整理植物内生菌分离处理方法.docx

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整理植物内生菌分离处理方法

d植物内生菌分离处理方法

文献

材料

前处理

第一次消毒

第二次消毒（含三消）

处理

对照

培养基

刘明志，2011

南方红豆杉的老树皮、幼茎、叶

截成2～3cm长的小段，去除树皮层

75%酒精中浸泡30s

0．1%升汞溶液浸泡8min，无菌水冲洗3～5次

研磨成匀浆液，倾倒于PDA上

切成0．5cm左右的块，接种于有100mgL－1青霉素和链霉素的PDA固体培养基表面。

每皿10块

刘金花

2011

黄花蒿的根，茎，叶

叶切成1cm2,茎和叶切成1cm左右小段（两端皆有切口）

将根，茎，叶一次用75%酒精浸1min

1%的次氯酸钙溶液浸泡1min,用无菌水冲洗5次

置于含双抗的VA培养基平板培养

待切口处长出菌落后转至PDA培养基进行内生真菌的分离

宋培勇

2011

珙桐茎、叶和叶柄

将采集的新鲜珙桐的茎、叶和叶柄分

别用流水冲洗,风干表面水分,剪成小块或小段,

无菌水漂洗2次

75%酒精浸泡1min

再用2%

NaClO溶液中浸泡3min,转入75%酒精中浸泡30s,

接着用无菌水漂洗3次,

取最后一次漂洗液涂布NA平板作为对照

平放于NA平板上,28°C培养2−3d

孙传伯2011

台湾7303毛豆全株

采回的样本用自来水洗净,并用无菌纸吸干水分,并用无菌纸吸干水分,切取支根110cm长的小段,须根切成115cm的小块

用75%酒精浸泡5min、7min、10min

分别用0.1%升汞溶液处理4min、6min、8min进行表面灭菌,此试验分别重复3次。

最后用无菌水冲洗4次,。

最后用无菌水冲洗4次

将组织块在研钵中充分研磨成匀浆

最后一次冲洗液涂3种不同培养基平板,26~28e下培养2~3d,筛选出最佳消毒时间和培养基,将表面消毒彻底棉花根部切块放入灭菌研钵中用无菌水冲洗4次,取上清液涂抹于培养基上。

以无菌水冲洗为对照试验。

取上清匀浆涂抹于3种不同培养基上,取匀浆涂布于不同培养基平板,每浓度重复3次,然后将培养皿置于26~28e恒温箱中培养2~3d,观察培养出的菌落形态

张鑫

2011

植物圣罗勒的健康

叶子

将叶子用流水冲洗10min

1%的次氯酸钠中浸泡10min

0．02mol/L、pH7．0的无菌磷酸钾缓冲液（PB）漂洗

4次

加无菌水将材料研磨

涂布培养

李铭,

2011

石耳目地衣

为了诱导产孢，黑化菌株在光照/黑暗（12h∶12h）条件下，于2%的PDA

培养基上，18℃下培养3个月

刘杰凤

2011

健康的小白菜，染病的小白菜根，茎，叶

流水冲洗干净，剪成小段

75％酒精中浸泡3min

10％次氯酸钠浸泡茎为8min，根和叶由于气孔较茎大，浸泡5min即可，然后用无菌水浸泡多次，每次3min

无菌条件下用适量的

PBS

缓冲液捣碎

以最后一次的漂洗液作对照

，30℃

下培养

一个星期

搅拌后静置3min，取上清液0．5mL分别涂布于分离培养基平板上，每种材料做3次平行

朱士茂

2011

新采集的银杏枝条，叶子和根

在自来水中冲洗干净，然后将枝条和根截成3－4cm长，将叶子和叶柄分开，分别将根，枝，叶放在不同的灭菌后的广口瓶中

（1），根的表面灭菌:

0.1%的土温20消毒1min，无菌蒸馏水冲洗2次。

（2）枝，叶和叶柄：

75%的乙醇消毒30s，无菌蒸馏冲洗3次

（一）,根：

75%的乙醇消毒30s，无菌蒸馏水冲洗2次，0.1%升汞消毒5min，无菌蒸馏水冲洗5次。

（二）枝，叶和叶柄：

0.1%升汞消毒7min，无菌蒸馏水冲洗5次

茎，将其表皮剥离，用无菌小刀纵切表皮取其中间的部分，然后将其切成0.5cm×0.5cm大小

第二节　安全预评价叶和叶柄，用研钵将叶磨碎（内放石英砂和生理盐水）然后用无菌移液管吸取0.2ml放入培养皿中

①将以上接入的每种平皿按相同的方法接入5min后用无菌镊子取出;②用无菌蒸馏水冲洗已表面灭菌后的材料，然后将此液体移入培养基中，培养观察。

环境影响的经济损益分析，也称环境影响的经济评价，即估算某一项目、规划或政策所引起的环境影响的经济价值，并将环境影响的经济价值纳入项目、规划或政策的经济费用效益分析中去，以判断这些环境影响对该项目：

规划或政策的可行性会产生多大的影响。

对负面的环境影响估算出的是环境费用，对正面的环境影响估算出的是环境效益。

KB培养基:

PL培养基:

一、环境影响评价的发展与管理体系、相关法律法规体系和技术导则的应用PDA培养基:

肖淑贤

2011.

长势好、无病害的植株

在自来水中冲洗干净

采用升汞、乙醇、H2O2、次氯酸钠等表面消毒剂进行消毒，无菌水冲洗

直接切取植物组织或榨取植物组织汁液稀释

一、环境影响评价的发展与管理体系、相关法律法规体系和技术导则的应用王剑峰

4.建设项目环境影响评价文件的分级审批2011

（一）环境影响经济损益分析概述取生长15天马铃薯

第五章　环境影响评价与安全预评价无表面灭菌方法

环境影响经济损益分析一般按以下四个步骤进行：

2.早期介入原则；

马铃薯内生菌单菌落的分离取生长15天马铃薯LK99组培苗,剪成长度约1.0cm的带腋芽茎段接种于PSA培养基上,分别于光下（28℃、2200Lx、16hr光/8hr黑暗）或28℃暗培养,3天后光下和黑暗条件下组培苗周围的培养基上出现黄色菌块,挑取黄色菌块,用稀释涂布法[66]分离单菌落。

李晓红

影响支付意愿的因素有：

收入、替代品价格、年龄、教育、个人独特偏好以及对该环境物品的了解程度等。

不同表面消毒方法对核桃叶内生菌分离效果的比较

内容残缺）

熊亚南

2011

刺五加植株流水冲洗去土，根，茎，根茎等部

流水冲洗去土

按根，茎，根茎等部进行分割，每段长10cm左右，按下列程序表面消毒：

无菌水冲洗→95%酒精漂洗1min→6%的Naclo浸3min

75%的乙醇漂洗0.5min→无菌水漂洗3次

进行分割，每段长10cm左右

同样处理的材料不做切割直接滚印于对照平板，并去最后一次漂洗的无菌水平板涂布，置相同条件下培养，无菌长出即为表面消毒彻底。

NA培养基。

将上述处理过的材料韧皮部与木质部无菌分离，韧皮部切成约0.5cm×0.4cm的薄片，然后将薄片直插入和水平贴附两种方式置于分离平板上，25-28℃暗箱培养，带材料边缘有菌苔长出后转接与纯化平板划线法分离纯化，镜检验纯后转接到斜面。

邓正山

2012

健康的大蒜鳞茎

用纯净水冲洗干净

依次用体积分数７５％的乙醇浸泡３ｍｉｎ

０．１％的氯化汞表面消毒１５ｓ，再用无菌水漂洗５次

杨明琰

2012

新鲜的杜仲

将新鲜植物材料用自来水冲洗外表面直至干净，晾干。

用无菌刀将样品切割成３ｃｍ左右的小段

７５％的酒精溶液中浸泡６ｍｉｎ，用无菌水冲洗样品表面３～５次

再在４％的次氯酸钠溶液中浸泡３ｍｉｎ，用无菌水冲洗样品表面３～５次

用镊子及解剖取其韧皮部，切除两端后切成大约１ｃｍ×０．５ｃｍ的小段

①漂洗液检验法：

把最后一次漂洗材料的无菌水涂布于ＰＤＡ平板上，２８℃恒温培养。

②组织印迹法：

将上述表面灭菌处理的完整枝段压入ＰＤＡ平板内，使表面灭菌材料与培养基接触３０ｍｉｎ后，移去植物材料，２８℃恒温培养。

③组织压入法：

将灭菌材料不经切割直接贴于ＰＤＡ培养基表面，２８℃恒温培养

将小段，贴于ＰＤＡ培养基的表面，每皿放３块材料，于２８℃恒温培养箱内培养５～１０ｄ。

待菌丝从植物组织长出后，从边缘挑取菌丝移至另一ＰＤＡ平板上进行纯化

胡秀荣

2011

采集健康的柑橘植株

放线菌

：

先在自来水下冲洗掉样品表面的泥土，再用超声波清洗

放线菌：

然后用99%乙醇处理1min，3%次氯酸钠处理5min

放线菌：

最后用99%乙醇再处理30s

放线菌：

灭菌好的材料用无菌刀切成1cm×1cm小块，置于分离培养基表面

放线菌：

将最后一次处理植物样品的清洗液涂在ISP2培

养基上，用以检测表面灭菌的效果

熊党生

2012

取新鲜健康的葛根的根、茎、叶

分别用水冲洗干净，用滤纸吸干水分

无菌水冲洗2遍，先用体积分数75%酒精浸泡3～5min（叶子3min，茎4min，根5min），无菌水冲洗3～4遍

用0．1%升汞浸泡2～4min（叶子2min，茎3min，根4min），无菌水冲洗4～5次

在无菌的条件下，用灭过菌的手术剪刀将植物根、茎、叶剪成小段，从中间剪开后，分别置于含有葛根浸出夜的PDA琼脂培养基上，置于生化培养箱中培养一段时间

将上述经过表面消毒后未作任何处理的材料直接置于平板中，27℃培养，结果材料周围未见任何菌长出，证明所分离的菌株为葛根的内生菌。

挑取内生细菌到牛肉膏蛋白胨培养基中，挑取内生真菌的菌丝到PDA培养基中纯化数次，将纯化好的菌种接种到斜面培养基上保存备用

张彦涛

2012

白蜡、茅草、射干、罗布麻、蓼草、胡杨、怪柳。

取采集的新鲜样品，用蒸馏水将植物表面洗净

干后分别取其根、茎、叶，在75%乙醇消毒液中浸泡3～5min

3%次氯酸钠浸泡5min，75%乙醇浸泡5min。

最后用无菌水冲洗3～4次

将样品在灭菌的研钵中研磨，加适量无菌生理盐水研磨至匀浆状

最后一次冲洗的无菌水涂布平板做空白对照

（分离培养基）取1mL液体分别按照10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7依次梯度稀释，并分别涂布平板，37℃恒温培养2d。

红树林内生放线菌

文件不完整

李雁津2012

完整交城骏枣,

用自来水清洗表面后再用无菌水冲洗,晾干称重后浸入30%的乙醇中3min

浸入2.6%的次氯酸钠溶液中5min

浸入30%的乙醇中30s进行表面消毒,最后用无菌水冲洗5次,晾干

用无菌剪刀将枣果去皮,果肉剪碎,加入无菌生理盐水研磨

取最后一次淋洗水150微升涂于LB平板上,28°C培养72小时,检测表面灭菌效果。

将碾磨液分别涂布于胰酶大豆琼脂培养基（TSA）、任氏培养基（R2A）、金氏培养基（KMB）、肉汁胨培养基（BPA）、LB培养基、酵母膏蛋白胨琼脂培养基（YPM）、无氮培养基,28°C培养箱中倒置培养3-7天。

张慧茹

2012

挑选新鲜、生长旺盛的葎草，用保鲜袋包装

用自来水冲洗干净，置无菌操作台中紫外灯照射5min后晾干。

用75%酒精进行全草消毒1min

升汞消毒时间分别为：

根65s、茎50s、叶35s。

再用无菌水冲洗干净

将上述组织块剪成0.5cm×0.5cm大小

分别取各种组织最后一次冲洗的无菌水，涂布于营养琼脂平板上；将表面消毒处理过的完整的根、茎、叶各组织贴压在PDA培养基平板内；在超净工作台内放置一敞开的PDA平板。

将上述3种对照平板置于28℃恒温培养箱内培养7d，用于检查表面灭菌效果。

置于马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）培养基中，28℃恒温培养箱中培养约5~7d，待内生菌长出后，挑取单个菌落进行纯化，PDA培养基斜面保菌。

李勇

2011

健康人参

自来水将人参根表面粘连的土壤清洗，再用无菌水冲洗1次

依次用70%乙醇浸泡3min

2.6%次氯酸钠浸泡5min，再用70%乙醇浸泡30s。

最后用无菌水淋洗5次

将无菌人参根剪成碎块，放入无菌研钵中，加入适量无菌石英砂和生理盐水（0.85%），充分研磨，梯度稀释1万倍

取最后一次淋洗液150μL涂平板，28℃培养3d，观察平板上是否有菌长出

。

取200μL稀释液至细菌分离培养基，涂布均匀。

25℃恒温培养7d，记录每个平板上的菌落形态及菌落数，纯化培养。

林娜

2012

随机挑选100g左右根、茎、叶、果实

洗净风干

75%乙醇分别浸泡2、3、1、1min，无菌水冲洗6次，无菌滤纸吸干

0．1%HgCl2分别浸泡50、60、40、40s，无菌水冲洗6次

加无菌石英砂研磨，梯度稀释至10－3，每一稀释梯度涂布10个分离平板

每个样品都取最后一次无菌水洗液涂于相应平板上，以检测表面消毒是否彻底

定期观察分离平板，挑取单菌落划线纯化于牛肉膏蛋白胨斜面上。

张鑫

2012

无纹背苔藓

取苔藓叶片用无菌水洗净

紫外先线（功率18QW）照射6min（苔藓叶正反面个照射30min）灭菌

然后用75%的酒精漂洗15min，用无菌水冲洗3次，再利用酒精灯火焰进行表面灭菌

将验证表面无菌的叶子于无菌碾钵中碾磨，用无菌水梯度稀释

将表面灭菌的叶子直接贴于固体PDA和LB培养基表面，28℃培养3-4h，观察叶子周围是否长菌，以检验鲜苔表面灭菌是否彻底。

各取200微升稀释液涂布于固体PDA和LB培养基进行内生菌的分离。

根据菌落形态，颜色等特征初步判断处分理出菌落的中类，并按常规的方法挑取菌落保存。

蓝江林

2012

香蕉，处于成果期的健株和病株各1株

将样品用自来水冲洗干净，吸干水分，称重

先用75%酒精浸泡40s左右，用无菌水充分淋洗

再用10%KClO3溶液浸8min，无菌水反复淋洗，无菌滤纸吸干

根部选取根尖和根基部分;假茎部从茎基部到茎顶端等分为5段，每段随机取样;叶片根据生长的位置分为上部、中部和下部叶片，每部分取叶基部中部和叶尖部分

以组织消毒后无菌水淋洗的最后淋洗液作为对照,涂NA平板培养，如长菌落,则判定研磨液所培养的菌落为非内生菌,丢弃;若对照中无菌落,则基本可判定研磨液中长出的菌落可能是内生菌，纯化后保存待用。

在无菌研钵中充分研磨匀浆，无菌水梯度稀释至102、103和104，取200μL稀释液涂布于NA平板上，每梯度3个重复，静置20min后，30℃倒置暗培养24~48h。

史应武

2012

新疆醉马草

将醉马草的根、茎、叶（包括叶鞘）、种子分别用自来水冲洗干净，

再用无菌水冲洗一次;在75%的0乙醇浸泡30s将醉马草的根、茎、叶（包括叶鞘）、种子分别用自来水冲洗干净

然后在0.1%的升汞中浸泡1min;无0菌水淋洗5次，在无菌条件下晾干

取最后一次淋洗水涂于LB平板上，28℃培养72h，检测表面灭菌效果

马赟

2012

阿尔泰虫草

取阿尔泰虫草用水粗洗

再用乙醇擦洗2min

然后在0.1%氯化汞溶液中消毒3min，无菌水冲洗4～6次

将虫草切成0.1～0.5cm长的小段

将小段接到马铃薯培养基（PDA）、LB培养基培养

刘明志。

南方红豆杉产紫杉醇内生真菌的分离。

热带亚热带植物学报，2011，19（4）:

360～364

剥取红豆杉的老树皮，截成2～3cm长的小段，去除树皮层，先用75%酒精中浸泡30s，无菌水冲洗3次，再用0．1%升汞溶液浸泡8min，无菌水冲洗3～5次。

用无菌滤纸吸干表面水分，用无菌解剖刀将小段切成0．5cm左右长的小块，接种于加有100mgL－1青霉素和链霉素的PDA固体培养基表面。

每皿放置10块，依次编号，置于25℃恒温培养箱中培养。

幼茎内生菌的分离方法同上，将幼茎切成1cm长的小段，以伤口断面垂直接种于PDA固体培养基上培养。

红豆杉叶片内生菌的分离采用两种方法，第一种方法与树皮内生菌的分离方法类似，分离时将叶片切成2至3段，接种于PDA固体培养基上;第二种方法是将叶片消毒后用无菌研钵研磨成匀浆液，然后将研磨液倾倒于PDA固体培养基上，置于25℃恒温培养箱中培养。

1刘金花。

黄花蒿内生菌的分离与初步鉴定。

２０１１，３３（４）：

２７～３０

黄花蒿的根，茎，叶，叶切成1cm2,茎和叶切成1cm左右小段（两端皆有切口），将根，茎，叶一次用75%酒精浸1min，再用1%的次氯酸钙溶液浸，置于含双抗的VA培养基平板培养泡1min,用无菌水冲洗5次。

待切口处长出菌落后转至PDA培养基进行内生真菌的分离。

2宋培勇，珙桐内生细菌的分离鉴定及系统发育分析，2011,38

（1）:

8−13

将采集的新鲜珙桐的茎、叶和叶柄分别用流水冲洗,风干表面水分,剪成小块或小段,无菌水漂洗2次,75%酒精浸泡1min,再用2%NaClO溶液中浸泡3min,转入75%酒精中浸泡30s,接着用无菌水漂洗3次,平放于NA平板上,28°C培养2−3d。

取最后一次漂洗液涂布NA平板作为对照。

内生菌分离和纯化。

将NA平板上组织块下或周缘长出的菌落或菌苔划线稀释分离1-2次直到获得纯培养

3孙传伯。

毛豆内生菌的分离及生物学特征观察。

（2011）10-0026-02

（1）从供试材料上取植物组织1.0g,用70%（体积分数）酒精浸泡30s,用无菌水漂洗后,置于1%（体积分数）次氯酸钠水溶液中表面消毒3-5min（其中叶片和花消毒3min,茎和果消毒5min）,再取出植物组织用无菌水冲洗3次.样品晾干后分别置于无菌研钵中加5mL无菌水研磨成浆状,静置10-15min后,每一样品各取上层澄清液50LL分别涂布在培养基（NA、KB和TSA）平板上,每种培养基涂布3皿,28e黑暗培养48-72h,计算每一平板的菌落数.表面消毒后,在研磨前取50LL无菌水冲洗液涂布平板;或是通过组织印迹试验,将最后一次清洗的植物组织在培养基平板上印一下,按上述条件培养48h,观察有无菌落产生,以验证采用该消毒方法是否能杀死供试材料表生微生物.根据菌落形态、颜色等挑取单菌落,划线分离、纯化后保存、备用.在融化并冷却至45e的NA培养基中加入待测病原菌的悬浮液,其中每100mL培养基加1mL细菌悬浮液,倒入平板.采用点接法将内生菌接种于NA平板上,每个平板上等距离点接5株不同的内生细菌菌株,每组进行2次平行试验,在恒温箱中28e下培养,2d后观察有无抑菌圈生成.

（2）采用组织切块法,进行表面消毒,再用灭菌的蒸馏水清洗,检验灭菌效果。

内生细菌的分离前,将采回的样本用自来水洗净,并用无菌纸吸干水分,切取支根110cm长的小段,须根切成115cm的小块,进行组织表面清毒,棉花根部切段后经无菌水冲洗3次,用75%酒精浸泡5min、7min、10min后,然后分别用011%升汞溶液处理4min、6min、8min进行表面灭菌,此试验分别重复3次。

最后用无菌水冲洗4次,最后一次冲洗液涂3种不同培养基平板,26~28e下培养2~3d,筛选出最佳消毒时间和培养基,将表面消毒彻底棉花根部切块放入灭菌研钵中用无菌水冲洗4次,取上清液涂抹于培养基上。

以无菌水冲洗为对照试验。

培养2d后观察灭菌效果,直到彻底表面灭菌,再进行最后的内生菌分离。

将组织块在研钵中充分研磨成匀浆,取上清匀浆涂抹于3种不同培养基上,取匀浆涂布于不同培养基平板,每浓度重复3次,然后将培养皿置于26~28e恒温箱中培养2~3d,观察培养出的菌落形态。

（3）再将材料放进经过紫外线消毒的超净工作台内,切割成小段,按常规无菌操作进行表面消费处理:

75%乙醇浸泡3miny无菌水冲洗3遍y011%升汞浸泡8miny无菌水冲洗3遍。

将上述处理过的材料经滤纸吸干水分后,在无菌条件下切成015cm@015cm的小块,放置于新鲜的PDA平板培养基上,每个平板放置4块,28e恒温培养3~7d。

待切口边缘长出真菌菌丝,及时转接至新鲜PDA培养基上培养,采用菌丝顶端纯化法逐步纯化。

同时,以消毒后不做切割的材料作为空白对照,同样条件下观察是否有菌长出,结果对照材料周围无任何菌长出,证明表面消费彻底。

212内生真菌的鉴定:

采用真菌学插片培养方法,对分离获得的见血封喉内生真菌进行显微形态特征（菌丝、孢子形态等）的观察、分类鉴定。

分类检索参照文献报道[8]。

213内生真菌的发酵上清液制备:

将分离得到的菌株,切取黄豆粒大小的菌丝块,接种于PDB培养基中。

1L三角瓶装400mL培养液,室温,164r/min振荡培养7d,同时以纯培养基作空白对照。

无菌条件下取发酵液15mL于离心管中,12000r/min离心30min后取上清液,用012Lm微孔滤膜滤过除菌,-20e保存备用。

214抑菌活性测定:

采用杯碟法测定样品抑菌活性。

金黄色葡萄球菌和MRSA采用NA培养基,白色念珠菌采用YPD培养基。

将金黄色葡萄球菌、MRSA和白色念珠菌分别制成一定浓度的菌悬液（1@105~1@107cfu/mL）,用棉签将其均匀涂布在供试无菌培养皿中,制成含菌平板,然后在每个平板放入3个牛津杯,分别取样品200微升加入其内,同时以发酵纯培养基作阴性对照。

金黄色葡萄球菌和MRSA在37e下恒温培养,白色念珠菌在28e下恒温培养。

24h后观察结果,测量并记录抑菌圈直径。

每个样品做3个重复,以抑菌圈直径的平均值为试验结果

4张鑫，生菌的分离方法及其次级代谢产物研究,（2011）02-0023-04

内从药用植物圣罗勒的健康叶子上分离出4种内生细菌OS－9、OS－10、OS－11和OS－12。

他们首先将叶子用流水冲洗10min，随后于1%的次氯酸钠中浸泡10min，再用0．02mol/L、pH7．0的无菌磷酸钾缓冲液（PB）漂洗4次，每次洗后取100μL漂洗液转移到装有5mL肉汤培养基的离心管中，经过48h震荡培养（条件是200rpm，28℃），检测样品表面消毒是否彻底。

分离过程为选用紫外线和75%酒精作为表面消毒剂，经过多次消毒，加无菌水将材料研磨后，再将研磨液涂布。

5李铭,石耳目地衣（2011）02-0014-07

无

6刘杰凤,小白菜内生菌的分离及菌核菌拮抗菌的筛选（2011）13－2676-04

健康的小白菜，染病的小白菜。

采回的植株用流水冲洗干净，剪成小段，75％酒精中浸泡3min，再用10％次氯酸钠浸泡一定时间：

茎为8min，根和叶由于气孔较茎大，浸泡5min即可，然后用无菌水浸泡多次，每次3min，表面消毒检测至漂洗液无菌落长出为止，一般为3～4次。

在无菌条件下用适量的PBS