微生物实验工作总结.docx

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微生物实验工作总结

微生物实验工作总结

（一）培养基的营养成分

一般都含有水、碳源、氮源和无机盐，有些微生物需要添加特殊营养物质（如培养乳酸杆菌时需添加生长因子：

维生素）

高考警示钟：

自养微生物与异养微生物所需的营养物质不同

（1）自养微生物所需的碳源含碳的无机物（如CO2），而异养微生物需要的碳源含碳的有机物，因此可根据培养基中营养物质判断微生物的代谢类型。

（2）含氮无机物不但能给自养微生物提供氮源，也能作为能源物质，提供能量，如NH3既作为硝化细菌的氮源也作为能源。

（二）培养基的配制原则

（1）目的明确。

要根据微生物的种类、培养目的等选择原料、配制培养基。

（2）营养要协调。

各种营养物质要保证适当的浓度和比例。

营养物质比例过低，不能满足微生物生长；浓度过高则会抑制微生物的正常生长。

（3）pH要适当。

不同微生物生长所需pH不同。

如细菌为中性或微碱性（6.5～7.5）；霉菌等真菌为酸性（5.0～6.0）。

（三）培养基的分类及作用：

1.物理性质：

根据是否添加琼脂等凝固剂

（1）液体培养基：

不加凝固剂，常用于工业生产

（2）固体培养基：

加凝固剂，常用于微生物分离、鉴定、活菌计数

2.用途或功能

（1）选择培养基：

培养基中加入或去除某种化学物质，允许特定种类的微生物生长,同时抑制或阻止其他种类微生物生长。

常见例子：

①培养基中加入青霉素，筛选酵母茵或霉菌等真菌；

②培养基中加入高浓度食盐，筛选金黄色葡萄球菌；

③无氮培养基，筛选固氮微生物；

④无碳培养基，筛选自养微生物；

⑤以石油为唯一碳源，选择能分解石油的微生物；

⑥以尿素为唯一氮源，筛选尿素分解菌；

⑦以纤维素为唯一碳源，通过是否产生透明圈筛选纤维素分解菌。

⑧将培养基放在高温环境中培养，分离耐高温的微生物。

（2）鉴别培养基：

根据微生物的代谢特点，在培养基中加入某种指示剂或化学药品,以鉴别不种类的微生物。

①伊红一美蓝培养基鉴别饮用水或乳制品中是否有大肠杆菌（若有，茵落呈深紫色，并带有金属光泽）；

②培养基中加入酚红指示剂，鉴定尿素分解菌；

③培养基中加入刚果红（CR），鉴定纤维素分解菌。

注意：

①病毒为非细胞结构的生物体，专营活细胞寄生，目前不能利用人工培养基来培养，需接种在动植物组织中才能增殖。

常用于培养病毒的是活鸡胚。

②加入培养基中的凝固剂（如琼脂），一般不能被微生物利用，只起到凝固作用。

（一）关键

获得纯净培养物的关键是防止外来杂菌入侵。

（二）消毒、灭菌:

二者主要区别中：

芽孢和孢子是否存活（芽孢是微生物度过不良环境的体眠体，而孢子是微生物进行无性生殖时的繁殖体即无性生殖细胞。

）

1.消毒:

使用较为温和的物理或化学方法，仅杀死物体表面或内部一部分对人体等有害的微生物（不包括孢子和芽孢）

常用方法

应用范围

巴氏消毒法：

70～75℃水中煮30min或在80℃水中煮15min

一些不耐高温的物体如牛奶

煮沸消毒法：

在100℃水浴中煮沸5～6min

一般物品

化学药剂消毒法：

用乙醇、氯气、KMnO4等药剂来杀死或抑制细菌生长或繁殖

可用来对环境、双手和衣物等消毒

紫外线消毒法：

30W紫外灯照射30min

接种室、接种箱、超净工作台

2.灭菌:

使用强烈的理化因素杀死物体内外所有的微生物，包括芽孢和孢子

常用方法

应用范围

灼烧灭菌法：

酒精灯火焰

接种工具如接种环、接种针等

干热灭菌法：

在160～170℃加热1～2h

如玻璃器皿（吸管、培养皿）和金属用具

高压蒸汽灭菌：

压力为100kPa，温度为12l℃的条件下，维持15～30min

培养基及容器的灭菌

注意：

（1）酒精消毒用体积分数为70%的酒精效果最好，浓度过低。

杀菌力弱，浓度过高，会使菌体表面蛋白凝固成一层保护膜，乙醇分子不能进入其中

（2）关于高压蒸汽灭菌注意以下几点：

①压力为100kPa，温度为12l℃的条件下，维持15～30min；

②注意同时旋紧相对的两个螺旋，使螺栓松紧一致；

③到灭菌时间后，当压力表的压力降为零时，才能打开排气阀，否则灭菌锅的液体会冲出容器，造成污染。

（3）灭菌消毒的原理，就是通过一定理化手段，使病原茵蛋白质变性，失去生命活性。

（4）灼烧灭菌用的是酒精灯火焰的充分燃烧层。

（一）常用细菌培养基——牛肉膏蛋白胨培养基配制流程：

计算

称量

溶化

灭菌

注意：

据配方计算配制一定体积培养基时各成分的用量

注意：

①倒平板时，烧杯口要通过酒精灯火焰灭菌。

②平板冷凝后要将平板倒置，既可防止皿盖上凝结的水滴滴入培养基造成污染；又可使培养基表面的水分更好的挥发。

（调PH）

倒平板

注意：

①牛肉膏较粘稠，应玻棒挑取，在称量纸上称量

②牛肉膏蛋白胨易吸潮，动作要迅速

注意：

①溶化琼脂时要不断搅拌，防止琼脂糊底而导致烧杯破裂；

②加热过程中部分水分蒸发，待琼脂完全溶化后应补加蒸馏水，以保持溶液的浓度

注意：

由于不同微生物适宜的pH不同，因此在熔化后，必须用NaOH或HCl来调节pH

注意：

①用高压蒸汽灭菌法

②培养基先调PH再灭菌

③一般是培养基先灭菌再倒平板

计算

称量

溶化

灭菌

注意：

据配方计算配制一定体积培养基时各成分的用量

注意：

①倒平板时，烧杯口要通过酒精灯火焰灭菌。

②平板冷凝后要将平板倒置，既可防止皿盖上凝结的水滴滴入培养基造成污染；又可使培养基表面的水分更好的挥发。

（调PH）

倒平板

注意：

①牛肉膏较粘稠，应玻棒挑取，在称量纸上称量

②牛肉膏蛋白胨易吸潮，动作要迅速

注意：

①溶化琼脂时要不断搅拌，防止琼脂糊底而导致烧杯破裂；

②加热过程中部分水分蒸发，待琼脂完全溶化后应补加蒸馏水，以保持溶液的浓度

注意：

由于不同微生物适宜的pH不同，因此在熔化后，必须用NaOH或HCl来调节pH

注意：

①用高压蒸汽灭菌法

②培养基先调PH再灭菌

③一般是培养基先灭菌再倒平板

（二）纯化大肠杆菌

1．原理：

在培养基上将细菌稀释或分散成单个细胞，使其长成单个的菌落，这个菌落就是纯化的细菌菌落。

2．微生物接种方法：

平板划线法（只可纯化）和稀释涂布平板法（既可纯化又可计数）

（1）平板划线法：

固体培养上→连续划线→逐步稀释→单个细胞繁殖而成的菌落（如图）

注意：

a.用接种环取菌种之前、每次划线之前和划线结束都要进行灼烧灭菌，灼烧后要在酒精灯附近冷却后再操作；

烧灼时期

目的

取菌种前

杀死接种环上原有微生物

每次划线前

杀死上次划线后接种环上残留菌种，使下次划线的菌种直接于上次划线末端，使每次划线菌种数目减少，达到分离菌株的目的

接种结束后

杀死接种环上残存的菌种，避免细菌污染环境和感染操作者

b.划线时不要划破培养基，如果采用分段划线法操作从第二次操作应总在上一次划线末端开始，首尾区不能相连；

c.操作必须始终在酒精灯火焰旁进行。

（2）稀释涂布平板法：

10倍系列稀释操作（一系列梯度稀释）→稀释度足够高的菌液→分散成单个细胞→单个菌落

稀释涂布平板的操作比较复杂，且各个细节均需保证“无菌”，应特别注意：

a.配制系列梯度稀释液时，必须用无菌水配制；

b.涂布器用70%的酒精消毒，多余酒精在烧杯中滴尽，沾有少量酒精的涂布器在酒精灯火焰引燃。

不要将过热的涂布器放入盛有酒精的烧杯中，一面引燃其中的酒精；

c.吸管头不要接触任何其他物体；吸管要在酒精灯火焰周围使用。

3．菌种的保存

保存时间

保存方法

具体方法

后续处理

频繁

使用

临时保藏法

将菌种接种到试管的固体斜面培养基上，培养，长成菌落后，放入4_℃的冰箱中保藏

每3～6个月需重新接种。

否则菌种容易被污染或产生变异

长期

保存

甘油

管藏法

在3mL甘油瓶中，装入1mL甘油后灭菌，将1mL菌液转移到甘油瓶中与甘油充分混合

放入－20_℃的冷冻箱中保存

将菌种放在低温环境中保藏的目的是降低微生物的新陈代谢速率。

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