人乳头瘤病毒假病毒制备方法的优化以及高通量中和实验检测系统的汇总.docx
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人乳头瘤病毒假病毒制备方法的优化以及高通量中和实验检测系统的汇总
厦门大学
硕士学位论文
人乳头瘤病毒假病毒制备方法的优化以及高通量中和实验检测
系统的建立
姓名:
郑舟
申请学位级别:
硕士
专业:
细胞生物学
指导教师:
张军
20080701
摘要
摘要
人乳头瘤病毒(HPV)能够引起包括宫颈癌在内的多种生殖道疾病,严重危害人类健康。
HPV具有严格的宿主特异性和组织分化依赖性,难以通过常规组织培养方法扩增,也难以从病变组织中分离获得足够的病毒。
因此建立简便、高效的HPV体外感染模型是发展HPV预防疫苗与治疗药物的迫切需要。
近来研究发现HPV假病毒可用于在体外有效模拟HPV的感染,以此基础建立的中和实验方法具有较突出准确、便捷的优点,在HPV预防疫苗、中和抗体研究中显示出巨大的应用潜力。
HPV假病毒中和实验方法的广泛使用需要进一步提高假病毒构建效率,同时能够满足高通量检测的需要。
本实验室已应用磷酸钙多质粒共转染方法在293FT细胞中建立了构建HPV假病毒的方法,本研究以此为基础,进一步对HPV假病毒构建体系进行系统改进和优化,建立了更为高效且适合高通量检测的HPV中和实验方法。
建立简便高效、高通量的假病毒中和实验检测方法对提高实验效率,满足大规模抗体检测的需要具有十分重要的意义。
同时,建立多个型别的HPV假病毒中和实验模型为具有高保护力的多价疫苗的开发提供了全面的中和抗体评价体系。
本研究首先探讨了在HPV假病毒构建体系中优化质粒转染比例以及磷酸钙转染条件对假病毒构建效率的影响。
结果显示,在该体系中不同的HPV结构蛋白表达质粒转染比例对于假病毒构建效率有显著影响,HPV主要结构蛋白Ll的表达水平是影响构建效率的主要因素,L2表达质粒的用量过高或过低均不利于假病毒的构建。
报告质粒的用量对假病毒构建效率的影响相对较小。
综合比较显示,在该体系中Ll和L2表达质粒和报告质粒以合适比例(1:
1/10:
1/2)进行共转染可获得较理想的构建效率。
同时通过优化磷酸钙转染试剂的用量和DNA在磷酸钙溶液中浓度获得了较优的转染条件。
通过优化改进,本研究建立了更为高效的RPV假病毒大量制备方法,在HPVl6、BPVl8、HPV6、HPVll假病毒构建中的应用结果显示相比原方法可显著提高构建效率10~20倍。
为HPV假病毒中和实验的规模化应用提供了有利条件。
为适应高通量检测的需要,本研究通过改进报告基因及检测方法建立了新型的HPV假病毒中和实验体系。
本研究选择半乳糖苷酶作为报告基因,构建了携带
摘要
优化后的半乳糖苷酶表达元件的HPV假病毒,研究结果显示,假病毒感染后的细胞加入显色底物后可呈现显著的蓝色,并且该标记可为酶联免疫图像分析系统(E1ispot)所检测。
酶联免疫图像分析系统可对显色后的96孔细胞培养板进行连续快速的自动扫描并计数,满足了高通量检测的需要。
本研究进一步对显色方法进行优化,提高了检测效率。
通过综合应用优化的半乳糖苷酶报告基因表达元件与酶联免疫图像分析系统,本研究建立新型的可满足高通量检测要求的HPV假病毒中和实验方法。
本研究应用该方法对四型HPV中和单抗的鉴定结果表明,半乳糖苷酶假病毒中和实验方法与目前应用的EGFP假病毒中和实验方法的检测灵敏度相当,同时新方法还具有可自动连续检测、操作简便、结果显示直观的优点,可更好地满足大规模中和抗体检测实验的需要。
本研究应用该方法鉴定获得了2株HPVl6中和单抗,3株HPVl8中和单抗,以及HPV6和HPVIl中和单抗各5株;同时对本中心生产的HPVl6、HPVl8、HPV6和HPVll四价VLP疫苗的抗体保护性进行了评价,为临床实验阶段所需疫苗的合适剂量提供了参考。
HPV58和HPV52是中国较为流行的高危HPV型别,但一直以来研究较少。
建立HPV58和HPV52假病毒中和实验模型对于研究HPV58和HPV52以及预防疫苗的开发具有重要意义。
我们将HPV58和HPV52的衣壳蛋白表达序列进行密码子人源化优化后,克隆到表达载体上,与报告质粒分别共转染293FT获得了感染性的HPV58和HPV52假病毒。
将质粒通过尾静脉高压注射方式免疫小鼠,成功在小鼠体内诱导了高滴度的HPV58和HPV52的中和性抗体。
Westernblotting结果显示这两型假病毒在约55KD处均具有L1蛋白活性。
多抗血清交叉中和实验表明HPV58和HPV52、HPVl6和HPV58之间存在一定水平的抗体交叉保护,而HPVl6和HPV52之间没有可检测的抗体交叉保护性。
关键词:
人乳头瘤病毒;假病毒;中和实验
ABSTRACT
InfectionofHuman
papillomavirus(HPV)is
cancer,which
thecauseofvariousdiseasesof
cancer
genitaltract,includingcervix
isthesecondmostcommon
leadingtodeathinwomen.HPV’Sinfectionhashostspecificity,moreover,completedlifecycleofHPVrelays
on
differentiationofepithelialcells.Absenceofapplicable
cellculturesystemsforinfectiousvirusandlimitedvirusparticlesobtainedfrompatients’tissuesConvenient
restrict
research
on
HPVand
development
in
vitro
of
HPVvaccine.
andefficient
infectionmodelsofHPV
arenecessaryfor
developmentofprophylacticvaccinepeople
use
andtherapeutic
HPV
and
a
agentsofHPVInrecentyears,
construct
pseudovirus
to
imitate
pseudovirus-based
appliedpotentialin
neutralization
assayforHPV,whichdisplays
enormous
detectionofneutralizingantibodys
Cotransfectionconvenienthas
and
with
developmentofprophylacticvaccine.condon-optimized
genes
is
proved
ofplasmids
more
and
higher-yieldinproducingpseudovirion
our
thanothersystems,which
beenconstructedin
lab.Toevaluate
or
theprotectionprovidingbyHPV
prophylacticvaccinetoanimalshuman,agreatdealpseudovirion
and
a
rapid,
simpleandconvenient,high-throughputneutralizationassayisrequired.TosatisfyneedofdevelopmentofmultivalentHPVvaccine,developingpseudovirus-basedneutralizationassayforotherHPVtypesisnecessary.
Inconstructionofpseudovirusbylowering
cotransfectionofplasmids,appropriately
transfected
moleratioofL2expression
plasmidandreporterplasmid
enhancesexpressionofL1,whichispositivecorrelativetoconstructionefficiencyofpseudovirusundercertainconditions.Theoptimized1:
1/10:
1/2ofLl、L2expressionplasmids
transfectedratiomay
bc
and
reporterplasmid.Modifiedtransfected
moleratiosofplasmids、optimalDNAconcentrationincalciumphosphatesolution
andappropriatehigher
volume
in
ofcalciumphosphatesolutioncontributeto
of
a
10-20timesand
HPV11
efficiency
constructionHPV16、HPV18、HPV6
pseudovirion.
To
satisfy
theneedof
high—throughput
our
assay
for
a
neutralizingantibodies,
considerringtheconditionsinbased
on
lab,weconstructed
newneutralizationassay
pseudovidonencapsidating
B・galexpressionplasmid.WeutilizedElispot
Abstract
readertoscan96wellscellcultureplatesanddisplayautomaticcountingresultofcellstransductedbypseudovirioneverywell,whatremarkablyenhanceefficiencyofneutralizationassayforHPV.Themethodofx-galstainningWasimprovedtofurtherenhancetheefficiency.ThenewneutralizationassayforHPVhashi曲specificity,awidedetectionrangeandsimilarsensitivitycomparingtothatofEGFPpseudovirus-basedneutralizationassay,moreover,it’Slow—costinreagentsandeasytooperate.
TheneutralizationefficiencyofHPVI6,HPV18,HPV6
ourandHPVIImonoclonalantibodiesgeneratedinlabwerethenevaluatedbythenewpseudovirus—base
neutralizationassay.AlltheseneutralizingmAbsCanbeusedtothoroughlyelucidatetheneutralizingeptitopesofHPVandevaluatethe
investigateaqualityofHPVvaccines.TosuitabledoseofcandidateVLP—mixedvaccineofHPV16/18/6/11,sixtymicewerevaccinatedwithserialdilutedHPVl6/18/6/llVLPmixandtheED50WasidentifiedtobeHPVl60.0171,tg/mL、HPVl8O.0171上g/mL、HPV60.025lxg/mL、HPVl10.067p.g/mL,whichwillguide
ofmixvaccineinclinicaltriaIstudies.
HPV58andHPV52areUSinthedeterminationofanappropriatedosepopularhigh—riskHPVinChina,popularityofHPV58
issecondtothatofHPV18,butlittlehas
always.ConstructionofHPV58
HPV52beenstudiedaboutthetwotypessinceonandHPV52pseudovirionhelptoresearchHPV58、anddevelopmentofcorrespondingvaccine.Codon-optimizedexpressionplasmidsofcapsidproteinandreporterplasmidarecotransfectedto293FTcells,successfullygeneratinghightiterinfectiouspseudovirionofHPV58andHPV52
blotting.
inducedrespectively.Expressionof58L1and52L1incellsWasdetectedbyWesternImmunizing
neutralizingcodon・optimized58L1andCan52L1expressionplasmidsantibodyinmicewhichneutralizeinfectionofpseudovifion
HPVI6respectively.Wefoundcrossneutralizationphenomenaexists
HPV52betweenandHPV58,HPV58andHPV52,butnotbetweenandHPVl6.
Keywords:
HumanPapillomavirus;Pseudovirus;Neutralizationassay4
Abbreviation(缩略词)
ABBREVIATION(缩略词)
PV:
Papillomavirus,乳头瘤病毒HPV:
HumanPapillomavirus,人乳头瘤病毒
RabbitPapillomavirus,棉尾兔乳头瘤病毒CI冲V:
Cottontail
BPV:
BovinePapillomavirus,牛乳头瘤病毒
Papillomavirus,犬口腔乳头瘤病毒Region,长控制区
Frame。
开放阅读框COPV:
CanineOralLCR:
LongControlORF:
OpenReading
VLP:
VirusLikeParticle,类病毒颗粒
Proteoglycans,硫酸乙酰肝素蛋白聚糖Signal,核定位信号HSPG-HaparanSulfateNLS.-NuclearLocalization
PML-PromonocyticLeukemiaProtein,急性早幼粒白血病蛋白CIN:
CervicalIntraepithelial
E6AP:
E6associatedNeoplasia,宫颈上皮内瘤变protein,E6相关蛋白pRb-RetinoblastomaTumorSuppressorGene,抗癌抑制因子
Kinase,细胞周期蛋白激酶CDK:
Cyclin・dependent
CA:
Condyloma
DC:
DentriticAcuminatum,尖锐湿疣Cell,树突状细胞CTL:
CytotoxicTLymphocyte,杀伤性T淋巴细胞ISCAR:
ImmunostimulatoryCarrier,免疫刺激载体LAMP—l:
Lysosomal-associatedMembraneProteinTypel,溶酶体相关I类膜蛋白AAV:
Adeno.associatedVirus,腺相关病毒MVA:
ModifiedVacciniaVirusAnkara,改造安卡拉痘苗病毒SCID:
SevereCombinedImmunodeficiencyMice,严重联合免疫缺陷小鼠SFV-.SemlikiForest
EGFP:
Virus,塞姆利基森林病毒Protein。
增强型绿色荧光蛋白EnhancedGreenFluorescentSEAP-SecretedAlkalinePhosphatase分泌性碱性磷酸酶IFN:
Interferon,干扰素S
Abbreviationf缩略词)
Kan:
Kanamycin,卡那霉素
Amp.Arnpicillin,氨苄青霉素bp:
basepair,碱基对
pair,千碱基对kb:
kilobase
kD:
kiloDaltons,千道尔顿
mAb-monoclonalantibody,单克隆抗体
Complex,主要组织相容性复合物MHC-Major
MOhHistocompatibleMultiplicityofInfection,感染复数MW:
MolecularWeight,分子量Ori:
Origin,复制起始位点
virus,猿空泡病毒40SV40-Simianvacuolatiny
FBS:
FetalBovineSerum,胎牛血清FCM:
FlowCytometry,流式细胞仪HRP:
Horseradish
RNA:
RibonucleicPeroxidase,辣根过氧化物酶Acid,核糖核酸HLA.HumanLeucocyteAntigen,人类白细胞抗原RLU-Relativelightunits,相对光单位6
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本人呈交的学位论文是本人在导师指导下,独立完成的研究成果。
本人在论文写作中参考其他个人或集体已经发表的研究成果,均在文中以适当方式明确标明,并符合法律规范和《厦门大学研究生学术活动规范(试行)》。
另外,该学位论文为(财卵)课题(组)
)课题(组)经费或实验室的的研究成果,获得(聍霹P
资助,在(复宁四F)实验室完成。
(请在以上括号内填写课题或课题组负责人或实验室名称,未有此项声明内容的,可以不作特别声明。
)
声明人(签名):
襄附加影年7月弓f日
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)
声明人(签名):
嚣硇彬年]月引日
前言
-^J_・—‘一
月Ij吾
1.HPV的生物学
乳头瘤病毒(papillomavirus,PV)的宿主范围很广,几乎包括所有的哺乳动物和鸟类。
常见的PV包括人乳头瘤病毒(humanpapillomavirus,HPV)、棉尾兔乳头瘤病毒(cottontailrabbitpapillomavirus,CRPV)、牛乳头瘤病毒(bovmepapillomavims.BPV)、犬口腔乳头瘤病毒(canineoralpapillomavirus,COPV)等,同属于乳头瘤病毒科(Papillomaviridae)。
人们对于HPV与宫颈癌以及湿疣等疾病的相关性认识始于19世纪70年代,后来随着分子生物学技术的不断发展,在1983和1984年成功地从宫颈癌组织中分离出HPVl6[11和HPVl8【2I病毒株,之后对HPV的研究进入了一个快速发展的时期。
至今,已被分离和鉴定的HPV型别有100多种【3l。
1.1.HPV的病毒结构
HPV是一种无包膜的,小分子双链环状DNA病毒,病毒衣壳由主要衣壳蛋白Ll和次要衣壳蛋白L2构成,在电镜下大小55nm,呈二十面体结构。
图l:
HPVl6基因组结构图Ⅲ
Fig.1:
SchemeofHPVl6genomicstructure
刖舌
HPV的基因组约8Kb。
其中较典型的HPVl6的基因组结构如图1所示,包括长控制区(10ng
放阅读框(opencontrolreadingregion,LCR),编码早期非结构蛋白(El,--E7)的开frame,ORF)和编码晚期结构蛋白(Ll和L2)的ORF。
HPV的早期蛋白负责基因组的复制、转录、翻译,细胞的转化以及病毒颗粒的组装等。
El以六聚体形式存在,是一种ATP酶以及解旋酶【引,识别HPV复制起始位点,在E2蛋白辅助下,与DNA聚合酶Q亚基结合并起始病毒基因的复制【6,71。
E2以二聚体的形式存在,在病毒DNA复制和基因转录调节方面发挥重要功能。
当细胞中E2浓度下降时,E2激活早期基因的表达;E2浓度升高时,通过抑制一些转录因子的作用可降低病毒蛋白表达,通过这种机制将细胞中的病毒拷贝控制在一定数量内l引。
E6和E7是癌蛋白,分别与细胞内抗癌抑制因子p53、pRb作用,诱导细胞癌变【9】。
E4、E5蛋白在病毒增殖期才开始表达,E5可以与细胞内多种生长因子受体结合,影响细胞信号途径和正常的细胞生活周期,促使细胞增殖,分化延缓【Io】,E4蛋白与细胞周期的调控有关【II,12I。
E3的功能目前还不清楚。
HPV衣壳是由72个Ll蛋白五聚体构成的T--7的二十面体结构,一个病毒粒子上含有360个Ll蛋白单体【13,14】,L1蛋白单体和五聚体结构如图2所示。
体外表达的Ll蛋白可自组装或与L2蛋白共组装成类病毒颗粒(viruslikeparticle,VLP),组装的过程可非特异的包裹小于8Kb的环状DNA。
电镜下VLP的大小、形状均与天然病毒颗粒相似【15,161。
在溶液中存在D1vr、2一巯基乙醇或者低盐浓度的条件下,VLP会重新解聚成五聚体,这说明五聚体组装成VLP同时存在离子键和二硫键的作用【t7,tgl。
L2蛋白位于L1构成的VLP上,每个病毒粒子上含有12个或更多拷贝的L2蛋白【19,20】。
目前已鉴定出L2蛋白上存在两个与L1的作用位点,一个位于129"--246号氨基酸之间,另一个位于C末端,384---460号氨基酸之间,两个位点对于核酸包裹均有显著影响【2¨。
C末端的结合位点存在疏水作用区,这种强疏水作用使得Ll蛋白和L2蛋白结合在一起,若在该区域引入负电荷的氨基酸,则Ll与L2的相互作用将被阻蝌22l。
n言
图2:
BPVl6L1蛋白单体和五聚体I。
I
Fig2:
HPVl6L1monomerandpentamer
1.2.HPV的分类
历史上,由于缺乏支持PV复制的细胞培养模型,同时从组织中分离的病毒量很少,影响了Pv的血清学分型。
Pv基因组非常保守,由突变或重组造成序列改变非常罕见。
而Pv基因组中L1基因最保守,因此可以通过L1DNA序列对叫进行分型。
新分离乳头瘤病毒的L1基因序列若与己知最接近的Ll基因序列的差异达到10%以上,就认为是一个新型别;若差异在2%到10%之间,则认为是一个新亚型,若差异小于2%,则是参比型别的突变抹口J。
根据HPV基因型的不同,已经被分离和鉴定的IlPV型剐有100多种,并按照发现顺序进行编号。
根据感染部位的不同,HPV可分为肛门生殖器型和皮肤型。
肛门生殖器型的HPV根据与宫颈癌的相关性又被划分为高危型和低危型,前者与诱发宫颈癌密切相关.包括HPVl6、18、3l、33、35、39、45