内不含质粒A,也不含质粒A上的基因,质粒A导入细菌B后,其上的基因能得到表达。
请回答下列问题。
(1)如何将目的基因和质粒A相结合形成重组质粒(重组DNA分子)?
________________________________________________________________
________________________________________________________________
(2)目前把重组质粒导入细菌细胞时效率还不高,导入完成后得到的细菌,实际上有的根本没有导入质粒,有的导入的是普通质粒A,只有少数导入的是重组质粒。
可以通过如下步骤来鉴别得到的细菌是否导入了质粒A或重组质粒:
将得到的细菌涂抹在一个含有氨苄青霉素的培养基上,能够生长的就说明导入了质粒A或重组质粒,反之则没有。
使用这种方法鉴别的原因是
_______________________________________________________________。
(3)若把通过鉴定证明导入了普通质粒A或重组质粒的细菌放在含有四环素的培养基上培养,会发生的现象是__________________________;原因是______
_______________________________________________________________。
(4)导入细菌B细胞中的目的基因成功表达的标志是什么?
________________________________________________________________
________________________________________________________________
【解析】
(1)将目的基因和质粒A相结合形成重组质粒的过程是:
①用一定的限制性内切酶切割质粒A,使其出现一个有黏性末端的切口;②用同种限制性内切酶切割目的基因,产生相同的黏性末端;③将切下的目的基因片段插入到质粒A的切口处,再加入适量的DNA连接酶,使质粒A与目的基因结合成重组质粒。
(2)检测质粒或重组质粒是否导入受体细胞,均需利用质粒上某些标记基因的特性,即对已经导入质粒或重组质粒的、本身无相应特性的受体细胞进行检测,根据受体细胞是否具有标记基因的相应特性来确定。
抗氨苄青霉素基因在质粒A上,而且它与目的基因是否插入无关,所以,用含氨苄青霉素的选择培养基培养经过导入质粒A处理的受体细胞,凡能生长的则表明质粒A或重组质粒导入成功,不能生长的则无质粒A或重组质粒导入。
(3)抗四环素基因不仅在质粒A上,而且它的位置正是目的基因插入之处,因此当目的基因插入质粒A形成重组质粒时,此处的抗四环素基因的结构和功能就会被破坏,当然含重组质粒的细菌就不能在含四环素的培养基上生长;而质粒A上无目的基因插入,抗四环素基因的结构是完整的,含质粒A的细菌就能在含四环素的培养基上生长。
(4)基因成功表达的标志是受体细胞通过转录、翻译过程合成出相应的蛋白质,即人的生长激素。
【答案】
(1)用一定的限制性内切酶切割质粒A,使其出现一个有黏性末端的切口;用同种限制性内切酶切割目的基因,产生相同的黏性末端;将切下的目的基因片段插入到质粒A的切口处,再加入适量的DNA连接酶,使质粒与目的基因结合成重组质粒。
(2)普通质粒A和重组质粒都含有抗氨苄青霉素基因
(3)有的能生长,有的不能生长 导入普通质粒A的细菌能生长,因为普通质粒A上有抗四环素基因;导入重组质粒的细菌不能生长,因为目的基因插在抗四环素基因中,抗四环素基因的结构被破坏
(4)细菌细胞通过转录、翻译合成相应的蛋白质,即人的生长激素。
探究活动:
尝试DNA的提取与鉴定
1.实验原理
(1)十二烷基磺酸钠(SDS)能够使蛋白质变性,在研磨液中加入SDS可以使蛋白质与DNA分离。
乙二胺四乙酸二钠(EDTA)为DNA酶的抑制剂,可以防止细胞破碎后DNA分子被降解。
(2)DNA不溶于酒精溶液,但细胞中的许多其他物质可以溶于酒精溶液。
利用这一原理,我们可以提取出含杂质较少的DNA。
(3)DNA遇二苯胺(沸水浴)会染成蓝色,因此,二苯胺可以作为鉴定DNA的试剂。
2.活动程序
(1)DNA的粗提取
①材料准备
将新鲜菠菜和体积分数为95%的酒精溶液放入冰箱冷冻室,冷冻至少24h。
②研磨
称取30g新鲜菠菜叶片,切碎。
将菠菜碎片置于研钵(在冰上操作)中,加入10_mL研磨液,迅速研磨成糊状。
③过滤
在漏斗中垫上尼龙纱布,将菠菜研磨液滤入塑料烧杯中。
④离心
将滤液倒入5_mL塑料离心管中,以1000r/min的速度离心10min。
⑤加冷酒精
从离心管中取出上清液,倒入50mL塑料烧杯中,同时加入两倍体积的体积分数为95%的冷酒精。
用玻璃棒沿一个方向缓缓地搅拌溶液,溶液中会出现白色丝状物。
用玻璃棒将丝状物卷起,并用滤纸吸去上面的水分。
这种丝状物的主要成分就是DNA。
(2)DNA的鉴定
取一支20mL的试管,加入物质的量浓度为0.015mol/L的NaCl溶液5mL。
将得到的丝状物放入试管中,用玻璃棒搅拌,使丝状物溶解。
然后,向试管中加入4mL二苯胺试剂,混匀后用沸水浴(100℃)加热10min。
在加热过程中,随时注意试管中溶液颜色的变化。
探讨
:
如果实验材料改为鸡的血细胞,还需研磨吗?
为什么?
提示:
不需要,因为动物细胞无细胞壁。
探讨
:
在准备材料时,为什么要将菠菜叶片和酒精溶液进行预冷处理?
提示:
菠菜叶片预冷处理有利于破碎细胞;酒精溶液预冷处理有利于溶解DNA之外的其他物质从而提取含杂质较少的DNA。
探讨
:
在DNA提取过程中所用的容器为什么必须是塑料的而不是玻璃的?
提示:
由于玻璃表面带电荷,DNA中的磷酸基也带电荷而容易被吸附于玻璃表面,故实验中用塑料杯和试管可减少DNA损失。
1.DNA提取过程中需要的物质及作用
SDS
使蛋白质变性,从而使蛋白质与DNA分离
EDTA
防止细胞破碎后DNA分子被DNA酶降解
冷酒精
溶解DNA分子以外的其他物质,提取出含杂质较少的DNA
0.015mol/L
的NaCl溶液
溶解DNA
2.DNA粗提取实验成功的关键及注意事项
(1)在破碎细胞释放DNA的过程中,若是血细胞,加水后必须充分搅拌,应不少于5min;若是菜花,则应与研磨液混合,研磨时间不少于10min。
(2)用冷酒精浓缩和沉淀DNA时,所用的是95%的酒精,且必须经过充分预冷后才能使用。
(3)在用玻璃棒搅拌时,玻璃棒不能直接插入烧杯底部,并且搅拌要轻缓,以便获得较完整的DNA分子。
1.下列关于“DNA的粗提取与鉴定”实验叙述,错误的是( )
A.酵母和菜花均可作为提取DNA的材料
B.DNA既溶于2mol/LNaCl溶液也溶于蒸馏水
C.向鸡血细胞液中加蒸馏水搅拌,可见玻棒上有白色絮状物
D.DNA溶液加入二苯胺试剂沸水浴加热,冷却后变蓝
【解析】 酵母菌和菜花细胞的细胞核都含有DNA,可作为提取DNA的材料,A项正确;DNA能溶解在不同浓度的NaCl溶液中,且溶解度随着NaCl浓度的变化而改变,在利用渗透作用原理向生物材料中加入蒸馏水时,一方面促使细胞吸水涨破,另一方面释放出的DNA也溶解在蒸馏水中,B项正确;向鸡血细胞液中加蒸馏水搅拌,目的是加快细胞吸水涨破,释放其中的DNA,而DNA则溶解在蒸馏水中,因此玻棒上不可能有白色絮状物,C项错误;DNA溶液与二苯胺试剂经沸水浴加热会变蓝,D项正确。
【答案】 C
2.某生物兴趣小组开展DNA粗提取的相关探究活动,具体步骤如下。
材料处理:
称取新鲜的花菜、辣椒和蒜黄各2份,每份10g。
剪碎后分成两组,一组置于20°C、另一组置于-20°C条件下保存24h。
DNA粗提取:
第一步:
将上述材料分别放入研钵中,各加入15mL研磨液,充分研磨,用两层纱布过滤,取滤液备用。
第二步:
先向6只小烧杯中分别注入10mL滤液,再加入20mL体积分数为95%的冷酒精溶液,然后用玻璃棒缓缓地沿一个方向搅拌,使絮状物缠绕在玻璃棒上。
第三步:
取6支试管,分别加入等量的0.015mol/LNaCl溶液溶解上述絮状物。
DNA检测:
在上述试管中各加入4mL二苯胺试剂,混合均匀后,置于沸水中加热10min,待试管冷却后比较溶液的颜色深浅,结果如下表。
材料保存温度
花菜
辣椒
蒜黄
20°C
++
+
+++
-20°C
+++
++
++++
(注:
“+”越多表示蓝色越深)
分析上述实验过程,回答下列问题。
(1)该探究性实验课题名称是________________________________________
_______________________________________________________________。
(2)第二步中“缓缓地”搅拌,这是为了减少__________________________。
(3)根据实验结果,得出结论并分析。
①结论1:
与20°C相比,相同实验材料在-20°C条件下保存,DNA的提取量较多。
结论2:
_________________________________________________________
_______________________________________________________________。
②针对结论1,请提出合理的解释:
___________________________________
_______________________________________________________________。
(4)氯仿密度大于水,能使蛋白质变性沉淀,与水和DNA均不相溶,且对DNA影响极小。
为了进一步提高DNA纯度,依据氯仿的特性,在DNA粗提取第三步的基础上继续操作的步骤是______________________________________
_______________________________________________________________,
然后用体积分数为95%的冷酒精溶液使DNA析出。
【解析】
(1)分析表格可知,实验目的在于探究不同材料和不同保存温度对DNA提取量的影响。
(2)DNA分子为链状,很容易断裂,所以应缓缓地沿一个方向搅拌。
(3)分析表格可看出,同种材料在-20℃时DNA提取量较多,不同材料在同种温度下保存时,蒜黄的DNA提取量最多。
低温下酶活性较低,DNA降解慢。
(4)根据题意,可用氯仿将DNA溶液中的蛋白质析出,进一步提高DNA的纯度。
【答案】
(1)探究不同材料和不同保存温度对DNA提取量的影响
(2)DNA断裂
(3)①等质量的不同实验材料,在相同的保存温度下,从蒜黄中提取的DNA量最多 ②低温抑制了相关酶的活性,DNA降解速度慢
(4)将第三步获得的溶液与等量的氯仿充分混合,静置一段时间,吸取上清液
1.在基因工程中用来修饰、改造生物基因的工具是( )
A.限制酶和水解酶
B.限制酶和DNA连接酶
C.限制酶和载体
D.DNA连接酶和载体
【解析】 在基因工程中常用限制酶对DNA分子进行切割,用DNA连接酶把不同的DNA片段连接起来,以达到改造DNA的目的。
【答案】 B
2.下列操作中不属于重组载体构建过程的是( )
A.用一定的限制酶切割质粒露出黏性末端
B.用同一种限制酶切割目的基因露出黏性末端
C.将切下的目的基因片段插入质粒切口处
D.将重