植物种子萌发过程中ICDH活性的变化Word文档下载推荐.docx

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而异柠檬酸脱氢酶（ICDH）具有抗氧化作用，其合成的大量的NADPH参与谷胱甘肽氧化还原系统维持植物细胞的抗氧化系统，以抵御因ROS积累造成的氧化胁迫。

本实验将绿豆种子培养于含30μM/LAT的培养基上，以此来调节绿豆胚根、下胚轴和子叶的H2O2水平从而影响绿豆胚根、下胚轴和子叶的生长。

通过测定与H2O2代谢有关的ICDH的活性，探究AT影响绿豆胚根、下胚轴和子叶生长的机制。

结果表明，AT处理的绿豆胚根和下胚轴的生长受到明显的抑制，而且时间越长，抑制现象越明显；

用AT处理绿豆种子，其子叶质量与对照组的相比，质量增加了，且随着时间的延长，质量增加越多。

同时，用AT处理后，胚根、下胚轴和子叶ICDH的活性与相应对照组的相比，活性都升高了。

关键词：

3-氨基三唑（AT），异柠檬酸脱氢酶（ICDH）,过氧化氢（H2O2），活性氧（ROS），绿豆，子叶，下胚轴，胚根

Abstract:

3-Amino-1,2,4-Triazole（AT）isaspecificinhibitorofcatalase（CAT），andCATisusedtoremovehydrogenperoxide（H2O2）,whichaccumulationofH2O2cancauseoxidativestress,thenthecellsaredamaged.GlutathioneredoxsystemplaysanimportantroleingettingridofROSandmaintainingthestabilityofbiologicaloxidationstateandreductionstate.Isocitratedehydrogenase（ICDH）hasantioxidanteffect,andtheamountofNADPHwhichissynthesizedbyICDHparticipateinglutathioneredoxsystemtomaintaintheantioxidativesystemofplantcells.Inthisstudy,mungbeanseedswerecultivatedrespectivelyinasingleculturemediumcontaining30μM/LAT,inordertoadjustthelevelofH2O2ofradicles,hypocotylsandcotyledonstoaffectthegrowthofradicles,hypocotylandcotyledon.WeexploretheimpactofATtomungbeanradicles,hypocotylandcotyledonbymeasuringtheactivityofICDHwhichhasacloserelationshipwiththemetabolismofH2O2.Theresultsshowedthat,bythetreatmentofAT,thegrowthofmungbeanradiclesandhypocotylweregreatlyinhibited,andthelongerthesuppressionisgreater;

thequalityofmungbeancotyledoncomparedwiththecontrolgrouphasincreased,andwithtime,moreweightgain.Also,ICDHactivityofradicles,hypocotylsandcotyledonscomparedwiththenormalgrowthhasincreased.

Keywords:

3-Amino-1,2,4-Triazole（AT），isocitratedehydrogenase（ICDH），HydrogenPeroxide（H2O2）,reactiveoxygenspecies（ROS）,mungbean，cotyledon，hypocotyl，radicle

前言：

过氧化氢（H2O2）是活性氧（reactiveoxygenspecies,ROS）的一种。

活性氧是需氧生物细胞正常有氧代谢的产物，已知在逆境伤害、机体损伤、细胞分裂、酶反应等方面都可能涉及到活性氧的作用。

活性氧可与DNA、类脂化合物和蛋白质反应，引起细胞损伤。

在植物组织中，活性氧类型主要有H2O2、（·

OH）、O2-等[1]。

H2O2在植物体内有着各种各样的生理功能。

例如在植物生长的早期，适当的提高植物体内的H2O2水平，幼苗的下胚轴生长旺盛，主根的长度增加加快、侧根增多，表现出H2O2对植物生长的促进作用，但是到高浓度H2O2处理下，幼苗的胚根生长到一定程度就停止生长，下胚轴几乎不生长，表现出H2O2对植物生长的抑制作用[2]。

H2O2还是植物体内的一种信号分子，大量植物抗病、干旱、盐碱等胁迫条件下的研究为此提供了有力的证据[3]。

正常生理条件下，活性氧在体内虽不断产生，但也不断被清除。

生命的进化使细胞发展了有效的抗氧化防御机制。

通常在组织的正常氧化代谢过程中产生的ROS，通过组织内的防御机制（自由基清除酶类和抗氧化剂）来维持平衡。

平衡状态的活性氧浓度是极低的，不仅不会损伤机体，而且可显示其独特的生理作用。

但是在一些损伤因素的作用下，细胞内的氧化代谢物增加，或细胞中抗氧化保护机制不足时，使活性氧产生堆积并对细胞产生毒性[4]。

生物体存在抗氧化系统可以清除活性氧。

谷胱甘肽氧化还原系统广泛存在于各物种和细胞中，在细胞抗氧化，修复细胞损伤，清除自由基，维持细胞内正常的氧化还原势能等方面起到重要作用。

谷胱甘肽氧化还原循环包括谷胱甘肽，催化谷胱甘肽氧化的酶和催化谷胱甘肽还原的酶。

催化氧化的酶主要有谷胱甘肽过氧化物（glutathioneperoxidase,GPx），谷胱甘肽S转移酶（GST）和硫氧还蛋白过氧化物酶（thioredoxinperoxidase,Tpx），它们借助谷胱甘肽（GSH）的氧化，清除生物体内的活性氧，维持生物内氧化态和还原态的稳定，谷胱甘肽本身由还原态（GSH）转变为氧化态（GSSG）;

催化还原的酶主要包括谷胱甘肽还原酶（glutathionereductase,GR）和硫氧还蛋白还原酶（thioredoxinreductase,TrxR），它们将氧化后的谷胱甘肽（GSSG）重新还原[5]。

在还原型辅酶Ⅱ（NADPH）的参与下，GR和TrxR将氧化型的谷胱甘肽（GSSG）重新转化为还原型的谷胱甘肽（GSH），对于维持生物体GSH和GSSG比的稳定、保持体内氧自由基平衡起着重要作用[4]。

GSH和GSSG组成了细胞内重要的氧化还原对。

在氧化还原反应中，GSH持续被氧化成GSSG，GSSG再被GR和TrxR还原，从而构成谷胱甘肽氧化还原循环（如下图）[4]。

在真核细胞中，异柠檬酸脱氢酶（isocitratedehydrogenase,ICDH）存在于多种细胞器中，包括过氧化物酶体、线粒体、叶绿体和细胞质[6]。

近年来的研究表明植物ICDH是细胞NADPH的重要来源之一。

NADPH是组成细胞生化网络核心的重要成员之一，它主要为生物合成提供还原力[7]。

ICDH具有抗氧化作用．其合成的大量的NADPH可以维持植物细胞的抗氧化系统，以抵御因ROS和活氮的积累造成的氧化胁迫．而且ICDH还具有维系细胞质和线粒体之间氧化还原平衡的作用，如抗氧化系的关键物质谷胱甘肽（GSH）首先在细胞质中合成，而后以还原型GSH转移到线粒体．但完成抗氧化作用后，氧化型GSH不能穿过线粒体内膜，需要在NADPH的参与下恢复为还原型GSH才能回到细胞[7,8,9]。

此外，ICDH合成的NADPH还对细胞的凋亡和衰老等生理过程起重要的调节作用[10]。

AT是过氧化氢酶的一种专一性抑制剂。

本课题是将绿豆种子培养于含有30μM/LAT的培养基上[11]。

通过对绿豆胚根、下胚轴和子叶形态学的观察，测定胚根、下胚轴和子叶内源ICDH活性的变化，探究影响绿豆胚根、下胚轴和子叶生长的分子机制。

1.材料与方法：

1.1实验材料、药品及器材：

（1）实验材料：

绿豆种子（Phaseolusaureus）

（2）实验药品：

3-氨基三唑（AT）、琼脂粉、0.1%HgCl2溶液、Tris-HCl（10Mm，蔗糖pH7.8）、ICDH反应液等

（3）实验器材：

烧杯、培养皿、培养瓶、直尺、研钵、离心机、电子天平、分光光度计、移液枪等

1.2种子处理方法和幼苗培养过程：

（1）将培养皿、烧杯清洗干净，再将这些培养皿、烧杯和无菌水在125℃下进行灭菌1小时，然后将它们放入超净工作台。

（2）挑选籽粒饱满，大小基本相同的绿豆种子（约1500粒），放入超净工作台内灭过菌的小烧杯中，用0.1%的HgCl2浸泡10min后，倒去HgCl2，用无菌水快速冲洗两次后，再用无菌水洗涤4-5次，总共时间约为30min。

将处理好的绿豆种子倒入培养皿中，再加无菌水，于超净工作台中放置48h，待其萌发。

（3）配置AT溶液：

AT溶液的配置：

取0.1563gAT用无菌水溶解，然后定容到200ml，配成930μM/L的AT溶液。

（AT的相对分子质量为84.04）

（4）培养基制作方法：

称取琼脂粉33g，加入3600ml蒸馏水，配置成0.9％的琼脂培养基，分装于116个培养瓶中，每瓶30ml，再将这些培养瓶于121℃下灭菌15min。

灭好菌后放入超净工作台内。

（5）趁培养基还没有凝固，将1ml930μM/L的AT溶液加入培养基中，摇晃均匀，待其凝固。

这样就配成了30µ

M/L的AT培养基。

共配置了68瓶含AT的培养基和48瓶不含AT的培养基。

注意在相应的培养瓶上注明“AT处理”和“无AT处理”的标记。

（6）将已经于培养皿中萌发了48小时的绿豆种子去皮，并接种到培养瓶中，每个瓶中放入十粒种子，封好瓶口，将绿豆放在培养室中培养。

在接种时注意随机取样。

（7）在培养瓶中的绿豆种子在培养后的第4天和第7天，分别取出实验组和对照组种子，切下子叶，下胚轴和根，分别测量每个培养瓶中子叶的鲜重、下胚轴的鲜重和长度、胚根的鲜重和长度以及侧根数量。

测量后分类装入不同的瓶中并做好标记，于-20℃保存，以备后续测量。

（8）测定绿豆幼苗的胚根，下胚轴和子叶中的ICDH的活性。

1.3测定方法:

（1）形态学生长指标的测量：

在子叶刚切下时，用电子天平称量子叶的鲜重，记录数据并计算出平均鲜重；

在下胚轴刚切下时，用直尺测量下胚轴的长度，用电子天平称量下胚轴的鲜重，记录数据并分别计算出下胚轴的平均长度和平均鲜重；

在胚根刚切下时，用直尺测量胚根长度，用电子天平称量胚根质量，并统计出侧根的数量，记录数据并计算出胚根的平均质量和平均侧根数。

（2）植物组织中ICDH活性的测量：

①提前半小时将制冰机打开制冰，待冰制好后取适量冰于冰盒中。

②将研钵用去离子水清洗干净并且干燥，然后将研钵置于冰盒上。

将储存于-20℃冰箱中的三种样品（子叶，下胚轴，根）取出，每种样品的分别称取0.2g左右，且每种样品分别称取三份，用作重复试验。

将称取好的样品置于洗净的研钵中，在冰浴条件下充分研磨，待研磨成浆状后加入1mL预冷的Tris-HCl（10Mm，蔗糖pH7.8），继续研磨，直至完全研磨成匀浆。

将研磨好的匀浆转移至1.5mLEP管中，在EP管上做好标记后置于冰盒中，确保其始终处于低温环境中。

③打开冷冻离心机设置温度，使离心机温度降至4℃。

待温度降至4℃后将EP管放入其中，在4℃，12000转每分钟的条件下离心10min，直至上清液澄清，否则再次离心，这样得到的上清液即为粗酶液。

离心后将上清液用移液枪吸取转移至新的1.5mLEP管中，做好标记后置于冰盒中。

用移液枪吸取上清液时不要将EP管底部的沉淀物吸出。

④使用分光光度计测量前，先将分光光度计所在的房间提前开好空调，设置温度为25℃，使室内温度保持在25℃左右。

同时打开分光光度计，使仪器预热30min。

⑤测定OD值之前分光光度计的调试：

将其程序设置成波长340nm，扫描方法为时间扫描，光源为氘灯一侧，钨灯关闭。

⑥调试后分光光度计的调零：

将2个比色皿先用Tris-HCl（pH7.8）缓冲液进行润洗，然后在这两个比色皿中加入50µ

L粗酶液和800µ

LTris-HCl（pH7.8），混匀后将它们放入分光光度计中，点击“调零”。

⑦开始测量OD值：

将第二个比色皿取出，用Tris-HCl（pH7.8）清洗3次，加入800µ

LICDH反应液，再加入50µ

L酶液。

迅速混合，立即放入分光光度计，合上顶盖后立即在波长340nm的条件下开始测量OD值，测量的时间为3分钟，观察3分钟内OD值的变化。

每次换酶液均要用Tris-HCl（pH7.8）缓冲液润洗3次，以确保下次的测量准确。

每次测量后记录数据并处理数据。

在3min内有选择地记录相隔60s的两个读数，并计算在1min内吸光度值的变化△Α340。

ICDH的活性（Unit/mgFreshweight）=△A340*1000*2.733119/Freshweight

△Α340：

在波长为340nm条件下测得的1min内吸光度的变化值

2.实验结果与分析：

2.1经不同处理的绿豆幼苗其不同部位的生长状况差异：

2.1.1经不同处理的绿豆幼苗其胚根的生长状况

表1经不同处理的绿豆幼苗的胚根的生长状况

处理方式

第4天对照

第4天

AT（30μM/L）

第7天

对照

长度/cm

4.8568±

0.3257

2.3003±

0.2388

8.5005±

0.6558

2.1375±

0.1830

质量/（g/个）

0.0522±

0.0034

0.0284±

0.0025

0.0988±

0.0030

0.0280±

0.0015

质量/长度

0.0107

0.0124

0.0116

0.0131

由表1及在培养过程中的观察可以看出：

对照组的绿豆种子在由第4天培养至第7天时，胚根的长度增加了，质量也增加了，其质量与长度的比值几乎没有变化，其主要进行了纵向生长；

而用AT处理的绿豆种子在由第4天培养至第7天时，胚根的长度、质量以及质量与长度的比值几乎都没有变化，其几乎没有生长。

在绿豆种子培养了4天时，AT处理的胚根与对照组相比，长度变短了，质量下降了；

在培养了7天时，AT处理的胚根长度、质量也都下降了，且与第4天相比，长度与质量的变化相差更大。

说明AT处理抑制了胚根的生长，且随着培养之间的延长，抑制现象越明显。

2.1.2经不同处理的绿豆幼苗其下胚轴的生长状况

表2经不同处理的绿豆幼苗的下胚轴的生长状况

3.6979±

0.2343

1.1878±

0.0914

6.4651±

0.1868

1.0875±

0.0925

0.1188±

0.0088

0.0472±

0.0037

0.1823±

0.0098

0.0500±

0.0026

0.0320

0.0398

0.0282

0.0460

由表2及在培养过程中的观察可以看出：

对照组的绿豆种子在由第4天培养至第7天时，下胚轴的长度增加了，质量也增加了，而其质量与长度的比值稍有下降，其主要进行了纵向生长；

而用AT处理的绿豆种子在由第4天培养至第7天时，下胚轴的长度、质量几乎没有变化，而质量与长度的比值稍有增加。

在绿豆种子培养了4天时，AT处理的下胚轴与对照组相比，长度变短了，质量下降了；

在培养了7天时，AT处理的下胚轴长度、质量也都下降了，且与第4天相比，长度与质量的变化相差更大。

说明AT处理抑制了下胚轴的生长，且随着培养之间的延长，抑制现象越明显。

2.1.3经不同处理的绿豆幼苗其子叶的生长状况

表3经不同处理的绿豆幼苗的子叶的生长状况

0.1146±

0.0097

0.1659±

0.0056

0.0644±

0.1574±

0.0033

由表3及在培养过程中的观察可以看出：

对照组的绿豆种子在由第4天培养至第7天时，子叶的质量下降了，子叶逐渐萎缩；

而用AT处理的绿豆种子在由第4天培养至第7天时，子叶的质量几乎没有变化。

在绿豆种子培养了4天时，AT处理的子叶与对照组相比，质量增加了；

在培养了7天时，AT处理的子叶质量增加了，且与第4天相比，质量的变化相差更大。

说明说明正常生长下，随着生长时间的延长，子叶逐渐萎缩脱落，而AT处理延缓了子叶的萎缩脱落。

2.2绿豆幼苗的胚根，下胚轴及子叶中ICDH的活性

2.2.1经不同处理的绿豆幼苗胚根ICDH的活性

图1不同处理的绿豆幼苗胚根ICDH活性

由图1可以看出，对照组绿豆幼苗由第4天培养至第7天时，胚根中ICDH的活性明显下降，经AT处理的绿豆幼苗由第4天培养至第7天时，胚根中ICDH的活性有增长了，但不明显。

在培养了4天的时候，对照组的绿豆胚根ICDH的活性明显低于经AT处理的胚根ICDH的活性；

在培养了7天的时候，对照组的绿豆胚根的ICDH活性显著低于经AT处理的胚根ICDH的活性，且两者之间酶活性的差异较第4天时更大。

因此得出经AT处理的绿豆的胚根中ICDH的活性高，且随着培养时间的加长，越表现出AT促进了胚根中ICDH的活性。

2.2.2经不同处理的绿豆幼苗下胚轴ICDH的活性

图2不同处理的绿豆幼苗下胚轴ICDH活性

由图2可以看出，对照组的绿豆由第4天培养至第7天时，下胚轴中ICDH的活性增长很不明显，几乎没有变化；

而经AT处理的绿豆由第4天到第7天时，下胚轴中ICDH的活性明显增加。

同时，还可以看出：

绿豆幼苗培养至第4天时，对照组下胚轴中ICDH的活性与经AT处理的绿豆下胚轴中ICDH的活性已经出现显著的差异，对照组下胚轴中ICDH的活性较AT处理的低；

绿豆幼苗培养至第7天时，对照组下胚轴中ICDH的活性也显著低于AT处理下胚轴的酶活性，且两者之间的差异更大。

由此可以得出，在绿豆正常生长过程中，随着时间的延长，ICDH的活性几乎没有变化；

而经AT处理后，绿豆下胚轴中ICDH的活性显著增长，且随着时间的延长，ICDH的活性越高。

2.2.3经不同处理的绿豆幼苗子叶ICDH的活性

图3不同处理的绿豆幼苗子叶ICDH活性

由图3可以看出，对照组的绿豆由第4天培养至第7天时，其子叶中ICDH的活性明显下降；

经AT处理的绿豆由第4天培养至第7天时，其子叶中ICDH的活性稍有下降，但变化不明显。

在绿豆幼苗培养了4天时，经AT处理的子叶中ICDH的活性较对照组的子叶中ICDH的活性高；

在培养了7天的绿豆幼苗中，经AT处理的其子叶中ICDH的活性显著高于对照组。

由此可以看出：

绿豆在正常生长状况下，随时间的延长，子叶中ICDH的活性下降；

经AT处理后，其子叶中ICDH的活性升高。

3.讨论：

ROS是需氧生物细胞正常有氧代谢的产物。

H2O2作为一种活性氧，越来越多的研究表明其在植物的生长发育过程中扮演着非常重要的作用。

H2O2含量的多少对植物体不同器官、不同生长发育阶段作用不同。

高浓度的H2O2可以促进种子的萌发，但是过高浓度的H2O2又可以抑制绿豆的生长，所以要清除多余的H2O2。

在生物体内存在抗氧化系统可以清除活性氧。

AT是CAT的专一性抑制剂，在前人研究的基础上，本实验选用30µ

M/L的AT调节绿豆胚根、下胚轴和子叶中H2O2的含量，通过测定胚根，下胚轴和子叶内与H2O2代谢有关的ICDH的活性，探究AT对绿豆胚根，下胚轴和子叶的影响与ICDH活性变化之间的关系。

对照组的绿豆胚根在由第4天培养至第7天时，其长度与质量都增加了，主要进行了纵向生长，而ICDH的活性却下降了。

由前人的研究已经知道，ICDH生成的NADPH具有抗氧化作用，可以参与抗氧化系统谷胱甘肽氧化还原循环清除H2O2，ICDH活性下降说明H2O2含量下降了，氧化胁迫水平下降了。

用AT处理的绿豆胚根，在培养4天时与其对照组相比其最显著的差异就是胚根的长度变短，质量下降，ICDH的活性升高；

在培养7天时与其对照组相比，胚根的长度，质量及ICDH的活性也发生了同样的变化，但是差异较第4天时更大，同时，AT处理的绿豆胚根培养7天时，抑制了侧根的生长。

这说明AT对绿豆胚根的生长起抑制作用，AT是CAT的专一抑制剂，而CAT则是促进H2O2的分解。

用AT处理绿豆胚根，抑制了胚根中的CAT的活性，不能分解H2O2，使得H2O2在胚根中大量积累。

而过高浓度的H2O2对胚根造成损伤，抑制了胚根的生长，因此胚根的长度与质量都明显低于对照组。

而用AT处理后，胚根中ICDH的活性与对照组的相比，活性都有升高，则是因为AT使得H2O2大量积累，胚根内氧化