进出口动物源性食品中磺胺增效剂残留量的检测方法液相色谱质谱.docx
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进出口动物源性食品中磺胺增效剂残留量的检测方法液相色谱质谱
《出口食品中1，3-二油酸2-棕榈酸甘油三酯的测定高效液相色谱-蒸发光散射测定法》
编制说明
一、标准制定的任务来源及意义
1、任务来源
本标准是根据国家认证认可监督管理委员会下达的任务，名称为《出口蜂蜜中大米糖浆特征物的检测方法-高效液相色谱-质谱/质谱法》，计划编号为2010B146，由中华人民共和国江苏出入境检验检疫局和南京同凯兆业生物技术有限责任公司负责制定，本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。
2、制定标准的意义
过去，婴幼儿食品在我国的消费量较低，对其营养成分含量和生理作用研究得相对较少，随着经济的发展，生活水平的提高，我国人民对于婴幼儿食品的消费量已经越来越高。
婴幼儿身体小，生理机能尚未成熟，但为了达到正常的生长发育，每公斤体重的热量需求却是成人的二倍以上，若主要以糖类及蛋白质供应所需能量的话，每克只能供给16KJ的热量，所以食用量必须相当大，对消化功能还不是很完善的婴儿来说是一项不小的负担；而油脂可以供应蛋白质或糖类二倍以上的热量即每克38KJ的热量，因此脂肪在婴幼儿食品中必不可缺的物质。
目前许多国内外研究者都开展了对婴幼儿食品中脂肪的研究工作。
1,3-二油酸-2-棕榈酸甘油三酯（OPO）是一种母乳化结构脂肪，即将大量用于婴幼儿配方食品中。
按照中华人民共和国卫生部公告（2010年第1号）规定要求，1，3-二油酸2-棕榈酸甘油三酯适用范围为婴幼儿配方食品，较大婴儿和幼儿配方食品，学龄前儿童配方食品，其强化量为24～96g/kg，其量以1,3-二油酸-2-棕榈酸甘油三酯纯品计。
棕榈酸是婴儿生长最重要的脂肪酸，为机体的生长发育、大脑活动、新陈代谢提供能量，棕榈酸结合在甘油三酯的Sn-2位时最容易被婴幼儿消化，能够促进机体对能量物质（脂肪）的吸收，而在Sn-1,3位则大部分不能被吸收，这是因为Sn-1,3位的棕榈酸在胰脂肪酶作用下形成游离的棕榈酸，而棕榈酸熔点（63℃）高于人体体温，在小肠的酸性环境下容易与矿物质发生皂化反应，形成不溶性的盐，最终被排出体外，但在Sn-2位上的棕榈酸则能以Sn-2棕榈酸甘油单酯的形式被人体吸收。
Sn-2位棕榈酸还能够促进钙、镁等骨骼矿物质的吸收，促进婴幼儿身体骨骼的生长，钙缺乏时容易引发佝偻病，人体维持神经肌肉的兴奋、神经冲动的传导、心脏的正常搏动也需要的钙的参与。
目前研究表明Sn-2位棕榈酸还对婴幼儿的生长发育有促进作用，尚未发现有关Sn-2位棕榈酸对婴儿成长发育的不利影响和副作用方面的研究。
而现阶段对1,3-二油酸-2-棕榈酸甘油三酯（OPO）的定量检测还没有任何标准可依，因此，对婴幼儿食品中OPO检测方法的建立是当前急需解决的一个难题。
二、编制依据
本标准的编制遵循GB/T1.1-2009《标准化工作导则第1部分：
标准的结构和编写规则》和GB/T20001.4-2001《标准编写规则第4部分：
化学分析方法》和SN/T0001-1995《出品商品中农药、兽药残留量及生物毒素检验方法标准编写的基本规定》的要求进行编写制订的。
三、标准制定过程
本标准起草单位在2010年4月收到认监委的任务下达文件后，立刻开始着手进行标准文本、编制说明和验证工作。
本标准起草人通过查询相关资料和文献，建立了婴幼儿奶粉中1,3-二油酸-2-棕榈酸甘油三酯的检测方法。
经实验研究验证后，方法的灵敏度、特异性和选择性均能满足相应的检测要求。
四、主要试验技术论证
目前国内一统公司生产的母乳化脂肪在销售，合生元、南山等企业已在婴幼儿配方奶粉中使用，但根据相关规定，若在产品中添加食品添加剂，必须有相应的检测方法对其添加量进行测定，目前婴幼儿食品没有直接有效的检测甘油三酯的方法，所以应针对1,3-二油酸-2-棕榈酸甘油三酯建立相应的检测方法。
图11,3-二油酸-2-棕榈酸甘油三酯（OPO）的化学结构
（一）课题研究思路
目前，甘油三酯的检测方法有化学法、柱层析法、薄层色谱法、高效液相色谱法、气象色谱法、质谱法等。
化学法和柱层析法反应时间长、易出现错误、操作繁琐，现在已很少使用这两种方法检测甘油三酯。
薄层色谱法操作简便，结果直观，快速，而且成本较低，缺点是定量准确度很低，且对样品的量要求较多，不适合低浓度物质的检测。
气相色谱法灵敏度高，峰型尖锐，定量准确，缺点是由于甘油三酯的沸点很高，因此需要先衍生或耐高温的色谱柱才能进行分析，但衍生法无法对不同结构的甘油三酯分析，耐高温色谱柱耗费很高。
质谱法检测限很低，但重复性较差，适用于物质的定性研究，不适合定量分析。
最终采用高效液相色谱法-蒸发光散射检测器对婴幼儿配方奶粉中1,3-二油酸-2-棕榈酸甘油三酯的含量进行检测。
本标准的重点在于1,3-二油酸-2-棕榈酸甘油三酯（OPO）与其同分异构体1,2-二油酸-3-棕榈酸甘油三酯（OOP）的分离。
（二）讨论与分析
1、色谱柱的选择
本实验考察了C18柱、氨基柱、C8柱和银离子色谱柱四种色谱柱对甘油三酯标品混合溶液的分离情况。
实验结果如表1-1所示，由于银离子色谱柱含有修饰过的阳离子交换配体键合球形硅胶吸附相，适用于甘油三酯异构体的分离和顺式-反式脂肪酸异构体的分离，因此最终选择Varian的ChromSpherLipidsSilverIon（250×4.6mm）作为最终的分析色谱柱。
表1不同色谱柱对甘油三酯的分离
色谱柱
分离程度
1
C8柱
同分异构体不能分离
2
C18柱
同分异构体不能分离
3
氨基柱
所有甘油三酯均不能分离
4
银离子色谱柱
较好分离
2、流动相选择与标品分离
利用分离度公式计算不同流动相下OPO与OOP的分离度，从图2可得：
当流动相为二氯甲烷和丙酮梯度洗脱时，OPO与OOP分离度较高，表2为梯度洗脱表。
表2梯度洗脱条件
时间（min）
流速（mL/min）
二氯甲烷
丙酮
0
0.8
98
2
10
0.8
75
25
25
0.8
75
25
28
0.8
2
98
32
0.8
2
98
36
0.8
98
2
图2流动相对OPO与OOP分离度的影响
由图3可知，在银离子色谱柱和二氯甲烷、丙酮为流动相条件下，OPO等六种甘油三酯之间可以很好的分离，质谱定性分析可知峰4为OPO，它的出峰时间为20.158min，与OOP（峰5）紧邻。
图36种标品的HPLC图谱（1.三棕榈酸甘油三酯；2.1，2-而棕榈酸-3-油酸甘油三酯；3.1，3-二棕榈酸-2-油酸甘油三酯；4.1，3-二油酸-2-棕榈酸甘油三酯；5.1，2-二油酸-3-棕榈酸甘油三酯；6.三油酸甘油三酯）
对图中的OPO与OOP计算得到，分离度R=3.18>1.5，实现基线分离。
表3OPO和OOP的分离度
R
21.083
20.158
0.2775
0.3038
3.18
3、ELSD检测器参数对信噪比的影响
图4漂移管温度与载气流速对信噪比的影响
漂移管温度和载气流速对信噪比的影响见图4，在漂移管温度50℃，载气流速1.5L/min下，50mg/LOPO标准溶液的信噪比响应最大，因此，确定该参数为最佳检测条件。
4、色谱柱再生
图5、色谱柱再生前OPO与OOP的分离谱图
图6、色谱柱再生后OPO与OOP的分离谱图
采用本方法连续多次分析样品后，色谱柱的分离能力会降低，这是因为在管柱内存在的低浓度的样品和溶剂能与固定相结合。
因此，需要对该色谱柱进行再生，经过对不同溶剂的尝试后，选出了较适用于本实验的方法，即先用乙腈冲洗柱子，再加溶有硝酸银的乙腈溶液（0.1g/mL）至硝酸银过量（氯化钠检测），再用乙腈冲洗，最后用流动相冲洗。
本法的好处在于不存在水相，因为脂肪不溶于水，如果存在水会对分析有较大影响。
5、幼儿奶粉中1,2-二油酸-3-棕榈酸甘油三酯的检测
分别研究了法国合生元、美国美赞臣、伊利、多美滋、雅培、飞鹤、施恩、澳优、惠氏等9种婴幼儿配方奶粉在目标峰处是否存在干扰峰并对1,2-二油酸-3-棕榈酸甘油三酯（OPO）进行定量检测（表4）。
表4不同奶粉样品中OPO的含量（%）
样品名称
OPO
合生元
3.18
美赞臣
-
伊利
-
多美滋
-
雅培
0.2
飞鹤
-
施恩
0.07
澳优
0.32
惠氏
-
图7、奶粉中添加OPO色谱图（添加水平20mg/g）
五、方法的主要技术指标
1、线性范围
取不同浓度的标准溶液，按本标准确定条件分别进样，浓度在0.1mg/mL～10mg/mL之间，以峰面积对浓度对数作线性回归，其浓度与响应值有良好的线性关系，相关性R2为0.991以上。
2、方法回收率和精密度数据
在婴幼儿奶粉中分别添加不同浓度水平（10mg/g，20mg/g和50mg/g），上述添加水平6次平行，测定回收率和室内精密度。
实验内数据表明，方法的总体平均回收率81%～94%，方法的相对标准偏差为2.2%～7.2%，实验内数据参见表4。
表5实验室添加回收数据
添加水平
10mg/g
20mg/g
50mg/g
测
定
数
值
（mg/g）
1
8.2
16.2
43.5
2
8.1
15.9
44.3
3
7.7
16.4
45.0
4
8.7
15.9
42.0
5
8.2
16.7
40.4
6
8.8
16.9
41.9
7
8.7
17.2
42.4
8
8.9
16.4
44.4
9
8.9
16.7
44.4
10
8.4
17.7
44.8
平均值（mg/g）
8.5
16.6
43.3
回收率％
85
83
87
SD
0.414
0.574
1.534
RSD％
4.9
3.5%
3.5%
七、结论
综合上述情况，本方法可满足婴幼儿奶粉中1,3-二油酸-2-棕榈酸甘油三酯的检测，方法的检测低限、回收率及精密度等各项技术指标均符合GB/T1.1-2000《标准化工作导则第1部分：
标准的结构和编写规则》、GB/T20001.4-2001《标准编写规则第4部分：
化学分析方法》、SN/T0001-1995《出口商品中农药兽药残留量及生物毒素检验方法标准编写的基本规定》的要求。
八、参考文献
1、GB/T1.1-2009《标准化工作导则第1部分：
标准的结构和编写规则》
2、GB/T20001.4-2001《标准编写规则第4部分：
化学分析方法》
3、SN/T0001-1995出口商品中农药、兽药残留量及生物毒素检验方法标准编写的基本规定
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