ABI3500xL基因分析仪操作流程.docx
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ABI3500xL基因分析仪操作流程
ABI-3500xL基因分析仪操作流程
ABI3500xL基因分析仪操作流程
一、标准测序反应
（一）质粒测序标准实验流程
1．对质粒DNA的质量和浓度要求
纯度：
OD260/OD280=1.6~2.0，用量：
每反应150~300ng。
2．测序PCR反应
标准反应体系：
3．测序产物纯化：
使用EdgeBio收集柱进行纯化。
（1）离心850g，3min柱子，弃掉收集管，换新的EP管。
（2）将待纯化样品加到柱子中间，注意不要加到离心柱侧壁上。
（3）离心850g，3min，弃掉柱子，即得纯化产物。
（4）取10µLHi-DiFormamide加入96孔板中，再加入10µL待测样品，振荡混匀离心。
（二）PCR产物测序标准实验流程
1．对PCR产物的要求
纯度：
OD260/OD280=1.6~2.0，用量：
每反应10~100ng。
强烈建议在测序前，先纯化PCR产物。
2．PCR产物的测序PCR反应
标准反应体系：
3．测序产物纯化：
方法同上。
二、上机测序
（一）启动系统
1.打开电脑，检查电脑右下角处3500监控状态是否正常启动。
2.打开3500xL仪器电源，等待仪器自检，指示灯由黄色变为绿色即为自检完成。
3.启动电脑桌面Datacollectionsoftware。
4.检查维护提醒：
浏览维护提醒，若已完成点击。
5.检查耗材状态：
点击“Refresh”，更新后检查仪表盘上各种耗材的状态（POP7、ABC、CBC
6.
7.
1.点击屏幕下方的AssignPlateContents。
（1）输入各个孔的样品名称等信息，Resultsgroup：
输入结果的保存路径。
（2）选中下面控制面板上Assay，Filenameconvention，Resultsgroup三个项目。
（3）点击LinkPlateforRun→OK。
2.检查屏幕上显示的各种信息，确定正确无误后点击StartRun，即启动运行。
（四）监控运行
仪器正在运行时，可在软件中监控运行情况。
1.可查看选中的单孔或某一排的运行情况，查看InstrumentRunViewsandFlags中各项：
EPT（电流、电压、温度），Array中可查看峰图。
2.可编辑进样列表：
重复进行，改变次序，删除进样，终止进样等操作。
3.启动、暂停或继续运行。
（五）查看结果
点击ReviewResults即可查看原始的测序结果，分析结果方法见下。
三、分析测序结果
1.打开软件：
双击电脑桌面SequencingAnalysisv5.4图标。
2.导入结果：
点击工具栏中Addsamples按钮，选择路径，导入待分析的测序结果。
3.分析：
Samplemanager中选择分析方法对测序结果进行分析。
一般用BC（baseclling,将原始结果翻译为对应的碱基序列）。
（1）选中BC复选框，点击工具栏中Startanalysis按钮，即开始分析。
（2）分析结束后，结果将自动保存为ab1格式文件。
（3）点击工具栏中Analysisreport按钮，可查看结果状态（BCstatus），不同颜色代表不同测序结果，可判定本次测序成功与否。
（4）选中某样品前show复选框，即可查看各样品的详细结果。
A．sequence显示碱基序列及其QV评分结果。
注意：
a.蓝色：
HighQV=20+，结果可信；黄色MediumQV=15to19，需查看峰图，判定结果是否可信；红色LowQV≤15，结果不可信。
b.此处可选中序列，右键复制即可将结果粘贴保存到txt文档中。
B．Electropherogram显示电泳峰图及序列。
C．Raw显示看到原始电泳图。
4.打印：
Samplemanager中选中P（print）复选框，点击Startanalysis绿色按钮，即可将测序结果输出为pdf格式文档。
操作注意事项
1.测序反应：
（1）模板：
测序反应对模板质量要求很高，一般需经纯化才可使用；模板用量也有规定。
（2）反应体系：
一般用标准的反应体系，也可用稀释反应体系（比如序列比较简单时），一般8倍以内稀释比较可靠。
（3）反应条件：
退火50℃和延伸60℃时，升降温速度需降低至1℃/s，使测序反应充分进行。
（4）体系配制：
反应体系的制备不能在样品制备区和PCR区进行，移液器不能混用，否则会造成实验室污染。
ABI3500xl日常维护
1.毛细管维护：
（1）每周查看阴极缓冲液的液面，避免毛细管露出液面干燥而失效。
若液面下降，可在阴极缓冲液中加入双蒸水，保证毛细管插入液面下。
下次电泳前换新的缓冲液。
（2）防止碰触毛细管针尖，只有在更换新的毛细管时才需打开检测窗口门，之后需在软件中重新校正。
包括：
A空间校正，maintainance→calibrate→speitial，选择fill灌胶后开始，选择nofill不灌胶直接开始→startcalibrate。
结果判定，所有峰只有一个尖且间距在15，16间，峰高比较均一，相差不超过60%，可接受，完成后要点Accept或者reject。
B光谱校正，换新毛细管、不同类型试剂盒、不同类型胶时需做maintainance→calibrate→spectial，G5为片段分析用，Z为测序用→calibraterun，chemistrystandard：
G5。
完成后需点Accept。
（3）若长期不用仪器时，仍需每周给毛细管灌胶一次。
（fillarraywithpolymer）
2.仪器日常维护：
（1）可用无尘纸巾、棉签和蒸馏水擦拭仪器表面，勿使用有机溶剂，不能随意搬动仪器。
（2）严禁在电脑上安装其他无关软件，不准用U盘拷贝数据，只能刻盘。
（3）长期不用应将POP7胶取下加塑料塞放入4℃冰箱，用漂洗袋代替。
并每周进行一次replenishpolymer。
（换新胶袋后和每周一次）。
（4）若机器使用频繁应每周用contridationingregents清洗灌胶泵（washpumpandchannels）
一次。
（5）fillarraywithpolymer，换毛细管后或认为灌胶有问题时重新灌。
（6）shutdown，长期不用时关闭仪器，慎用。
（7）removebubbles，排气泡。
（8）灌胶泵维护每月一次：
A，水峰，松开泵上方进口旋钮，用注射器注射纯水5-10ml，要缓慢注射，洗去水峰中的杂质，结晶。
B，拆掉buffer，胶时可手动洗泵，从泵下方进胶处注射入纯水，也可contridationingregents洗泵。
4.操作注意：
（1）操作时必须戴手套。
（2）Hi-DiFormamide为变性剂，操作时需注意安全。
（3）仪器运行时不能打开仓门，软件运行时勿进行其他软件的操作。
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