工具酶 2.docx
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工具酶2
分子克隆中常用的工具酶
在过去20年，生物科学中发生的革命性的变化，都直接来源于对DNA可进行定点操作。
遗传工程的主要工具，就是那些可在DNA分子上催化特异性反应的酶。
切割位点可为获得DNA的物理图的特殊的标记
利用限制性内切酶切割产生特殊DNA片段的能力使得纯化那些DNA片段成为可能
获得的限制性DNA片段可作为DNA操作中的基本介质
任何物种都有排除异物保护自身的防御机制
免疫系统、细菌的限制与修饰系统
第一节限制性内切酶
一、限制与修饰
1.限制与修饰Restrictionandmodification
50年代初，寄主控制的专一性（hostcontrolledspecificity）
噬菌体具有代表性和普遍性，其在不同宿主中的转染频率，在感染某一宿主后，再去感染其它宿主时受到限制的现象。
EcoliK
EcoliB
EcoliC
K
1
10-4
1
B
10-4
1
1
C
10-4
10-4
1
说明K和B菌株中存在一种限制系统，可排除外来的DNA
10-4的存活率是由宿主修饰系统作用的结果
2.限制酶的发现
60年代，限制内切酶和限制酶的概念
1968年首次从E.coliK中分离限制性内切酶
＊需要ATP，S-腺苷甲硫氨酸（SAM）等
＊有特定的识别位点
＊但没有特定的切割位点
＊切割位点远离识别位点1000bp以上
1970年美国约翰·霍布金斯大学H.Smith偶然发现流感嗜血杆菌（Haemophilusinfluenzae）能迅速降解外源的噬菌体DNA，其细胞提取液可降解E.coliDNA，但不能降解自身DNA，即HindII酶
5’...GTPy↓PuAC...3’
3’…CAPu↑PyTG...5’可以识别四个位点，在识别位点的中间切割DNA的两条链。
EcoRI
5’...G↓AATTC...3’
3’…CTTAA↑G...5’
二、限制性核酸内切酶定义
是一类能够识别双链DNA分子中的某种特定核苷酸序列（4—8bp），并由此处切割DNA双链的核酸内切酶。
1.来源：
原核生物。
2.性质：
内切酶。
3.功能：
即在核酸分子链的内部制造切口的酶。
自我保护作用。
用来保护宿主不受外来DNA的感染，可降解外来的DNA，从而阻止其复制和整合到细胞中。
＊限制性内切酶将侵入细菌体内的外源DNA切成小片断。
（1）限制（Restriction）
＊细菌自身的DNA碱基被甲基化酶甲基化修饰所保护，不能被自身的限制性内切酶识别切割。
（2）修饰（Modification）
在生物体内，存在与限制性酶对应的修饰酶或者甲基化酶，二者是同时存在的。
甲基化酶：
保护自身的DNA不被降解。
他们与对应的限制酶识别相同的序列，但其作用不是切割DNA，而是在两条链上对某个碱基进行碱基化。
①Dam甲基化酶
GATC腺嘌呤N6位置引入甲基
②Dcm甲基化酶
CCAGG或CCTGG序列在第二个C上C5位置上引入甲基
二、限制性内切酶的类型
目前鉴定出三种不同类型的限制性内切酶。
•I型限制性内切酶
•II类限制性内切酶
•III类限制性内切酶
1.I型限制性内切酶
首先由M.Meselson和R.Yuan在1968年从大肠杆菌B株和K株分离的。
如EcoB和EcoK。
（1）识别位点序列
未甲基化修饰的特异序列。
EcoB：
TGA（N）8TGCT
EcoK：
AAC（N）6GTGC
（2）切割位点
在距离特异性识别位点约1000—1500bp处随机切开一条单链。
EcoRI5’-G↓AATTC-3’
3’-CTTAA↑G-5’产生粘性末端
PstI5’-CTGCA↓G-3’
3’-G↑ACGTC-5’
EcoRV5’-GAT↓ATC-3’
3’-CTA↑TAG-5’产生平齐末端
（3）作用机理
需ATP、Mg2+和SAM（S-腺苷蛋氨酸）。
2.II类限制性内切酶
首先由H.O.Smith和K.W.Wilcox在1970年从流感嗜血菌中分离出来。
分离的第一个酶是HindⅡ
（1）识别位点序列
未甲基化修饰的双链DNA上的特殊靶序列（多数是回文序列）。
与DNA的来源无关。
typeII93%
识别回文对称序列，在回文序列内部或附近切割3’-OH,5’-P，
需Mg2+，相应的修饰酶需onlySAM
识别序列主要为4-6bp，或更长且呈二重对称的特殊序列
但有少数酶识别更长的序列或简并序列切割位置因酶而异，有些是隔开的
（2）切割位点
识别位点处。
切开双链DNA。
形成粘性末端（stickyend）或平齐末端（bluntend）。
（3）粘性末端（stickyends，cohensiveends）
含有几个核苷酸单链的末端。
分两种类型：
①5’端凸出（如EcoRI切点）
5’-GAATTC-3’
3’-CTTAAG-5’
②3’端凸出（如PstI切点）
5’-CTGCAG-3’
3’-GACGTC-5’
（4）粘性末端的意义
①连接便利
i）不同的DNA双链：
只要粘性末端碱基互补就可以连接。
这比连接两个平齐末端容易的多。
ii）同一个DNA分子内连接：
通过两个相同的粘性末端可以连接成环形分子。
②5’末端标记
凸出的5’末端可用DNA多核苷酸激酶进行32P标记。
凸出的3’端可以通过末端转移酶添加几个多聚核苷酸的尾巴（如AAA或TTT等）造成人工粘性末端。
③补平成平齐末端
粘性末端可以用DNA聚合酶补平成平齐末端。
3.Ⅲ型限制性内切酶
•typeIII（<1%）
•EcoP1EcoP15
•识别AGACCCAGCAG
•切割下游24-26bp处
在完全肯定的位点切割DNA，但反应需要ATP、Mg2+和SAM（S-腺苷蛋氨酸）。
Ⅱ
Ⅰ
Ⅲ
酶分子
内切酶与甲基化酶分子不在一起
三亚基双功能酶
二亚基双功能酶
识别位点
4-6BP，大多数为回文对称结构
二分非对称
5-7bp非对称
切割位点
在识别位点中或靠近识别位点
无特异性，至少在识别位点外1000bp
在识别位点下游24-26bp
限制反应与甲基化反应
分开的反应
互斥
同时竞争
限制反应是否需要ATP
No
YES
YES
三、限制性内切酶识别的序列
1.长度：
一般为4-8个碱基，最常见的为6个碱基。
•4个碱基:
sau3AⅠ↓GATC
•5个碱基:
EcoRⅡ↓CCWGGW=AorT
NciICC↓SGGS=CorG
•6个碱基:
EcoRⅠG↓AATTC
HindIIIA↓AGCTT
•7个碱基:
BbvCⅠCC↓TCAGC
PpuMIRG↓GWCCY
•8个碱基:
NotⅠGC↓GGCCGC
2.限制酶识别序列的结构
①大多数为回文对称结构，切割位点在DNA两条链相对称的位置。
EcoRⅠ
EcoRIGAATTC
CTTAAG
HindIIIAAGCTT
TTCGAA
②有些识别非对称序列，AccBSⅠ[CCGCTC（-3/-3）]
•5’-CCG↓CTC-3’
3’-GGC↑GAG-5
③有些可以识别多种序列，ACCⅠ识别序列是GT↓MKAC,可以识别4中序列；
④有些识别的序列呈间断对称，对称序列之间含有若干任意碱基
DdeⅠ5’-C↓TNAG-3’
3’-GANT↑C-5
3.限制酶切割的位置
切割位点多数在内部，但也有在外部的。
在外部的，又有两端、两侧和单侧之别。
切割位置
内部：
大多数AccBSICCG↓C↓TC（-3/-3）
GG↑C↑GAG（-2/-4）
两端EcoRII↓CCWGG
Sau3AI↓GATC
NlaIIICATG↓
两侧BcgI（10/12）CGA（N）6TGC（12/10）
↓10（N）CGA（N）6TGC（N）12↓
↑12（N）GCT（N）6ACG（N）10↑
单侧BbvIGCAGC（8/12）
BspMIACCTGC（N4）
TGGACG（N8）
四、末端长度对切割的影响
限制酶切割DNA时对识别序列两端的非识别序列有长度的要求，也就是说在识别序列两端必须有一定数量的核苷酸，否则限制酶将难以发挥切割活性。
2hr20hr
AccICCGGTCGACCGG00
HindIIICAAGCTTG00
CCAAGCTTGG00
CCCAAGCTTGGG10%75%
EcoRIGGAATTCC>90>90
相对来说，EcoRI对两端的序列长度要求较小
PstI
GCTGCAGC00
TGCACTGCAGTGCA1010
AACTGCAG（N）14>90>90
CTGCAG（N）2000
2.DNA片段（线性载体）
10/ugDNA60min
CGTACGCTCGAGGAATTCCTGCAGGATATC
EcoRIinitialcutL1TMUS29
cleavageefficiencyXhoI97%1base
PstI37%1base
...CTCGAGGAATTCCTGCAG...
...GAGCTCCTTAAGGACGTC...
XhoIEcoRIPstI
XhoI:
1EcoRI100%
PstI:
1EcoRI88%
在双酶切多克隆位点时，选酶切秩序
在设计引物引入酶切位点时,应在位点之外引入所要求的碱基数。
五、位点偏爱（sitepreferences）
某些限制酶对同一介质中的有些位点表现出偏爱性切割，即对不同位置的同一个识别序列表现出不同的切割效率。
1.现象
1975EcoRI切割phage（Lambda）中的5个位点，并不是随机的，靠近右端的位点，比分子中间的位点切割快10倍。
1976EcoRI在腺病毒2（adenovirus-2）DNA中的切割速率不同。
1981EcoRI和HindIII在中的切割速率分别有10倍和14倍的差异
有4个SacII位点：
三个在中央，一个在右臂（Right-terminus）
中央三个快50倍
1977，X174ssDNA5386bpcircleHgaI切割某些位点比其它的快
1983腺病毒2中，CTCGAG位点对PaeR7I完全抵抗但同裂酶XhoI,却很易切割，原因是5’末端有一个CT二核苷酸，与甲基化完全无关
2.原因
（1）在切割DNA之前需要同时与两个识别位点相作用
（2）BspMI、EcoRII、HpaII对它们作用的DNA序列上有两个明显不同的结合位点，其中一个是激活另一个的变构位点（allosteric）
3．酶量使用差异
cccDNA,linearDNA
单位酶:
在建议使用的缓冲液及温度下，在20l反应液中反应1小时，使1gDNA完全消化所需的酶量
六、酶切反应条件
任何一个提供商都会标明其产品的最佳作用条件
（一）缓冲液
1.常规缓冲液
pH,Mg++,DTT,BSA（10X）
①pH7.0-7.9（at25℃）Tris-HCl,乙酸
②离子强度：
NaCl
高中低
100mM50mM0
③Mg++10mMMgCl2,MgAc
④DTT（dithiothreitol,二硫苏糖醇）1mM
⑤100g/mlBSA少数需要
⑥乙酸盐缓冲液
⑦其它特用缓冲液，如NEB的U体系
不同酶具有不同Buffer
各公司设立几种常用Buffer
NEBuffer1BufferA
NEBuffer2BufferB
NEBuffer3BufferH
NEBuffer4BufferL
Roche
2.通用缓冲体系
Phamacia
One-Phor-Allbufferplus,OPA+
谷氨酸钾缓冲液（KGB）
Potassiumglutamatebuffer
2×KGB
10×OPA+
谷氨酸钾
200Mm
500MmKAC
Tris-乙酸
50Mm,pH7.5
100MmPh7.5
MgAc
20Mm
100Mm
BSA
100μg/ml
b-Me
1Mm
使用浓度不同
0.511.52
C
Enzyme
0.5
1
1.5
2
H
EcoRⅠ
50-75%
75-100
3
100
M
HindⅢ
<25-50
100
3
100
H
HindⅡ
>100
>100
4
100
L
KpnⅠ
100
100
-
25-50
H
PstⅠ
75
100
3
100
H
SalⅠ
<<25
<<25
3
100
L
ApaⅠ
100
100
25-50
2：
50-80%,3：
正常相当于厂家的活性4：
高于厂家提供的活性
3.双酶切策略
a.选用都合适的BufferorKGB
b.不可替代：
先低，加适量NaCl和第二种酶
c.先低后高（可纯化或不纯化）
4.注意事项
a.取少量酶（方法or稀释）
b.最后加酶、尽快操作
c.减少反应体积
d.反应时间的延长
e.分装（对于多个反应）
（二）反应温度
•大多数为37℃
•一部分为50-65℃少数25-30℃
•高温作用酶于37℃时活性多数10-50%
TaqI（65℃）10%,ApoI（50℃）50%
SmaI（25℃）37℃halflife15min
（三）反应时间
1hrormore
许多酶延长其反应时间可减少酶的用量
16hr
EcoRI0.13（1/8）
HindIII（1/8）
（四）反应终止
1.EDTA终10mM
2.加热
37℃酶65℃20min
otherwise80℃20min
不失活在80℃20min的酶
37℃：
Bg1IIHpaIPvuII
65℃：
Tth111ITspRI
50℃：
Bc1I
3.其它
DNA纯化（苯酚,试剂盒）
七、星星活性（staractivity）
1.概念
非特异性切割
在极端非标准条件下，限制酶能切割与识别序列相似的序列，这个改变的特殊性称星星活性。
实际上星星活性是限制内切酶的一般性质，任何一种限制酶在极端非标准条件下都能切割非典型位点。
ApoI、AseI、BamHI、BssHII、EcoRI、EcoRV、HindIII、Hinf1、KpnI、PstI、PvuII、SalI、ScaI、TaqI、XmnI
2.酶的特异性变化方式
与酶的种类和所应用的条件有关
EcoRI的研究表明
pH的升高和离子强度的降低可切N/AATTN
切割只有一个碱基不同的序列
3.引起星星活性的因素
①高浓度甘油（>5%）
②酶过量（>100U/g）
③低离子强度（<25mM）
④高pH（>pH8.0）
⑤有机溶剂
PMSD（二甲基亚砜）、乙醇、乙二醇、二甲基乙酰胺（dimethylacetamide）、二甲基甲酰胺（dimethylformamide）、sulphalane
⑥用其它二价阳离子代替Mg++
Mn++，Cu++，Co++,Zn++
不同的酶对上述条件的敏感性不一样
PstI比EcoRI对高pH更敏感，但后者对甘油浓度更敏感
星星活性在绝大多数情况下，是可控制的
4.抑制星星活性的条件（措施）
①减少酶的用量，避免过量酶切,减少甘油浓度
②保证反应体系中无有机溶剂或乙醇
③提高离子强度到100～150mM（如果不会抑制的话）
④降低反应pH至pH7.0
⑤使用Mg++作为二价阳离子
八、同裂酶（Isoschizomers）
识别相同序列的限制性内切酶，但它们的切割位点可能不同。
①完全同裂酶
识别位点和切点完全相同。
如HindⅢ和HsuI。
HindⅢ5’-A↓AGCTT-3’
3’-TTCGA↑A-5’
HsuI5’-A↓AGCTT-3’
3’-TTCGA↑A-5’
②不完全同裂酶：
识别位点相同，但切点不同。
如XmaI和SmaI。
XmaI5’-C↓CCGGG-3’
3’-GGGCC↑C-5’
SmaI5’-CCC↓GGG-3’
3’-GGG↑CCC-5’
同尾酶（Isocaudamers）
识别的序列不同，但能切出相同的粘性末端。
如BamHI、BglⅡ、BclI、XhoⅡ等
BamHI5’-G↓GATCC-3’
3’-CCTAG↑G-5’
BglⅡ5’-A↓GATCT-3’
3’-TCTAG↑A-5’U代表嘌呤；Y代表嘧啶。
BclI5’-T↓GATCA-3’
3’-ACTAG↑T-5’
XhoⅡ5’-U↓GATCY-3’
3’-YCTAG↑U-5’
Sau3A5’-↓GATC----3’
3’----CTAG↑5’
同尾酶的粘性末端互相结合后形成的新位点一般不能再被原来的酶识别。
BamHI5’-GGATCT-3’BglⅡ
3’-CCTAGA-5’
BamHI5’-GGATCT-3’BglⅡ
3’-CCTAGA-5’
Sau3A
九、限制性内切酶的命名
1973年H.OSmith和D.Nathans提议的命名系统，命名原则如下：
1、用属名的第一个字母和种名的头两个字母组成3个字母的略语表示寄主菌的物种名。
大肠杆菌（Escherichiacoli）用Eco表示；
流感嗜血菌（Haemophilusinfluenzae）用Hin表示。
2.用一个右下标的大写字母表示菌株或型。
如Ecok,EcoR（现在都写成平行，如EcoRI）。
3.如果一种特殊的寄主菌内有几种不同的限制与修复系统，用罗马字母表示。
如EcoRI，EcoRV。
4.限制酶前面要带上R（Restriction），
修饰酶前面要带上M（Modification）。
（现已省略）。
十、影响限制性内切酶活性的因素
1.DNA的纯度
DNA中的杂质如蛋白质、酚、氯仿、乙醇、SDS、EDTA等都会影响酶的活性。
一般采取
①纯化DNA
②加大酶的用量
③延长保温时间
④扩大反应体积（>20l）
2.DNA的甲基化程度
大肠杆菌一般有两种甲基化酶修饰质粒：
dam甲基化酶（修饰GATC中的A）；dcm甲基化酶（修饰CCA/TGG的C）。
基因工程中必须使用甲基化酶失活突变的菌株。
3.温度
不同的限制性内切酶的最适反应温度不同。
大多数是37oC，少数要求40-65oC。
酶
最适温度oC
酶
最适温度oC
酶
最适温度oC
ApaI
BclI
MaeII
TaqI
30
50
50
65
ApyI
BstEII
MaeIII
30
60
55
BanI
MaeI
SmaI
50
45
25
4.缓冲液（Buffer）
是影响限制酶活性的重要因素。
商品化的限制酶一般都带有专用缓冲液。
（1）缓冲液的化学组成
MgCl2、NaCl/KCl：
提供Mg2+和离子强度；
Tris-HCl：
维持pH；
二硫苏糖醇（DTT）：
保持酶稳定性；
牛血清白蛋白BSA等：
有助于酶的稳定；
十一、限制性内切酶对DNA的消化
1.内切酶与识别序列的结合模式
1986年J.A.McClarin等通过X射线晶体衍射发现II类限制酶是以同型二聚体的形式与靶序列结合。
2.完全消化
内切酶在DNA上的所有识别位点都被切开。
3.局部消化
只有有限数量的酶切位点被切开。
通过缩短保温时间、降低反应温度或减少酶的用量可达到局部消化的目的。
第二节DNA连接酶
一、DNA连接酶（ligase）的发现
从细菌DNA环化现象推测，必定存在一种能把两条DNA双链连接到一起的酶。
1．T4DNA连接
可以修复双链DNA骨架的断裂，催化限制酶酶解反应的逆反应，使退火的互补黏性末端共价连接在一起，形成新的DNA分子。
主要是催化双链DNA一端的3’-OH与另一双链DNA5’端的磷酸根形成3’,5’-磷酸二酯键，使具有相同粘末端或平端的DNA末端连接起来。
底物：
DNAorRNA（效率低）
粘端，切口，平端
影响因素：
PEG（低浓度）10%
单价阳离子（150-200mMNaCl）
提高平端连接速率
2.连接条件
（1）DNA3’端有游离的-OH，5’端有一个磷酸基团（P）。
（2）需要能量
动物或噬菌体中：
ATP
大肠杆菌中：
NAD+
温度16℃～4hr
4℃overnight
需ATP
5min连接T4DNAligaseRoomtemperature
2.E.coliDNA连接酶
与T4DNAligase相似,但需烟酰胺-腺嘌呤二核苷酸（NAD+）参与
平端连接效率低（不将RNA连接到DNA,不连接RNA）
3.TaqDNA连接酶
在两个寡核苷酸之间连接，同时必须与另一DNA链形成杂交体，相当于连接dsDNA中的缺口。
作用于45℃～65℃需NAD+，在PCR扩增中引入寡核苷酸，不可替代T4DNALisase，用于检测等位基因的变化/定点诱变
4.T4RNA连接酶
催化ssDNA或RNA的5’-磷酸与3’羟之间形成共价连接
DNADNA
5’P+3’-OHorpNp
RNARNA
第三节DNA聚合酶
一、基因工程中常用的DNA聚合酶
1、大肠杆菌DNA聚合酶
2.Klenowfragment
3.T7DNA聚合酶
4.T4DNA聚合酶
5.修饰过的T7DNA聚合酶
6.逆转录酶
二、常用的DNA聚合酶的特点
1.共同特点
把dNTPs连续地加到引物的3’—OH端。
催化DNA的合成。
2.主要区别
持续合成能力和外切酶活性不同。
T7DNA聚合酶可以连续添加数千个dNTPs而不从模板上掉下来。
其它几种DNA聚合酶只能连续添加10多个dNTPs就会从模板上解离下来。
3.常用DNA聚合酶的特性比较
DNA聚合酶
3’5’外切酶活性
5’3’外切酶活性
聚合速率
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