面包酵母的诱变选育培养基优化及发酵过程Word文件下载.docx
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1.1菌种
面包酵母（来自边老师提供）
1.2培养基
1.2.1PAD培养基
马铃薯（去皮）200g,切成小块,加1000mL水,煮沸1h,用双层纱布滤,取出滤液,加葡萄糖20g使其完全溶解,加水定容到1L,pH自然。
若为固体培养基,则加琼脂20g/L。
1.2.2发酵培养基
经过2.2优化步骤选出的最优培养基配方,在文章中会介绍到。
1.3试剂
琼脂;
葡萄糖;
酵母膏;
蛋白胨;
（NH4）2SO4;
自来水
1.4器材及用具
分析天平、普通光学显微镜、高压灭菌锅、震荡培养箱、恒温培养箱、培养皿、超净工作台、发酵罐、蒸汽发生器、空气压缩机等;
锥形瓶、枪头（蓝、黄）、移液器、涂布棒、试管、血细胞计数板、计数器、酒精灯等。
1.5发酵罐
发酵罐的结构包括罐体、挡板、搅拌、空气分布系统、热交换系统、蒸汽系统等。
不同的系统作用不同,且为稳定发酵条件起到重要的作用。
2.试验方法
本实验以小组为单位自行设计实验流程。
2.1诱变选育菌种
采用物理因子紫外线诱变面包酵母,DNA能够强烈吸收紫外线,尤其是碱基中的胸腺嘧啶,从而形成二聚体,改变DNA结构,引起基因突变。
再筛选有利突变菌株进行培养。
常用的是15瓦的低功率紫外灯,其波长集中在253.7nm,距离常用34cm,时间几十秒到几分钟不等。
2.1.1培养基配制及无菌物品准备
配制PAD固体培养基、液体培养基,准备培养皿、试管、9ml无菌水试管、涂布棒、枪头等包好,置于高压灭菌锅中,121℃,20min灭菌。
打开超净工作台紫外灭菌30min。
2.1.2制备菌悬液
在超净内,取1ml菌悬液加入盛有9ml无菌水的试管中,计数。
顺序依次进行10-1～10-8稀释。
2.1.3涂布法接种
选取上述稀释好的浓度为×
10-6和×
10-7的菌悬液,各吸取0.5ml涂布在固体平板培养基上,每个稀释度涂15板,保证每个固体平板培养后菌落数在30～80个,以便菌落计数和菌落形态观察。
做好标记。
2.1.4紫外诱变
本实验设计了0s、30s、60s、90s、12s五个诱变剂量,将上述培养基分组置于超净工作台内,每个稀释度作3个平行。
由于紫外线的穿透能力很差,因此要打开平皿盖,按照五个诱变剂量进行紫外照射诱变。
标记。
在培养箱中28℃倒置培养1～2天。
诱变时间
稀释度
0s
30s
60s
90s
120s
×
10-6
1
2
3
10-7
2.1.5突变菌株的筛选
将培养好的培养皿进行菌落计数和形态观察,找出菌落生长状态最好的平板,记下稀释度和诱变剂量。
在无菌条件下挑单菌落,接液体培养基,28℃震荡培养3天,挑选生长好的菌液,4℃冰箱保存,备用。
2.2正交试验设计优化培养基
正交试验设计（Orthogonalexperimentaldesign）是研究多因素多水平的设计方法,它是根据正交性从全面试验中挑选出部分有代表性的点进行试验,这些有代表性的点具备了“均匀分散,齐整可比”的特点,是一种高效率、快速、经济的实验设计方法。
本实验设计四因素三水平即L9（34）来筛选最优培养基配方。
2.2.1根据问题和实际要求确定影响因子及影响因子水平,列出因子水平表。
影响因子
影响水平
酵母膏
蛋白胨
葡萄糖
pH
0.5%
2.0%
5
1.5%
4.0%
6
3.0%
6.0%
7
2.2.2根据因子水平表设计正交表。
No.
4
8
9
对照
1%
2%
6.4
2.2.3根据正交实验设计表进行试验。
2.2.3.1培养基配制及无菌物品准备
配方基础为：
酵母膏（1%）;
蛋白胨（1%）;
（NH4）2SO4（0.5%）;
葡萄糖（2%）;
pH=6.4。
将上述基础药品配制成10倍母液,每种培养基配30ml,按比例加入母液。
最后调pH。
另按配方基础配一组培养基作为对照组。
将培养基和所需用具包好,进行湿热灭菌,121℃,20min。
2.2.3.2接种
待培养基冷却至60℃左右时,无菌条件下,每管培养基接种1ml菌悬液。
28℃摇培17h。
2.2.3.3计数及级差分析
将上述培养好的10种培养基的菌液稀释到合适浓度后进行计数和级差分析,筛选出最适面包酵母生长的培养基配方,作为优化培养基,用以进行发酵。
2.3分批发酵
2.3.1熟识发酵罐结构
2.3.2发酵前准备
按照最优培养基配方配制培养基：
酵母膏20g、蛋白胨10g、葡萄糖40g、（NH4）2SO45g、pH=6.4。
把配好的培养基倒入发酵罐中定容至12L。
2.3.3分批灭菌
2.3.3.1盖好罐盖,对成拧紧螺丝,温度控制改为手动控制;
2.3.3.2开排气阀门402,开阀门403排夹套冷却水,关闭其他阀门;
2.3.3.3开启搅拌;
2.3.3.4开蒸汽阀门202,夹套进汽,待排水出口有蒸汽排出时,关小阀门403,进行培养基预热;
2.3.3.5当培养基温度达到98℃时,停搅拌,开蒸汽阀门201,微开阀门401,关小阀门402;
2.3.3.6调节蒸汽阀门201、202,使罐温稳定在120～124℃。
开始计时;
2.3.3.7取样阀灭菌,开蒸汽阀门203,半开阀门405,缓慢旋开取样阀;
2.3.3.8旋松接种口盖,有少量蒸汽冒出即可。
灭菌维持20～30min;
2.3.3.9灭菌结束。
旋紧取样阀门,关闭阀门405、203,开402、关闭401;
2.3.3.10关闭蒸汽阀门202、403;
2.3.3.11关闭201,当罐压接近0.05Mpa时,开空气流量计针阀,开阀门102,空气进入罐内,调节排气阀门402,控制罐压;
2.3.3.12开进水阀门302、404,该温度控制为自动控制,开始冷却。
冷却到设定温度,备用。
2.3.4发酵罐接种
接种前,用75%酒精棉球对接种口消毒,然后火焰环放置在接种口处,按10%接种量将种子液迅速倒入发酵罐内。
2.3.5发酵过程监控
在发酵过程中,每隔30min,记录发酵液的pH值和溶氧（Do）值,并每隔1h用试管在取样口处取样,对菌液进行计数。
2.3.6结束发酵
停止发酵后,对发酵液和冷却水进行放罐,仔细清洗发酵罐和电极,重新安装备用。
3.结果与讨论
3.1诱变育种结果
由下表可以看出,经过诱变后,酵母菌的死亡率非常高,部分平板的结果甚至是100%。
可能是由于计数时出现失误,经稀释后菌的浓度过低,大剂量的诱变对菌体伤害作用很大,导致死亡。
只有在×
10-6浓度、30s诱变剂量下出现了符合要求的突变菌株。
诱变时间
46
39
17
19
13
死亡率（%）
97.7
98.9
100
3.2正交试验设计优化培养基结果
3.2.1正交结果（级差分析法）
级差R的大小代表影响因素对菌体生长的影响水平大小,级差越大,说明该因素对菌体繁殖的影响越大,即为主要影响因素。
根据级差R的大小确定主次因素的次序,可知四因子对菌体生长繁殖的影响程度依次为酵母膏>
蛋白胨>
pH>
葡萄糖。
据K值的大小确定最适宜的配比,最大的K值对应最好的水平。
对照组最终的菌液浓度为6.87×
108个/ml，3、4、6、7、8、9组的菌液浓度均大于对照组。
因此,本组的最适培养基配方组成为：
酵母膏3%、蛋白胨3%、葡萄糖4%、pH=5（如下表所示）。
菌液浓度（×
108个/ml）
6.57
7.5
6.25
8.75
8.2
12
K1
6.08
6.67
6.98
6.75
K2
7.67
6.61
7.77
K3
9.42
7.25
7.9
级差R
2.98
2.75
0.78
1.15
3.2.2各影响因子的影响趋势
3.2.2.1酵母膏
根据K值的变化趋势，可以看出酵母膏含量越大，k值越大，即菌体生长越旺盛。
且K值有继续增大的趋势，说明还可以增大培养基中酵母膏的含量。
3.2.2.2蛋白胨
由K值的变化趋势可以看出，蛋白胨含量在0.5%～1.5%范围内时，菌体繁殖速率缓慢；
在1.5%～3%范围内，随着蛋白胨含量的增加，菌的生长水平也越来也好。
按照该趋势，还可以继续增加蛋白胨的含量。
3.2.2.3葡萄糖
根据K值大变化趋势可以看出，葡萄糖含量在2%～4%范围内，随着葡萄糖含量的增多，酵母菌生长越旺盛；
而在4%～6%范围内，酵母菌的生长速度则随着葡萄糖含量的增多而下降。
说明4%是葡萄糖的最好水平。
3.2.2.4pH
由图可以看出，K值随着pH的增大而逐渐增大，在6～7范围内趋势变缓。
即酵母菌的生长随pH的增大而越来越旺盛。
该结果与实际酵母菌在其生长最适pH范围的生长趋势不符，可能是由于培养基中糖含量高造成的。
3.3分批发酵结果
周期
菌数（个/ml）
Do（%）
0h
4.825×
106
6.09
0.5h
5.5×
6.01
83.3
1.0h
——
5.94
79.4
1.5h
7.4×
5.87
2.0h
5.80
78.1
2.5h
1.27×
107
5.70
77.0
3.0h
5.59
72.0
3.5h
1.93×
5.44
65.0
3.3.1发酵过程中生长曲线
由图可以看出，随着发酵时间的增长，酵母菌的繁殖速度越来越快，从延迟期阶段过渡到对数生长期初期阶段。
由于营养物质丰富，细胞生长不受限制，细胞浓度呈指数增长，比生长速率会在对数期中期达到最大值。
3.3.2pH曲线
由图可以看出，随着发酵时间的增长，发酵液的pH值逐渐变小。
排除杂菌污染的可能，主要是由酵母菌生长代谢和培养基成分的改变引起的。
3.3.3溶氧变化规律
由图可以看出，随着发酵时间的增长，发酵液的溶氧量降低速度先是很快，然后缓慢，之后又加快。
菌体浓度直接影响发酵液的溶氧量，因此，随着菌体的浓度的增大，溶氧量逐渐降低。
且菌体的自身代谢对溶氧量也有很大的影响。
4.实验中存在的问题及改进措施
整个实验分三次完成,流畅性很好,总的来说是比较成功的。
但由于时间等客观条件限制的原因,实验中出现了一些问题。
主要问题及改进措施如下：
4.1紫外诱变育种过程
死亡率过高由于初始菌悬液浓度计算失误,使得涂布接种到培养基上的菌数过少,再经紫外照射,导致部分平板上无菌落生长,即菌的死亡率为100%。
改进为了降低诱变后的死亡率,可以改为先按诱变剂量诱变初始菌悬液,之后再计数,进行梯度稀释,再涂布接种,可以提高存活率。
4.2培养基优化过程
影响因子的梯度范围相差不大,不能全面反映影响程度的总体趋势。
且只进行了这一次实验,存在较大误差。
改进设计影响因子的范围梯度时,应先设计较宽范围,得出大体影响程度趋势,再一步一步进行细化,逐步得到最优水平的培养基配方。
还应设计2～3个平行,以减小实验误差。
4.3发酵过程
由于受到时间的限制,实验并没有涉及到发酵的全过程,菌体的生长只度过了延迟期,进行到了对数期的初期,不能得到酵母菌的完整的生长曲线,实验的完整性不好。
改进合理利用课余时间,安排学生参观发酵设备和体验发酵过程,使同学们能接触到发酵的每一个时期,了解整个发酵周期的调控,加深对发酵技术的理解。
5.研究展望
发酵工程是一门具有悠久历史,又融合了现代科学的技术,是现代生物技术的组成部分。
现代的发酵工程不仅包括菌体生产和代谢产物的发酵生产,还包括微生物机能的利用,其主要内容为生产菌种的选育,发酵条件的优化与控制,反应器的设计及产物的分离、提取与精制等。
工业生产上常用的微生物包括细菌、放线菌、霉菌和酵母等。
在目前能源、资源紧张,人口、粮食及污染问题日益严重的情况下,发酵工程作为现代生物技术的重要组成部分之一,得到越来越广泛的应用,而其中酵母菌的发酵技术更是迅猛发展,有着广阔的发展前景。
参考文献
［1］边艳青.发酵工程实验指导.河北师范大学生命科学学院,2008.
［2］姜天笑,肖冬光,刘青,胡娅兰.快速发酵面包酵母菌株的选育.食品研究与开发,2006.
［3］曹军卫,马辉文,张甲耀.微生物工程（第二版）.科学出版社.
［4］刘如林．1995．微生物工程概论.天津：
南开大学出版社.
［5］束强民,陈孝民,颜方贵.面包酵母菌种改良的研究进展.食品与发酵工业.1996.
［6］XX百科,XX文库,谷歌搜索.
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