最新五芝液抗肿瘤作用的药理研究.docx

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最新五芝液抗肿瘤作用的药理研究

五芝液抗肿瘤作用的药理研究

一、五芝液体内抗肿瘤作用与免疫调节作用

20世纪70年代，日本学者最先发现灵芝提取物和灵芝多糖体内给药对动物移植性肿瘤有显著的抑制作用，并提出灵芝的抗肿瘤作用是“宿主中介性的”，可能是通过增强机体的免疫功能而实现的。

经一系列研究证明：

灵芝提取物及其所含多糖肽灌胃可抑制小鼠移植性肿瘤S180、人肺癌（PG）、Lewis肺癌的生长，但直接加到体外培养的S180或人白血病细胞的培养液中，对肿瘤细胞生长无抑制作用。

提示灵芝制剂在体内抑制肿瘤生长的作用确实是“宿主中介性的”，增强机体的抗肿瘤免疫力可能是其中重要的一环。

随后的研究证明，灵芝多糖肽可直接作用于单核巨噬细胞、树突状细胞和细胞毒T-细胞，增强其功能。

促进TNF-αmRNA和IFN-γmRNA表达，增加TNF-α和IFN-γ生成，也促进IL-1和IL-6等细胞因子生成，增强细胞因子的活性，从而抑制肿瘤细胞增殖，诱导肿瘤细胞凋亡，最终杀死肿瘤细胞。

在小鼠骨髓来源的树突状细胞（DC）体外培养体系中，加入灵芝多糖Gl-PS（0.8、3.2或12.8μg/ml）可明显促进DC表面DC11c及I-A/I-E分子的共表达、明显增加IL-1240亚基mRNA和蛋白表达、促进DC诱导的混合淋巴反应（MLC），表明灵芝多糖能促进DC的成熟、分化和功能。

在经P815肿瘤细胞裂解物冲击致敏小鼠骨髓来源的DC诱导产生的特异性细胞毒T淋巴细胞（CTL）模型，在冲击致敏阶段与不同浓度的灵芝多糖（Gl-PS）共培养，收集CTL及细胞培养上清液，以释放入CTL与P815肿瘤细胞共培养体系细胞培养上清液中的乳酸脱氢酶（LDH）活性代表CTL的特异性杀伤活性；同时用RT-PCR法检测CTL中IFN-γ及颗粒酶B的mRNA表达；用ELISA法检测细胞培养上清液中IFN-γ蛋白含量；用WesternBlot法检测CTL表达的颗粒酶B的蛋白含量。

结果显示：

当DC经P815肿瘤细胞冻融抗原冲击致敏后，其诱导产生的CTL对P815肿瘤细胞具有杀伤作用，灵芝多糖（Gl-PS）（0.8、3.2或12.8μg/ml）可增强此作用，使释放入培养上清液中的LDH活性显著增强。

进一步研究发现，同上浓度的灵芝多糖可明显增加DC诱导CTL的IFN-γ蛋白含量增加。

上述浓度的灵芝多糖还可明显增加DC诱导的CTL的颗粒酶BmRNA及蛋白表达。

这些结果提示，灵芝多糖在DC成熟阶段，增强DC对肿瘤抗原的捕获、处理、递呈能力，增强DC诱导的特异性CTL的细胞毒活性。

而灵芝多糖促进活化CTL的IFN-γmRNA转录及蛋白表达，使IFN-γ生成增加，后者通过其直接和间接作用发挥抑瘤作用。

颗粒酶参与促进CTL及NK细胞介导的细胞凋亡。

颗粒酶家族中，以颗粒酶B功能最强。

灵芝多糖促进CTL的颗粒酶BmRNA和蛋白质表达，与其增强CTL的细胞毒活性有关。

二、五芝液中灵芝多糖增强细胞因子诱导的杀伤细胞活性

继应用淋巴因子活化的杀伤细胞（LAK细胞）于肿瘤的过继免疫治疗之后，将人外周血淋巴细胞在体外与多种细胞因子共培养后，获得一群异质细胞即细胞因子诱导的杀伤细胞（CIK），具有增值力强、杀瘤活性高、杀瘤谱广、对多重耐药肿瘤细胞同样敏感等特点，且明显优于LAK细胞，比LAK细胞更适合于肿瘤的过继免疫治疗。

是新一代抗肿瘤过继细胞免疫治疗的首选方案。

有研究者按常规方法制备小鼠的CIK细胞[小鼠脾细胞培养中加入IFN-γ（1000kU/L）、抗CD3单抗（50mg/L）、IL-2（300Ku/L）和IL-1（100Ku/L）]，当培养中加入灵芝多糖（Gl-PS）（100和400μg/ml）后，可明显降低CIK细胞培养中的白介素-2（IL-2）和抗CD3单抗的用量（分别为未加灵芝多糖的对照组的75%和50%）。

但与对照组相似，能诱导和大量扩增CIK细胞，且此CIK细胞在体外杀伤YAC-1和P815肿瘤细胞的杀伤率亦与常规对照组无明显差异。

同样将此CIK细胞静脉输注给荷S180或荷H22肝肉瘤小鼠后，其体内抗肿瘤疗效与常规CIK细胞治疗组比较亦无差异。

研究者还发现，灵芝多糖在降低抗CD3单抗和IL-2用量50%和75%的条件下，能促进CIK细胞颗粒酶B以及穿孔素mRNA和蛋白的表达。

这表明灵芝多糖通过增加颗粒酶B和穿孔素的表达，从而增强CIK细胞杀伤肿瘤细胞的活性。

研究者的试验还证明，淋巴细胞表面的补体3型（CR3）受体介导灵芝多糖对CIK细胞的作用。

关于免疫细胞上灵芝多糖作用的受体还有一些研究。

Chen等研究发现，灵芝多糖（F3）结合巨噬细胞膜上TLR受体后，通过蛋白酪氨酸激酶PTK/PLCγl/蛋白激酶C（PKC）/丝裂原激活的蛋白激酶1（MEK1）/胞外信号调节激酶（ERK），PTK（Sac）/Racl/PAK/p38和PIK/Racl/PAK/JNK信号转导途径，诱导细胞因子IL-1产生。

具有（1-6）-β-D-葡聚糖分支结构的灵芝多糖PSG（10μg/ml）能够促进人单核细胞来源的树突状细胞（DC）表达CD80、CD86、CD83、CD40、CD54、人白细胞抗原（HLA）-DR,以及IL-12、IL-10蛋白及其mRNA，抑制DC的内吞活性；此外，经PS-G作用后的DC细胞刺激T细胞的活性增强，促进T细胞分泌IFN-γ、IL-10。

抗TLR4抗体中和实验表明，抗TLR4抗体可抑制PS-G诱导的IL-12、IL-10的分泌，提示PS-G作用于DC的信号通路中，TLR4发挥了关键作用。

一项研究表明，荧光胺标记的黄芪多糖（fl-APS）以TLR4依赖方式结合人和小鼠的巨噬细胞，流式细胞仪检测显示分子量为5.849X105的灵芝多糖（Gl-PS）可竞争性地抑制fl-APS和小鼠腹腔巨噬细胞的结合，提示Gl-PS能够结合巨噬细胞膜表面的TLR4受体。

进一步研究证明，GL-PS诱导Balb/c小鼠腹腔巨噬细胞产生IL-1β，但不能刺激C3H/HeJ小鼠腹腔巨噬细胞分泌IL-1β，而IFN-γ仍可刺激IL-1β的分泌；由于C3H/HeJ小鼠的TLR4基因有一个碱基突变导致TLR4受体胞浆区一个氨基酸由脯氨酸突变导致TLR4受体胞浆区一个氨基酸由脯氨酸突变成组氨酸，使TLR4丧失信号转导功能。

因此提示GL-PS可能通过TLR4激活巨噬细胞。

另外，发现兔抗小鼠Ig抗体明显抑制Gl-PS诱导的小鼠脾细胞增殖（Gl-PS可显著促进纯化的小鼠B细胞而非T细胞增殖），而对照正常兔IgG则无此作用。

抗小鼠Ig抗体浓度即使达到30μg/ml，对ConA诱导的脾细胞增殖没有显著影响，结果说明小鼠B细胞膜表面Ig分子参与Gl-PS对B细胞的活化过程，为B细胞表面Gl-PS受体分子之一。

比较Balb/c和C3H/HeJ小鼠脾细胞对Gl-PS的反应性，发现与LPS类似，Gl-PS可明显刺激Balb/c小鼠脾细胞增殖，但对C3H/HeJ小鼠脾细胞无刺激作用，表明TLR4参与Gl-PS对小鼠B细胞的活化过程，介导Gl-PS促进B细胞的增殖作用。

这些结果说明TLR4是B细胞和巨噬细胞表面重要的Gl-PS受体分子。

三、五芝液中灵芝成分抑制体外培养的肿瘤细胞增殖及其机制

近十余年发现灵芝及其有效成分对体外培养的肿瘤细胞具有抑制作用。

如发现灵芝（赤芝、紫芝、松杉灵芝）子实体提取物抑制体外培养的人乳腺癌细胞MCF-7、MDA-MB-231增殖；灵芝提取物GLE-1（主要含多糖）和GLE-2（主要含三萜类）抑制人结肠癌细胞SW480增殖，且后者的作用强于前者。

从灵芝子实体中提取的三种羊毛甾烷型三萜lucialdehydeA-C，其中lucialdehydeB和C对Lewis肺肉瘤（LLC）、T47D、S180和Meth-A肿瘤细胞株具有细胞毒作用。

lucialdehydeC对试验细胞株的细胞毒性最强，对LLC、T47D、S180和Meth-A这4种肿瘤细胞的ED50为10.7、4.7、7.1和3.8μg/ml。

一项研究是观察富含三萜组分的灵芝提取物对26种人癌细胞株的抗增殖活性，结果发现6种造血细胞株最敏感，其ED50（μg/ml）分别为：

HL-60（26）、U937（63）、K562（50）、Blin-1（38）、Nalm-6（30）和RPMI8226（40）。

细胞周期分析显示肿瘤细胞生长停止在G2期或M期，以HL-60细胞最为明显。

其中4种造血细胞株（HL-60、Blin-1、U937和RPMI8226）可见21%-92%的细胞凋亡。

在灵芝提取物作用下，HL-60细胞变成多核细胞，且其DNA含量增加。

结果指出，富含三萜组分的灵芝提取物对白血病、淋巴癌、多发性骨髓瘤有明显抑制作用。

灵芝孢子粉的乙醇提取物Ⅰ和Ⅲ显著抑制Hela细胞生长。

提取物Ⅲ能阻断细胞周期从G1期S期的转变，并使细胞内钙水平显著降低。

提示提取物可能通过影响细胞周期和细胞内钙信号转导而抑制肿瘤细胞生长。

从灵芝菌丝中制备的富含三萜组分WEES-G6在体外可抑制人肉瘤Huh-7细胞生长。

用WEES-G6处理细胞可是细胞生长调节蛋白PKC的活性降低，并抑制p38MAP激酶的活化，并因此延长细胞周期的G2期，抑制肝肉瘤细胞生长。

灵芝乙醇提取物可剂量和时间依赖性地抑制MCF-7肿瘤细胞增殖，这可能与其上调p21/Waf1和下调cyclinD1有关。

此外，它还可通过上调前凋亡蛋白Bax诱导MCF-7细胞凋亡。

从鹿角灵芝提取的一种四环三萜GanoderiolF（GolF）可诱导高度增殖的肿瘤细胞株老化，使HepG2、Huh7和K562肿瘤细胞生长停止，但对肝肉瘤Hep3B和正常成纤维细胞MRC5仅具非常弱的作用，而对末梢血单核细胞无作用。

除Hep3B外，用GolF处理体外培养的癌细胞，导致DNA合成迅速抑制，细胞周期停止进行，然而，在与药物作用24小时后，洗去培养液中的药物，HepG2细胞生长仍可恢复。

用30μmol/LGolF连续处理HepG2细胞18天之后，可见超过50%的细胞变大、变平，老化细胞呈现β-半乳糖苷酶阳性。

GolF在体外可抑制拓扑异构酶，这可能与其抑制细胞DNA合成有关。

在GolF处理的早期，可见丝裂原活化的蛋白激酶EKR活化以及上调周期素（cyclin）依赖的蛋白激酶抑制因子p16，推测这与引起细胞周期停滞以及触发HepG2细胞早老有关。

GolF引起肿瘤细胞生长停滞和老化提示它有潜在的抗肿瘤作用。

鹿角灵芝的甲醇提取物抑制人肝肉瘤HuH-7细胞、结肠肉瘤HCT-116细胞、Burkitt’s淋巴瘤Raji细胞和人急性白血病细胞（HL-60）的生长，半数抑制浓度（IC50）为82.2-135.3μg/ml。

一些成分在体外还能抑制拓扑异构酶Ⅰ和Ⅱα的活性。

其中最强的是羊毛甾烷三萜类的灵芝酸X（GAX；3α-hydroxy-15α-acetoxy-lanosta-7，9（11），24-trien-26-oicacid），GAX对HuH-7、HCT-116、Raji、HL-60细胞的IC50分别为20.3μg/ml、38.3μg/ml、39.2μg/ml和26.5μg/ml。

用GAX处理人肝肉瘤HuH-7细胞立即引起DNA合成抑制，也抑制ERK和JNK丝裂原-活化蛋白激酶的活化，并诱导细胞凋亡。

初步实验结果提示，GAX诱导肿瘤细胞凋亡的分子机制与其促使染色体DNA断裂、降低Bcl-xL水平、使线粒体膜破裂、促使细胞质中细胞色素C释放和caspase-3活化有关。

该作者认为，GAX抑制拓扑异构酶及使敏感细胞凋亡与其抗肿瘤作用有关。

最近发现，灵芝三萜提取物（GLT）抑制体外培养的人结肠癌细胞HT-29增殖，并抑制裸鼠移植性结肠肿瘤的生长。

GLT的这些作用与细胞周期的G0/G1期相阻滞及诱导结肠癌细胞Ⅱ型自吞噬（autophagy）程序死亡有关。

研究者发现，GLT诱导结肠癌细胞中出现自吞噬空泡，并上调Beclin-1表达（增加1.3倍）以及LC-3蛋白表达（增加7.3倍），移植性结肠肿瘤模型裸鼠Beclin-1增加3.9倍，LC-3增加1.9倍。

自吞噬是由p38丝裂原活化蛋白激酶（p38MAPK）被抑制而产生，p38MAPK抑制剂SB202190可引起癌细胞自吞噬，并使Beclin-1和LC-3表达分别增加1.2倍和7.4倍。

GLT抑制结肠癌细胞P38MAPK磷酸化可达60%。

通过用流式细胞仪测量细胞活力、细胞周期。

用DNA断裂定量检测细胞凋亡，用Western-blot法检测细胞内凋亡蛋白和激酶的变化，研究灵芝子实体提取物和甲醇提取物经柱层析半纯化的组分诱导NB4人白血病细胞的毒性及凋亡作用。

结果可见，灵芝子实体提取物稍微降低NB4细胞活力的诱导NB4细胞的DNA断裂。

甲醇提取物半纯化组分在稀释到15%或40%浓度时，显著降低NB4白血病细胞的活力并伴随诱导DNA断裂和细胞凋亡。

其E3组分稀释到15%的初始浓度引起与Bcl-2/Bax相关的p53基因水平降低，以及非磷酸化和磷酸化Akt（蛋白激酶Akt，蛋白激酶B）与ERK（ERK1、2）两者水平降低。

表明灵芝的活性组分可引起人白血病细胞凋亡并使信号转导激酶（Akt和ERK）变化。

灵芝乙醇提取物（EGL）处理可剂量依赖性地引起人胃癌细胞AGS的活率显著降低，在细胞活率降低的同时，可见AGS细胞中染色质凝聚以及凋亡碎片聚集，即EGL引起AGS细胞凋亡。

EGL处理可引起死亡受体相关蛋白，如死亡受体5以及TNF相关凋亡诱导配体的表达，它们再进一步激活caspase-8活化和Bid分裂。

此外，EGL处理细胞中，EGL诱导的调往增加与激活caspase-9和caspase-3，下调IAP家族蛋白如XIAP和存活素以及相伴的多ADP核糖聚合酶降解有关。

而且，EGL处理细胞中Akt活性也下调，磷脂酰肌醇-3激酶/Akt抑制剂LY294002增加AGS细胞对EGL诱导的凋亡的敏感性。

结果指出，EGL诱导的AGS细胞凋亡是通过死亡受体介导的外在信号级联放大以及线粒体介导的内在级联放大途径而实现的，也与Akt信号通路失活有关。