基因敲除技术研究进展.docx

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基因敲除技术研究进展

兰州交通大学化学与生物工程学院

综合能力训练Ⅰ——文献综述

题目：

基因敲除技术研究进展

作者：

王振宇

学号：

201207744

指导教师：

谢放

完成日期：

2014-7-16

基因敲除技术研究进展

摘要基因敲除是自20世纪80年代末以来发展起来的一种新型分子生物学技术，是通过一定的途径使机体特定的基因失活或缺失的技术。

在总结已有研究成果的基础上，本文对基因敲除技术的概况、原理方法应用以及近年来基因敲除技术的研究进展作一个简单的综述。

关键词基因敲除RNAi生物模型基因置换基因打靶同源重组

1.基因敲除技术简介 

基因敲除（Geneknockout）是指一种遗传工程技术，针对某个序列已知但功能未知的序列，改变生物的遗传基因，令特定的基因功能丧失作用，从而使部分功能被屏障，并可进一步对生物体造成影响，进而推测出该基因的生物学功能。

它克服了随机整合的盲目性和偶然性，是一种理想的修饰、改造生物遗传物质的方法。

基因敲除借助分子生物学、细胞生物学和动物胚胎学的方法,通过胚胎干细胞这一特殊的中间环节将小鼠的正常功能基因的编码区破坏,使特定基因失活,以研究该基因的功能；或者通过外源基因来替换宿主基因组中相应部分,以便测定它们是否具有相同的功能，或将正常基因引入宿主基因组中置换突变基因以达到靶向基因治疗的目的。

基因敲除是揭示基因功能最直接的手段之一。

通常意义上的基因敲除主要是应用DNA同源重组原理，用设计的同源片段替代靶基因片段（即基因打靶）,从而达到基因敲除的目的。

随着基因敲除技术的发展,除了基因打靶技术外,近年来新的原理和技术也逐渐被应用,比较成功的有RNA干扰技术,同样也可以达到基因敲除的目的。

简单的说基因敲除是指将目标基因从基因组中删除。

基因敲除技术主要应用于动物模型的建立，而最成熟的实验动物是小鼠，对于大型哺乳动物的基因敲除模型还处于探索阶段。

这项技术的诞生可以说是分子生物学技术上继转基因技术后的又一革命。

尤其是条件性、诱导性基因打靶系统的建立，使得对基因靶位时间和空间上的操作更加明确、效果更加精确、

修饰的时空范围上设置一个可调控的“按钮”，从而使对小鼠基因组的修饰的范围和时间处于一种可控状态。

利用Cre／LoxP 和来自酵母的FLP—frt 系统可以研究特定组织器官或特定细胞中靶基因灭活所导致的表型。

通过常规基因打靶在基因组的靶位点上装上两个同向排列的1oxP，并以此两侧装接上loxP 的ES 细胞产生“loxPfloxed”小鼠,然后，通过将“loxP floxed”小鼠与Cre转基因鼠杂交（也可以其他方式向小鼠中引入Cre重组酶），产生靶基因发生特定方式（如特定的组织特异性）修饰的条件性突变小鼠。

在“loxP floxed”小鼠，虽然靶基因的两侧已各装上了一个loxP，但靶基因并没有发生其他的变化，故“1oxP noxed”小鼠表型仍同野生型的一样。

但当它与Cre转基因小鼠杂交时，产生的子代中将同时带有“loxP floxed”靶基因和Cre基因。

Cre基因表达产生的Cre 重组酶就会介导靶基因两侧的1oxP间发生切除反应，结果将一个loxP 和靶基因切除。

这样，靶基因的修饰（切除）是以Cre的表达为前提的。

Cre的表达特性决定了靶基因的修饰（切除）持性：

即Cre在哪一种组织细胞中表达，靶基因的修饰（切除）就发生在哪种组织细胞；而Cre的表达水平将影响靶基因在此种组织细胞中进行修饰的效率。

所以只要控制Cre的表达特异性和表达水平就可实现对小鼠中靶基因修饰的特异性和程度。

2.1.2诱导性基因敲除法 

诱导性基因敲除也是以Cre/loxp 系统为基础，但却是利用控制Cre表达的启动子的活性或所表达的Cre 酶活性具有可诱导的特点，通过对诱导剂给予时间的控制或利用Cre 基因定位表达系统中载体的宿主细胞特异性和将该表达系统转移到动物体内的过程在时间上的可控性，从而在1oxP 动物的一定发育阶段和一定组织细胞中实现对特定基因进行遗传修饰之目的的基因敲除技术。

人们可以通过对诱导剂给予时间的预先设计的方式来对动物基因突变的时空特异性进行人为控制、以避免出现死胎或动物出生后不久即死亡的现象。

常见的几种诱导性类型如下：

四环素诱导型；干扰素诱导型；激素诱导型；腺病毒介导型。

诱导性基因敲除优点：

①.诱导基因突变的时间可人为控制；

②.可避免因基因突变而致死胎的问题 

③.在2 个loxP 位点之间的重组率较高； 

④.如用病毒或配体DNA 复合物等基因转移系统来介导Cre的表达，则可省去建立携带Cre的转基因动物的过程。

2.2利用随机插入突变进行基因敲除

2.2.1基因捕获法 

基因捕获法是最近发展起来的利用随机插入突变进行基因敲除的新型方法。

通常基因捕获载体还包括一个无启动子的报道基因，通常是neo基因，neo基因插入到ES细胞染色体组中，并利用捕获基因的转录调控元件实现表达的ES克隆可以很容易地在含G418的选择培养基中筛选出来，从理论上讲，在选择培养基中存活的克隆应该100％地含有中靶基因[9]。

中靶基因的信息可以通过筛选标记基因侧翼cDNA或染色体组序列分析来获得

2.2.2原理：

此法利用某些能随机插入基因序列的病毒，细菌或其他基因载体，在目标细胞基因组中进行随机插入突变，建立一个携带随机插入突变的细胞库，然后通过相应的标记进行筛选获得相应的基因敲除细胞。

根据细胞的不同，插入载体的选择也有所不同。

逆转率病毒可用于动植物细胞的插入；对于植物细胞而言农杆菌介导的T-DNA转化和转座子比较常用；噬菌体可用于细菌基因敲除。

2.2.3基因捕获法的优缺点 

用常规方法进行基因敲除研究需耗费大量的时间和人力，研究者必须针对靶位点在染色体组文库中筛选相关的染色体组克隆，绘制相应的物理图谱，构建特异性的基因敲除载体以及筛选中靶ES细胞等，通常一个基因剔除纯合子小鼠的获得需要一年或更长的时间。

面对人类基因组计划产生出来的巨大的功能未知的遗传信息，传统的基因敲除方法显得有些力不从心[10]。

因此，基因捕获法应运而生，利用基因捕获可以建立一个携带随机插入突变的ES细胞库，节省大量筛选染色体组文库以及构建特异打靶载体的工作及费用，更有效和更迅速地进行小鼠染色体组的功能分析。

此方法的缺点是只能剔除在Es细胞中表达的基因。

单种的细胞类型中表达的基因数目约为I04，现在的基因捕获载体从理论上来讲应能剔除所有在ES细胞表达的基因，因此，在ES细胞中进行基因捕获还是大有可为的。

用基因捕获法进行基因剔除的另一个缺点是无法对基因进行精细的遗传修饰。

2.3RNAi引起的基因敲除。

2.3.1基因敲除技术与RNA干扰技术（RNAi） 

RNAi是近两年才发展起来的一种在RNA水平上研究及印尼功能的技术。

将化学合成的双链RNA分子（dsRAN）或将能表达dsRNA的载体转导入体外或动物体的细胞内,dsRNA会介导受体细胞中序列特异的同源靶mRNA发生降解或受阻，引发受体细胞产生转录后水平的基因沉默，使之与相应的内源靶基因表达被阻抑，从而获得类似于基因敲除的基因阻抑效果[12]。

RNA干扰为基因和蛋白质学的研究等提供了崭新的技术方法，大有取代基因敲除技术的趋势，但是RNA干扰技术存在许多问题，使它不能完全替代基因敲除技术：

一、RNAi不适用于所有的细胞，而基因敲除技术则可以作用于个体胚胎发育各个介段，能精确地敲除任何组织或器官的目的基因；二、RNAi在低等生物中能高效诱发基因沉默，但是在哺乳动物中，RNAi的抑制效果远远不如在低等生物体中那么明显，而基因敲除对哺乳动物的效果也是明显的；三、基因敲除得到的动物模型具有遗传性，能够进行繁殖而获得大量的基因敲除动物群体，有利于实验的延续，而RNAi的基因沉默是没有遗传性的。

由于少量的双链RNA就能阻断基因的表达，并且这种效应可以传递到子代细胞中,所以RNAi的反应过程也可以用于基因敲除。

近年来，越来越多的基因敲除采用了RNAi这种更为简单方便的方法[13]。

2.3.2RNAi阻断基因表达的机理 

双链RNA进入细胞后，能够在Dicer酶的作用下被裂解成siRNA，而另一方面双链RNA还能在RdRP（以RNA为模板指导RNA合成的聚合酶RNA-directed RNA polym的双链解开变成单链，并和某些蛋白形成复合物，Argonaute2是目前唯一已知的参与复合物形成的蛋白。

此复合物同与siRNA互补的mRNA结合，一方面使mRNA被RNA酶裂解，另一方面以SiRNA作为引物，以mRNA为模板，在RdRP作用下合成出mRNA的互补链。

结果mRNA也变成了双链RNA，它在Dicer酶的作用下也被裂解成siRNA。

这些新生成的siRNA也具有诱发RNAi的作用，通过这个erase，RdRP）的作用下自身扩增后，再被Dicer酶裂解成siRNA。

SiRNA聚合酶链式反应，细胞内的siRNA大大增加，显著增加了对基因表达的抑制。

从21到23个核苷酸的siRNA到几百个核苷酸的双链RNA都能诱发RNAi，但长的双链RNA阻断基因表达的效果明显强于短的双链RNA[14]。

2.3.3RNAi基因敲除

①.比用同源重组法更加简便，周期大大缩短。

②.对于哺乳动物，如对于一些敲除后小鼠在胚胎时就会死亡的基因，可以在体外培养的细胞中利用RNAi技术研究它的功能。

③.由于RNAi能高效特异的阻断基因的表达，它成为研究信号传导通路的良好工具。

④.RNAi还被用来研究在发育过程中起作用的基因，如可用RNAi来阻断某些基因的表达，来研究他们是否在胚胎干细胞的增殖和分化过程中其起着关键作用。

2.4实现基因敲除的其他原理。

除上述几种已经比较成熟并且普遍使用了的基因敲除原理外，还有一些基于其他原理的敲除技术正处于研究和完善过程中，如TFOs（Triple helix forming oligonucleotides）引导的基因敲除术以及反义技术在基因敲除技术中的运用等[15]。

随着遗传学，分子生物学理论的发展，新的基因敲除原理也在不断的发现和发掘中。

3.基因敲除技术的前景

基因敲除技术现在以广泛的应用于各个领域并取得了快速的发展，应用此技术可以建立生物模型、培育新的生物品种、还可以用于疾病的分子机理研究和疾病的基因治疗等。

基因工程技术是本世纪分子生物学史上的一个重大突破，而基因敲除技术则可能是遗传工程中的另一重大飞跃。

它为定向改造生物，培育新型生物提供了重要的技术支持。

3.1建立生物模型。

在基因功能，代谢途径等研究中模型生物的建立非常重要。

基因敲除技术就常常用于建立某种特定基因缺失的生物模型，从而进行相关的研究。

这些模型可以是细胞，也可以是完整的动植物或微生物个体。

最常见的是小鼠，家兔、猪、线虫、酵母和拟南芥等的基因敲除模型也常见于报道[16]。

3.2在培育新物种的研究。

作为一项新兴的微生物育种技术，基因敲除克服了传统诱变方法的盲目性和偶然性，敲除后改变的基因会随染色体DNA进行复制，改良的菌种可以稳定地用于后续的研究和生产。

这样的方法具有很强的目的性，大大节省了为生物技术研究的时间。

3.3疾病的分子机理研究和疾病的基因治疗[3-5]。

通过基因敲除技术可以确定特定基因的性质以及研究它对机体的影响。

这无论是对了解疾病的根源或者是寻找基因治疗的靶目标都有重大的意义。

3.4提供廉价的异种移植器官。

众所周知，器官来源稀少往往是人体器官移植的一大制约因素，而大量廉价的异种生物如猪等的器官却不能用于人体。

这是因为异源生物的基因会产生一些能引起人体强烈免疫排斥的异源分子，如果能将产生这些异源分子的基因敲除，那么动物的器官将能