补体实验报告Word文档下载推荐.docx
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二、试验方法
补体结合试验的改良方法较多,较常用的有全量法(3ml)、半量法(1.5ml)、小量法(0.6ml)和微量法(塑板法)等。
目前以后两种方法应用较为广泛,因为可以节省抗原,血清标本用量较少,特异性也
较好。
以下叙述以小量法为例,即抗原、抗体、溶血素、羊红细胞各加0.1ml,补体加0.2ml,总量为0.6ml。
(一)试剂
1.抗原试验中用于检测抗体的抗原应适当提纯,纯度愈高,特异性愈强。
如使用粗制抗原时,须经同样处理的正常组织作抗原对照,以识别待检血清中可能存在的、对正常组织成分的非特异性反应。
2.抗原和抗本的滴定补体结合试验中,抗原与抗体按一定比例结合,因而应通过试验选择适宜的浓度比例。
多采用方阵法进行滴定,选择抗原与抗体两者都呈强阳性反应(100%不溶血)的最高稀释度作为抗原和抗体的效价(单价)。
滴定方法举例如表14-4。
在试管中加入不同稀释度的抗原,配加不同稀释度的抗血清,另作不加抗原的抗体对照管和不加抗血清的抗原对照管。
按照试验方法加补体和指示系统,温育后观察结果。
在表14-4中可见1:
64抗原和1:
32抗体各作为1个单位。
在正式试验中,抗原一般采用2~4个单位(1:
64~1:
32),抗体采用4个单位(1:
8)。
表14-4抗原和抗体的方阵滴定
抗原1:
41:
81:
161:
321:
641:
1281:
2561:
512抗体对照
抗血清稀释倍数1:
4444444300
1:
8444442100
16444441000
324444④0000
64443320000
1284321±
0000
256322±
00000
51221±
000000
抗原对照00000000
注:
1、2、3、4分别表
示溶血反应强度+、++、+++、++++;
0为不溶血。
3.补体滴定按表14-5逐步加入各试剂,温育后观察最少量补体能产生完全溶血者,确定为1个实用单位,正式试验中使用2个实用单位。
如形14-5中的结果为1:
60的补体0.12ml可产生完全溶血,
按比例公式0.12×
2:
60=0.2:
x计算,x=50;
即实际应用中的2个补体实用单位应为1:
50稀释的补体0.2ml。
表14-5补体的滴定
管号
60补体(ml)缓冲液(ml)稀释抗原(ml)
致敏srbc(ml)
123456
0.040.060.080.100.120.14
0.260.240.220.200.180.16
0.10.10.10.10.10.1
浴30min37℃水置放
0.20.20.20.20.20.2
不溶血不溶血微溶血微溶血全溶血全溶血
结果
(二)血清标本
采集血液标本后及时分离血清,及时检验或将血清保存于-20℃。
血清在试验前应先加热56℃30min(或60℃3min)以破坏补体和除去一些非特异因素。
血清标本遇有抗补本现象时可做下列处理之一:
①加热提高12;
②-20℃冻融后离心去沉淀;
③以3mmol/l盐酸处理;
④加入少量补体后再加热灭活;
⑤以白陶土处理;
⑥通入co2;
⑦以小白鼠肝粉处理;
⑧用含10%新鲜鸡蛋清的生理盐水稀释补体。
(三)正式试验
以小量法测定抗体的补体结合试验为例。
按表14-6逐步加入各种试剂,温育后先观察各类对照管,应与预期的结果吻合。
阴性、阳性对照管中应分别为明确的溶血与不溶血;
抗体或抗原对照管、待检血清对照管、阳性和阴性对照的对照管都应完全溶血。
绵羊红细胞对照管不应出现自发性溶血。
补体对照管应呈现2u为全溶,1u为全溶略带有少许红细胞,0.5u应不溶。
如0.5u补体对照出现全溶表明补体用量过多;
如2u对照管不出现溶血,说明补体用量不够,对结果都有影响,应重复进行试验。
补体结合试验结果,受检血清不溶血为阳性,溶血为阴性。
表14-6测定抗体的补体结合试验操作程序
反应物(ml)待检血清管
测定
稀释血清抗原缓冲液2u补体1u补体0.5u补体致敏红细胞
混匀,置37℃30min后观察结果
0.10.1-0.2--0.2
对照0.1-0.10.2--0.2
阳性对照管测定0.10.1-0.2--0.2
阴性对照管测定0.10.1-0.2--0.2
抗原对补体对照管照管-0.10.10.2--0.2
2u-0.10.10.2--0.2
1u-0.10.1-0.2-0.2
0.5u-0.10.1--0.20.2
--0.4---0.2
红细胞对照管
混匀,置37℃1h或4℃16~18h
三、应用和评价
补体结合试验是一种传统的免疫学技术,能够沿用至今说明它本身有一定的优点:
①灵敏度高。
补体活化过程有放大作用,比沉淀反应和凝集反应的灵敏度高得多,能测定0.05μg/ml的抗体,可与间接凝集法的灵敏度相当。
②特异性强。
各种反应成分事先都经过滴定,选择了最佳比例,出现交叉反应的机率较小,尤其用小量法或微量法时。
③应用面广,可用于检测多种类型的抗原或抗体。
④易于普及,试验结果显而易见;
试验条件要求低,不需要特殊仪器或只用光电比色计即可。
补体结合试验可应用在以下几方面:
①传染病诊断。
病原性抗原及相应抗体的检测。
②其他抗原的检测。
例如肿瘤相关抗原、血迹中的蛋白质鉴定、hla分型等。
③自身抗体检测。
但是补体结合试验参与反应的成分多,影响因素复杂,操作步骤繁锁并且要求十分严格,稍有疏忽便会得出不正确的结果,所以在多种测定中已被其他更易被接受的方法所取代。
但对于免疫学技术的基本训练仍是一个很好的试验。
篇二:
医学免疫学CDC实验报告
CDC实验
一.实验原理
细胞表面抗原与相应的抗体(IgG1~3或IgM)特异性结合形成的免疫复合物,可通过经典途径激活补体形成攻膜复合体而导致细胞膜穿孔。
因此,水溶性染料如台盼蓝可进入受损细胞,染成蓝色,为阳性反应;
不带抗原的细胞,未损伤,不染色,为阴性反应。
二.实验步骤1.胸腺细胞悬液制备颈椎脱臼法处死小鼠↓
暴露胸腔,分离出胸腺↓
镊子夹住胸腺反复轻轻研磨↓单个细胞
PBS洗2次,1000rpm,10min↓
加入5%小牛血清PBS制备细胞悬液调节细胞浓度至3-4×
107/ml
三.结果判断
①细胞膜穿孔的细胞呈蓝色,细胞膜完整的活细胞不着色。
②细胞毒性作用的判断标准如下:
阴性反应(-)死细胞占0-10%可疑阳性反应(±
)死细胞占11-20%弱阳性反应(+)死细胞占21-50%阳性反应(++)死细胞占51-80%强阳性反应(+++)死细胞占81-100%
四.结果记录
1.表格记录
2.照片展示
五.讨论
①.第①组成阳性的原因:
实验中加入抗原、抗体、补体、LC。
抗原抗体能形成抗原抗体免疫复合物,通过经典途径激活补体,形成攻膜复合物,从而导致细胞膜穿孔,细胞受损,台盼蓝进入细胞,染成蓝色,呈阳性反应。
说明CDC实验必须要有抗原、抗体、补体共同参与。
②.第②组成阴性的原因:
实验中加入抗体、LC。
因为无抗原和补体,不能形成抗原抗体免疫复合物,也无补体,因此不能形成攻膜复合物,不能使细胞膜穿孔,细胞无损伤,台盼蓝无法进入细胞,不能被染成蓝色,呈阴性反应。
说明CDC实验必须要有补体的参与。
③.第③组呈阴性的原因:
试验中加入LC和补体,因为无抗原抗体,所以没有抗原抗体免疫复合物的形成,补体不能被激活,不能形成攻膜复合物,细胞无受损,台盼蓝不能进入而不被染色,呈阴性反应。
说明CDC实验必须要有抗原、抗体的参与。
④.第④组呈阴性的原因:
实验中只加入LC,既无抗原抗体免疫复合物的形成,也无补体,细胞无受损,台盼蓝不能进入而不被染色,呈阴性反应。
说明CDC实验必须要有抗原、抗体、补体的共同参与。
篇三:
实验三补体溶血实验
实验三补体溶血实验
一、实验目的:
了解溶血反应的原理,掌握溶血反应的基本操作方法
二、实验原理:
将绵羊红细胞做抗原注射家兔体内,经一定潜伏期,家兔血清中即出现特异
性抗体,此种抗体称溶血素,它可以与绵羊红细胞结合,此时若加入补体,即可激活补体的
经典途径,则呈现溶血现象。
三、实验材料
1、溶血素(1:
1000)、补体(1:
30)、绵羊红细胞(1%)、生理盐水
2、试管、吸管、试管架等
四、实验方法
1、按下表将试管4支排成一排,
2、震荡混匀,37℃水浴30分钟。
五、实验结果
实验管因发生溶血而变红色透明,其余管为红细胞悬液。
六、注意事项
1、取样品的吸管不可混用;
加样力求准确;
2、SRBC吹匀后再加;
3、补体稳定性差:
T、pH、连续吹打等都使活性下降,所以置于冰浴中,用时再取;
加入补体后轻轻吹打。