整理WesternBlottingProtocol中山大学参考文档格式.docx

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电转孔板黑色面铺放海绵一张，依次铺放滤纸两张，胶一块，PVDF膜一张，滤纸再两张，海绵再一张，然后小心扣好孔板，将其黑色面对黑色面扣入电转架，将电转架放入电泳槽。

电泳槽内置小冰盒一个，整个电泳槽置于大冰盒中。

4）接好电源，按蛋白分子量大小调整电压。

一般小分子量适合低电压，大分子量适合高电压。

5.封闭：

1）电转完毕后取出PVDF膜，置于5%的脱脂奶溶液中封闭。

一小时或者4℃过夜。

2）一抗反应：

将抗体以10ml5%脱脂奶适合稀释，将PVDF膜浸入其中，置于脱色摇床上促进反应1小时。

表达丰度低的蛋白可适当加长时间，比如4℃冷库过夜。

6.回收抗体。

7.TBST液摇洗膜，15分钟х3次

8.二抗反应：

相应二抗以1：

2000比例稀释至10ml。

PVDF膜置于其中要洗40—50分钟。

9.TBST液洗膜，15分钟х3次

10.暗房发光洗片。

所需物品：

滤纸，保鲜膜，压片盒，X光片，小镊子，1000ul移液器，枪头，配制发光液，solutionⅠ：

solutionⅡ=1:

1，一张膜需要2ml。

1）用纸吸干PVDF膜水分，在保鲜膜上浸泡于发光液1分钟，期间用镊子翻转几次促进均匀反应。

用纸吸干PVDF膜上剩余的发光液，裹于干净的保鲜膜里，只需一层。

2）PVDF膜平铺于压片盒，关灯，取X光片1~~2张铺与其上，扣紧压片盒。

根据需要定制曝光时间。

一般第一张1~5分钟。

将剩余X光片密封避光保存妥善。

3）取出压片盒中X光片投入自动洗片机中冲洗。

WesternBloting相关试剂：

Acrylamide/Bisacrylamide

30%（w/v）acrylamide（丙烯酰胺）（Bio-Rad161--0101）

0.8%（w/v）methelenebisacrylamide（N-N’亚甲基双丙烯酰胺）（Gibco155-16-024）

丙烯酰胺（Acr）29g

亚甲基双丙烯酰胺（Bic）1g

超纯水至100ml

37℃下溶解后，4℃brownbottle保存，使用时恢复至室温且无沉淀。

4хLowerTris500ml

Trisbase（1.5M,m.w.121.1）90.83g

10%SDS20ml

超纯水至500ml

PHto8.8（aboutHCL12ml）

4хUpperTris,200ml

Trisbase（0.5M）12.12g

10%SDS8ml

超纯水至200ml

PHto6.8（aboutHCL8ml）

10%AmmoniumPersulfate（过硫酰胺，APS，10%，W/V）（Bio-Rad161-0800）

总量10ml

AmmoniumPersulfate1g

DH20to10ml

溶解后，分装后-20℃保存，每次用一支（200ul），保存时间为一周。

Temed:

2хSampleBuffer,50ml

Glycerol10ml

20%SDS15ml

4хUpperTris12.5ml

H2Oto50ml

1хSampleBuffer

1.5ml2ml3ml4ml5ml10ml20ml50ml

H2O（ml）0.6750.91.351.82.254.5922.5

2хS.B.（ml）0.7511.522.551025

BME（ul）7510015020025050010002500

10хRunningBuffer

4L2L1L

Glycine（sigmaG7526）576g288g144g

Trisbase（GIBCOBRL15504-038）120g60g30g

SDS（GIBCOBRL15525-017）40g20g10g

加dH2O至相应的容量。

1хRunningBuffer

10хRunningBuffer和dH2O按1:

9比例配置，溶解后室温保存；

溶液可置于4℃重复使用3次。

10ХTransferBuffer

Glycine（sigmaG7526）580g290g145g

Trisbase（GIBCOBRL15504-038）116g58g29g

1ХTransferBuffer,2000ml

dH2O1400ml;

20%methanol（甲醇）400ml

1ХTransferBuffer200ml

混匀。

溶解后室温保存；

10ХTBS（PH7.6）

Tris96.8g48.4g24.2g

Nacl320g160g80g

36%HCL50～58ml

1ХTBS-T，2000ml

dH2O1800ml

1ХTBS200ml

吐温-202ml（或20%吐温10ml）（临时加入），混匀。

［1ХTBS缓冲液（可参考）

1mol/LTris·

HCL（PH7.5）10ml

NaCl8g

蒸馏水至1000ml］

10ХPBS

Nacl320g160g80g

KCL8g4g2g

Na2HPO457.6g28.8g14.4g

KH2PO49.6g4.8g2.4g

加dH2O至相应的容量

［0.01mol/LPBS缓冲液（ph7.2-7.4）（可参考）

0.2mol/LNaH2PO419ml

0.2mol/LNa2HPO481ml

蒸馏水至2000ml］

StrippingBuffer

10ml

50ml100ml200ml500ml

1mol/vTrisHCL（PH6.7）（ml）0.625

10%SDS（ml）2

14.4mol/lβ-巯基乙醇0.07

dH2O（ml）*7.305*

3.1256.2512.531.25

102040100

0.350.71.43.5

36.525*73.5*146.1*365.25*

*加dH2O至相应的容量。

β-巯基乙醇在Strip前临时加入。

配置时，在通风厨内进行。

4℃保存，可重复使用1次。

（Stripping步骤：

用StrippingBuffer在50℃洗膜10min,之后于室温下在TBST中洗膜3次，每次10min.封闭后开始加相应抗体）

附：

其他部分试剂配制：

[母液]

1mol/LTris·

HCL

Tris（MW121.14）30.29g

蒸馏水200ml

溶解后，用浓盐酸调PH至所需点（如下所示），最后用蒸馏水定容至250ml，高温灭菌后室温下保存。

PHHCL

7.4约17ml

7.5约16ml

7.6约15ml

8.0约10ml

1.74mg/ml（10mmol/l）PMSF

PMSF0.174g;

异丙醇100ml

溶解后，分装于1.5ml离心管中，—20℃保存。

0.2mol/lNaH2PO4

NaH2PO4（MW119.98）12g

蒸馏水至500ml

溶解后，高压灭菌，室温保存。

0.2mol/lNa2HPO4

Na2HPO4·

12H2O（MW358.14）71.6g

蒸馏水至1000ml

10%SDS

SDS10g

蒸馏水至100ml

50℃水浴下溶解，室温保存。

如在长期保存中出现沉淀，水浴溶化后，仍可使用。

10%过硫酸胺（AP）

过硫酸胺0.1g

超纯水1.0ml

溶解后，4℃保存，保存时间为一周。

Tris·

HCL（PH8.8）

Tris（MW121.14）15.13g

超纯水200ml

溶解后，用浓盐酸调PH至8.8，最后用超纯水定容至250ml,高温灭菌后室温下保存。

0.5mol/lTris·

HCL（PH6.8）

Tris（MW121.14）15.14g

溶解后，用浓盐酸调PH至6.8，最后用超纯水定容至250ml,高温灭菌后室温下保存。

20%Tween20

Tween2020ml

混匀后，4℃保存。

[使用液]

单去污剂裂解液（50mol/lTris·

HCL（PH8.0），150mmol/lNaCL,1%TritonX-100,100ug/lPMSF）:

1mol/lTris·

HCL（PH8.0）2.5ml

NaCL0.438g

TritonX-1000.5ml

蒸馏水至50ml

使用时，加入PMSF至终浓度为100ug/ml（0.87ml裂解液加入1.74mg/mlPMSF50ul）。

G250考马斯亮蓝溶液（测蛋白含量专用）

考马斯亮蓝G250：

100mg

95%乙醇50ml

磷酸：

100ml

配制时，先用乙醇溶解考马斯亮蓝染料，再加入磷酸和水，混匀后，用滤纸过滤，4℃保存

0.15mol/lNaCl

NaCL（MW58.44）0.877g

高温灭菌后，室温保存。

100mg/ml牛血清白蛋白（BSA）

BSA0.1g

0.15mol/lNaCl1ml

溶解后，-20℃保存。

制作蛋白标准曲线时，用0.15mol/lNaCL进行100倍稀释1mg/ml,，-20℃保存

还原型5XSDS上样缓冲液

（0.25mol/lTris•HCL（PH6.8），0.5mmol/l二硫叔糖醇,10%SDS,0.5%溴酚蓝，50%甘油）

0.5mol/lTris•HCL（PH6.8）2.5ml

0.5mmol/l二硫叔糖醇0.39g

SDS0.5g

溴酚蓝0.025

甘油2.5ml

混匀后，分装于1.5ml离心管中，4℃保存

10X丽春红染液

丽春红S2g

三氯乙酸30g

磺基水杨酸30g

使用时将其稀释10倍。

封闭液（含5%脱脂奶粉的TBST缓冲液）

脱脂奶粉2.5g

TBST50ml

溶解后4℃保存。

使用时，恢复室温，用量以盖过膜面即可，一次性使用。

显影液（5X）

自来水（50℃～60℃）700ml（以下药品按顺序加入前者溶解后再加后者）

硫代硫酸钠240g

亚硫酸钠（无水）15g

冰乙酸12.6ml

硼酸7.5g

钾明矾15g（水温冷至30℃以下再加入）

加水定容至1000ml，室温保存。

WesternBlotting配胶

6%SsperationGel7.5%sperationGel

5ml10ml15ml20ml75mol

Acry1（ml）123415

L.T.（ml）1.252.53.75518.75

H2O（ml）2.725.438.1510.8740.75

APS（ul）26.753.380106.7400

Temed（ul）2.55.17.610.138

一、环境影响评价的发展与管理体系、相关法律法规体系和技术导则的应用Acry1（ml）1.252.53.75518.75

一、环境影响评价的发展与管理体系、相关法律法规体系和技术导则的应用H2O（ml）2.474.937.49.8737

Temed（ul）2.55.17.610.1338

9%SsperationGel10.5%sperationGel

综合性规划

（1）土地利用的有关规划；

（2）区域、流域、海域的建设、开发利用规划。

环境影响篇章或说明5ml10ml15ml20ml75mol

Acry1（ml）1.534.5622.5

2.环境保护行政法规L.T.（ml）1.252.53.75518.75

H2O（ml）2.724.46.68.833

『正确答案』AAcry1（ml）1.753.505.257.0026.25

建设项目环境影响评价技术服务机构（以下简称“环评机构”）应当按照《建设项目环境影响评价资质管理办法》的规定申请建设项目环境影响评价资质（以下简称“环评资质”），经国家环境保护部审查合格，取得《建设项目环境影响评价资质证书》后，方可在环评证书规定的资质等级和评价和范围内从事环境影响评价技术服务。

1.环境影响评价依据的环境标准体系H2O（ml）246830

2）购买环境替代品。

环境影响评价，是指对规划和建设项目实施后可能造成的环境影响进行分析、预测和评估，提出预防或者减轻不良环境影响的对策和措施，进行跟踪监测的方法和制度。

12%SsperationGel13.5%sperationGel

Acry1（ml）246830

H2O（ml）1.733.745.206.9326.00

Acry1（ml）2.254.56.75933.75

H2O（ml）1.472.934.45.8722

15%SsperationGelStackingGel

2ml4ml5ml8ml30ml

Acry1（ml）2.557.51037.5

H2O（ml）1.232.455.206.9326.00

Acry1（ml）0.220.440.660.883.3

U.T.（ml）0.511.527.5

H2O（ml）1.282.563.845.1219.2

APS（ul）20406080300

Temed（ul）510152075

StackingGel

2ml4ml15ml8ml30ml

Acry1（ml）0.220.440.660.883.3

L.T.（ml）0.511.527.5