《园艺植物离体培养》复习思考题答案Word文档下载推荐.docx

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器皿一般可以用酒精灯火焰灼烧等高温灭菌；

而培养基则通常采用高压灭菌锅121℃灭菌18—25分钟。

植物材料用升汞灭菌。

13.玻璃化现象

试管苗生长异常，叶、嫩梢呈透明或半透明的水浸状，整株矮小肿胀，失绿，叶片皱缩成纵向卷曲，脆弱易碎。

14.植物生长调节物质

对植物外植体愈伤组织的诱导和根、芽等器官分化，起着重要的调节作用。

包括生长素类（IAA、NAA、2，4-D等）、细胞分裂素类（ZT、KT、BA等）、以及赤霉素、脱落酸等。

15.无菌操作

在超净工作台中，切割植物材料、接种外植体等，尽可能避免细菌、真菌的污染的操作过程。

16.脱分化

一个已停止分裂的成熟细胞转变为分生状态，并形成未分化的愈伤组织的现象称为"

脱分化"

。

17.母液

便于实验操作，从而配置的高于工作液浓度若干倍的贮液。

例如，MS培养基的母液：

可以配浓度是实际培养基中浓度的50-100倍的6种母液。

另外BA和NAA等激素也可以配成激素母液。

18.再分化：

原分化状态的细胞去分化培养后再次的分化。

19.植板率：

植板率（%）=每平板新形成的细胞团数/梅平板接种细胞数×

100

20.超低温保存：

指低于-80℃的低温，主要是在液氮（-196℃）条件下保存植物材料。

21、低温保存法：

0-5℃左右低温下组织培养，以低温限制生长从而保存培养材料的方法。

低温保存又称最小生长法。

是20世纪70年代发展起来的技术。

是将外植体所再生的试管苗在低温条件下，结合某些特定的培养基，例如增加蔗糖浓度、添加甘露醇、山梨醇、脱落酸（ABA）等生长延缓因子，辅以培养环境的控制，从而抑制或者延缓生长，延长寿命，达到保存种质的目的。

保存物处于缓慢生长或者无生长的状态下，需要时可迅速恢复生长。

22、悬浮细胞培养：

是指把离体的植物细胞悬浮在液体培养基中进行无菌培养的技术，它是从愈伤组织的液体培养技术基础上发展起来的一种新的培养技术，此项技术目前已发展到全自动控制的大容积发酵罐大规模工业生产的连续培养。

23、单细胞培养：

是指从植物器官或愈伤组织游离出的单个细胞的无菌培养。

24、培养基：

是供微生物、植物和动物组织生长和维持用的人工配制的养料，一般都含有碳水化合物、含氮物质、无机盐（包括微量元素）以及维生素和水等。

25、子房培养：

即指离体条件下子房的无菌培养技术，子房既可是已授粉的，也可是未授粉的

二填空题（每空1分）

1．培养基一般采用湿热灭菌。

2．连续培养有开放式连续培养和封闭式连续培养两种方式。

3．试管受精可以利用子房培养和胚珠培养。

4．培养皿消毒常用干热法。

5．单细胞的培养方法主要有看护培养法、微室培养法、平板培养法。

6．原生质体是指除去细胞壁后的裸露细胞。

7．茎尖培养的意义有脱毒、快繁、形态建成研究、和育种应用中的研究四个方面。

8．原生质体融合的主要方法有化学融合法；

物理融合法。

9．培养室的光照因子有光照强度、光照时间、光质三个方面。

10．消毒剂HgCl2常用的浓度是0.1-0.2%。

11.离体培养中最常用的生长素是__NAA______。

12.离体培养中最易诱导愈伤组织的生长素是__2，4—D______。

13.形态发生的途径有__器官__发生和___胚胎___发生两条主要途径。

14.母液的配制可减少____称量的误差____，也可减少__工作量______。

15.二倍体植株花粉培养可以获得____单____倍体植株，胚乳培养可以获得___三_____倍体植株。

16.__Haberlandt______创造性地提出了细胞全能性观点。

17.胚状体必须具备___两_____极性，不定芽具备___单_____极性。

18.培养室的温度一般控制在___25_____℃左右。

19．生根时要求无机离子浓度较___低_____。

20．子房培养的主要目的是__试管授精______。

21．二倍体子叶离体培养产生的植株是___2_____倍体。

22．用于单倍体人工加倍的常用药剂是___秋水仙素_____。

23.植物种质资源离体保存的主要方式有__超低温___保存和___低温__保存。

24.由二倍体胚乳培养可以获得____三___倍体植株，经秋水仙素处理可以获得___六____倍体植株。

25.不同的灭菌剂其灭菌的机理一般不一样，次氯酸钙和次氯酸钠都是利用分解产生__氯气____来杀菌的；

升汞是靠__重金属_Hg_离子______来达到灭菌目的。

26.在组织培养中，不耐热的物质用__过滤灭菌___法灭菌，而培养基常用__湿热灭菌_法灭菌。

27.6-BA/NAA的高低决定了外植体的发育方向，比值____低______促进根的生长，这时_生长素NAA__占主导地位；

比值___高_____促进芽的生长，这时___细胞分裂素BA__占主导地位。

28.花药培养是__器官___培养，花粉培养属于__细胞__培养，但二者的培养目的一样，都是要诱导花粉细胞发育成单倍体细胞，最后发育成__纯合二倍体__。

29.一个已停止分裂的成熟细胞转变为分生状态，并形成未分化的愈伤组织的现象称为"

__脱分化_"

30.愈伤组织的形态发生有___致密_____和___疏松_____两种情况。

31.原生质体的分离有___机械法_____和____酶解法___两种方法。

32.植物组织培养过程中，最常用的培养基是MS、，培养基的pH因外植体的来源不同而异，常用HCL和NaOH调节pH，大多数植物的pH要求调节在5.6～6.0范围内。

、

33.可以通过适宜外植体、最佳的培养基、连续转接、加抗氧化剂、加活性炭等措施预防褐变的发生。

34.植物组织培养时，外植体可以是器官、组织、细胞、去掉细胞壁的原生质体

35.茎尖微繁殖过程一般包括五个阶段，即无菌砧木、茎尖准备、嫁接、嫁接苗培养、移植

36.组织培养植株的再生途径有两条：

一是器官发生，另一是、胚胎发生。

37.在配制培养基时，可以在培养基中添加活性炭，利用其吸附能力，可以降低褐变的发生，但它对物质的吸附、无选择性。

38.培养基的高压灭菌温度为121℃

39.组织培养中常用的生长素有吲哆乙酸（IAA），2，4-二氯苯氧乙酸（2，4-D），吲哆丁酸（IBA），萘乙酸（NAA），它们的作用强弱顺序为2，4-D、NAA、IBA、IAA

40.无菌外植体的建立、芽的增殖、中间繁殖体的增殖、诱导生根、试管苗的移栽。

41、茎尖分生组织培养的目的主要是脱毒，其茎尖一般取0.1毫米。

为了使脱毒效果更好，可以将茎尖分生组织培养与热处理结合起来。

脱毒处理的试管苗，在用于生产之前，必须进行病毒检。

.、、定

42.细菌、真菌

三．判断题（每题1分）

1．纤维素酶可以用高压灭菌。

（×

）

2．通过愈伤组织形成的植株不易产生变异。

3．2，4-D一般容易诱导愈伤组织的产生。

（√）

4．生根培养基中必须加入较高浓度的细胞分裂素。

5．由于细胞具有全能性，很老的组织也能容易再生植株。

6．原生质体融合也叫体细胞杂交。

7．变异体就是突变体。

8．核内有丝分裂是组织培养中染色体加倍的重要原因之一。

9．接种室常用的消毒剂是0.2%的HgCl2。

10．培养室的温度常控制在25℃左右。

11．茎尖培养可以达到脱毒的目的。

12．脱毒苗不等于抗病毒苗。

13．DMSO是较常用的冷冻保护剂。

14．酶的灭菌多采用过滤灭菌。

15．人参皂苷可以通过大规模的细胞培养产生。

16．离体培养和组织培养是相同的意思。

17．茎段培养也是细胞培养。

18．器官培养主要是用于离体受精。

19．经HgCl2消毒后的材料要冲洗1～2次。

20．根部细胞不具备细胞全能性。

21．光质对组织培养没有什么影响。

22．为了诱导根的发生在培养基中主要应加BA。

23．所有的细胞分裂素都是天然存在的。

24．愈伤组织没有明显的结构。

25．所有的离体培养再生植株都是必须经过愈伤组织途径。

26．超净工作台在工作情况下台内100%无菌。

27．培养室的温度控制主要靠光照的强弱。

28．灭菌室一般应有干热灭菌和湿热灭菌两种方式。

29．在接种时镊子和解剖刀一般应准备两套。

30．材料灭菌时可用70%乙醇浸泡5分钟。

31．环境的相对湿度可以影响培养基的水分蒸发，一般要求80％-90％的相对湿度。

×

32．幼年细胞和组织比成年细胞和组织诱导愈伤组织容易。

√

33．一般的说，PH值高于6.5时，培养基会完成凝固。

34．在配制6-BA母液时，要先加少量的1mol/L的HCl溶解，再加蒸馏水定容。

35．未成熟胚较小，易培养；

成熟胚较大，不易培养。

36．MS培养基无机盐浓度低，适合生根培养。

37．由性细胞发育而成的胚叫做胚状体，而由体细胞发育而成的胚叫做合子胚。

38．2，4-D可用0．1mol／L的NaOH或KOH助溶，而后加无菌水定容。

39．经过花药培养所获得的植株都是单倍体。

40．二倍体细胞比单倍体细胞容易诱导愈伤组织。

41．一般将微量元素母液均配制成10倍，在配制培养基时，使用量为10ml/L。

42．细胞分裂素/生长素的比值较高时，有利于愈伤组织的诱导。

43．对于金边虎尾兰等遗传学上的嵌合体植物，要是组织培养繁殖的植株保持原有的园艺价值，只能通过叶培养。

44．植物生长调节物质使用不当时，材料也容易褐变，生长素有刺激多酚氧化酶活性提高的作用。

45．利用茎尖分生组织进行脱毒培养时，茎尖外植体大小与脱毒效果成正比。

46．某些植物通过愈伤组织培养可以获得无病毒苗。

47．无病毒植株不具有抗病毒的能力，而且在清除病毒之后，体内营养和生理状况发生改变，因而对其他病毒和病原体的侵染更为敏感，因此在种植脱毒苗的一定要隔离种植。

48．微繁不定芽的产生有两个途径，一是不定芽不通过愈伤组织由外植体直接产生，二是外植体诱导产生愈伤组织，由愈伤组织上产生不定芽。

后一途径相对较为优越，因为通过愈伤组织不会出现一些突变。

49．细胞的全能性，可以通过分裂细胞的脱分化和再分化过程得以体现。

50．培养基中的铁盐，常用不易分解的乙二胺四乙酸铁螯合物，以防在pH较高时铁被氧化为不溶的氢氧化铁。

四．问答题（每题10分）

1．简述花药培养的程序。

（10分）

1、材料选取

花药接种前一般需预先用醋酸洋红，I-KI溶液或浮尔根等染液进行压片镜检，以确定花粉的发育时期，并拭出花粉发育时期与花蕾或幼穗大小，颜色等特征之间的相应关系。

一般而言，以单核中、晚期的花药进行培养是目前培养成功的主要时期。

据颜昌敬统计的13种作物，其中有11种作物适宜单核期。

2、预处理

（1）低温预处理

（2）变温处理

（3）离心预处理

（4）乙烯利预处理

3、消毒

花药培养时，材料的表面消毒通常比较方便，因为未开放的花蕾中的花药为花被所包裹，本身处于无菌状态之中。

花蕾或幼穗的表面消毒一般用70%酒精在表面擦拭或浸一下后，在泡和漂白粉上清液中浸10-15分钟，或用0.1%HgCl2消毒7-10min，然后用无菌水冲洗3-5次即可。

在操作熟练的情况下，也有仅用70%酒精将花器表面擦净即取花药的，消毒时间一般不宜过长，否则消毒剂渗入花蕾内，如花药接触药剂，又冲洗不净，会影响培养后的生长。

4、接种

取出花药应在无菌条件下进行，在取花药时，应注意解剖器具尽可能不碰或少碰花药，以免受伤。

接种时花药要直接接触培养基，如果花丝牵着花药，不让它沿着培养基，则花粉就不会生长；

同时，花丝在培养基上的生长会抑制花粉的分裂增殖，接种时速度要快，尽量减少花药在空气中的停留的时间，取出花药后直接投入培养基也很好。

直径3cm的试管，每管接种30-60粒。

5、脱分化培养

接种后放入培养室，温度通常为25-28℃。

脱分化要根据材料不同，选取基本培养基和适当生长素浓度进行培养，经10-30天可诱导愈伤组织形成。

6、再分化培养

愈伤组织增殖到1-3mm大小时，应及时进行再分化培养，以获得花粉植株。

这时要选择适当激素种类和水平的培养基上进行培养，约经20-30天，就能诱导苗的分化。

7、花粉植株移植

当花粉植株的根系生长良好时，就要及时炼苗并移至苗床或大田。

由于这是一个由异养到自养的转变过程，必须细心料理，保持幼苗的水分平衡和促进新根的发生。

8、染色体加倍

当单倍体植株产生后，应在适当的时期通过人工方法进行染色体加倍。

常用的方法是用0.02-0.4%秋水仙素处理。

双子叶植物处理生长点，禾本科植物在分蘖期处理。

2．简述单细胞培养的方法。

在单细胞培养中，常采用的基本培养方法有看护培养，微室培养和平振培养等几种，它们各有特点，可根据条件和需要选择使用。

1.看护培养法

看护培养法是指用一块活跃生长的愈伤组织块来看护单个细胞，使其持续分裂和增殖的培养方法，这个愈伤组织块称为看护愈伤组织。

这个方法最初是由Muir等（1953）设计的，当时是为了由烟草和金盏花细胞悬浮液和易散碎的愈伤组织中取单分裂的离体细胞，在看护愈伤组织的影响下则可能发生分裂。

由此可见，看护愈伤组织不仅给这个细胞提供了培养基中的营养成分，而且还提供了能促进细胞分裂的其他物质。

这种细胞分裂因素可通过滤纸而扩散。

愈伤组织刺激离体细胞分裂的效应，还可通过另一种方式来证实，把两块愈伤组织置于琼脂培养基上，在它们周围接种若干个单细胞，结果可以看到首先发生分裂的都是靠近这两块愈伤组织的细胞。

2.微室培养法

微室培养法是指在无菌小室中培养接有单细胞的液体培养基小滴，使细胞得以生长和增殖成单细胞无性系的无菌培养方法。

它是为进行单细胞活体连续观察而建立的一种微量细胞培养技术。

微室培养的优点是便于在培养过程中连续进行显微观察，可以把一个细胞生长、分裂、形成细胞团的全过程记录下来。

同时它所用的设备，用具比较简单。

缺点主要是培养基数量少，因此水分难以保持，培养基中养分及pH值易于变动，多数细胞经短期休眠后往往即不再生长。

3.平板培养法

平板培养法是把单个细胞与融化的琼脂培养基均匀混合，并平铺一薄层在培养皿底部的培养方法，此法是Bergman在1960年首创的，它是为分离单细胞无性系，研究其生理生化和遗传上的差异而设计的一种单细胞培养技术。

广泛应用于细胞，原生质体及融合产物的培养。

在平板培养的整个过程中，必须注意以下几点：

A、选用的培养基，无论是条件培养基或是合成培养基，主要的一点，是通过在低的细胞起始密度下使细胞生长。

B、不要选取处于静止期的细胞，因为处于分裂旺盛时期的细胞有最高的植板率。

C、在固体培养基中适宜的起始密度因植物种类而不同。

如烟草细胞的适宜密度为0.5-1.0×

104个细胞/ml，若低于此数，植板率显著下降。

D、接种细胞时固体培养基的温度要控制，一般认为不超过35℃，但也有人认为只要不超过40℃即可。

总之，温度低对细胞伤害少，但操作困难，容易引起部分凝固而使细胞分布不均匀。

故要求操作迅速（最好环境温度也在25-30℃）。

E、宜在黑暗或光强很低的条件中培养。

根据一些实验室的经验，在培养期间经常用显微镜在光下观察的反板，与一直在黑暗中增养的平板比较，其细胞群落的形成会受到一些抑制。

此外，为了提高植板率，还可以将一块植物组织与单细胞一起放到培养皿内的平板上，来提高植板率。

具体做法是：

在培养皿放几只玻璃环，环外是一般的平板增养，接种较低起始密度的单细胞。

环内接入一块愈伤组织，让它起看护组织的作用，其代谢产物可以通过琼脂扩散到环外去，从而促进环外单细胞的分裂生长

3．超低温保存有哪几个主要环节？

种质资源超低温保存技术应把握以下一些重要环节：

（一）外植体的选择与处理

1、材料应选择幼龄的组织细胞，因其胞质稠密，抗冻力强。

2、取材以冬天生长的植株为宜，在贮藏前往往对外植体进行预培养和低温处理，以提高组织细胞的抗寒能力。

①预培养一般7-12天，培养基中加入能提高抗寒能力的物质，如山梨糖醇、ABA，或增加糖的浓度等。

②低温处理的做法是将外植体放在2-3℃低温下锻炼数天，处理后可明显提高材料的抗冻能力。

③超低温处理前，还必须进行冷冻保护剂处理，其方法为：

先将保护剂配好预冷至0℃，等体积与培养基混合，静置30-60min。

这是因为DMSO等保护剂有毒，所以必须在0℃下理，而且处理时间不宜过长，一般不超过1h。

（二）降温冷冻

材料经冷冻保护剂处理30-60min后，应立即降温冰冻，最后达到液N温度保存。

从0℃-196℃的降温过程通常有三种方法。

1、快速冰冻法

将材料从0℃（或其他预处理温度）直接放入液N中的冰冻方法。

此法适于那些高度脱水的植物材料，如种子、花粉、球茎或块根等。

一些抗寒木本植物的枝条和冬芽，经过冬季的细胞外结冰充分脱水后，也可采用此法。

此外，不少植物的茎尖组织保存用此法也有成功的报道。

快速冰冻的原理在于：

利用超速冷冻，可使细胞内的水迅速通过了冰晶生长的危险温度区（-10--140℃），使细胞内水分还未来得及形成冰晶中心，就降到-196℃的安全区，此时，细胞内的水为玻璃化状态，该状态对细胞结构不产生破坏作用，从而减轻或避免细胞内结冰的危害。

2、慢速冷冻法

在冷冻保护剂存在下，以0.1-10℃/min下降的速度降温进行冰冻。

在这种降温速度下，可通过细胞外结冰，使细胞内的水减少到最低限度，从而达到良好的脱水效应。

此法需用程序降温仪，技术系统昂贵，但对许多不抗寒的植物保护却能带来成功。

3、两步冰冻法

第一步用慢速降温法降到-30-50℃左右，使细胞达到保护性脱水状态；

第二步投入液N中迅速冷冻

目前实际工作中大多是先采用每分钟降低0.5-4℃的速度降到-40℃，然后投入液N。

烟草、萝卜、长春花、水稻、甘蔗、玉米、大豆、人参等悬浮液细胞或愈伤组织均以此法获得了成功。

（三）化浆（解融）方法

解融是再培养能否成功的关键。

升温对细胞带来的伤害乎与降温伤害同等重要。

升温损伤主要是迁移性再结晶的结果，即降温过程中形成的小冰晶重新增长的结果。

同时，化冻过慢，从-196℃-0℃的升温过程中，细胞内玻璃化水可能会发生次生结冰，从而是破坏细胞结构，导致死亡。

许多实验表明，缓慢升温可能使细胞内冰晶生长，而快速升温则可取得相对较高的存活率。

所以一般的解融方法是采用快速法，即将样品从液N中取出后直接在37℃水浴中化冻。

（四）生活力及存活率的测定

对解融后的材料，必须检测其生活力水平及存活率。

常用方法有三：

1、再培养

即化冻后，将外植体转移到新培养基上培养，观察其是否有生活力，这是最可靠的检查法，但比较费时。

2、FDA法（双醋的荧光素）

用于悬浮培养细胞等单细胞材料，以0.1%FDA染料1滴，与等体积化冻后的细胞悬浮液混合后于荧光显微境下观察记数。

（活细胞由荧光镜下呈黄绿色、荧光）。

3、TTC法

其原理是活细胞内有脱氢酶能还原TTC为红棕色物质，所以活细胞被染色。

（五）冰冻保存的基本操作程序，具体的技术处理和指标可以根据不同材料加以适当修正。

4.植物细胞全能性和在离体培养中的理论与实践意义。

植物细胞全能性是指：

利用植物细胞全能性这一理论，可以进行植物离体培养研究。

广义的讲包括：

植株培养、胚胎培养（Organculture）、器官培养（Organculture）、组织培养（tissueculture）：

、细胞培养（singlecellculture）、原生质体培养（protoplastculture）等。

概括起来，可将植物组织培养的意义分为理论和实践方面：

（一）在基础理论方面

1、这一培养技术具有在自然条件下不能达到的无菌离体，以及能够严格控制环境因素等优点，因此能用于研究植物各种细胞、组织和器官所需要的条件以及生理生化上的特点。

2、在细胞小平上研究诱变、筛选等遗传操作。

3、可以为酶调节机制，细胞发育机制，器官发展胚胎发生的细胞学，遗传机制和生化过程的研究提供极其有用的材料和独特的方法。

4、为优质、高效保存种质资源担保共了良好的条件。

5、研究植物生产物的形成过程以及定性，定量分析等可以完全避免其他因素的干扰。

（二）在实践应用上

1、利用花粉到花药培养获得的单倍体可通过加倍快速获得纯合体。

2、远缘杂交的胚胎培养和试管受精获得远缘杂种植株来创造新的资源。

3、优良品种的快速无性繁殖，亲本材料的快速繁殖等，可以加快新品种的推广和加速新品种的应用。

4、通过分生组织培养获得脱毒菌。

5、某些药物和次生代谢产物的工业化生产。

从以上可以看出组织培养在作的基础和应用的多方面都有重要的意义。

所以，有的科学家指出：

如果一旦成功地建立了一个良好的培养系统，则能获得在恒定条件下进行试验而排除季节以及其他各种生态因子变化的干扰，为取得理想的成果创造了优越的条件。

5．离体培养有哪些类型？

离体培养一般通指利用所有类型的植物无菌培养技术。

由于具体培养材料