第十二章 液质联用Word文档格式.docx
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在医学方面，LC-MS可以检测运动员体内兴奋剂、可卡因等违禁成分；
在食品安全方面，可以用LC-MS检测食品中微量的添加剂以及致癌物质等；
在环保方面；
可以用LC-MS检测水源、空气和土壤等中的污染物种类以及污染程度。
不仅如此，随着色谱-质谱联用技术的不断改进，LC-MS已成为现代仪器分析中不可或缺的重要组成部分。
特别是与串联质谱（MS-MS）的联用技术得到了极大地发展和推广。
具有高效分离能力的液相色谱与高选择性、高灵敏度的MS-MS结合使用实现了对未知化合物的实时分析。
即使化合物极性相近难以分离，同样可以通过串联质谱对目标化合物中性碎片扫描提高混合物中目标化合物的信噪比。
12.2液相色谱-质谱仪器系统
12.2.1液相色谱-质谱联用仪组成
液相色谱或质谱仪器类型很多，用途不同，但多数仪器的组成结构基本相同。
它们是液相色谱系统、质谱系统及数据处理系统等。
以LC-MS（四极杆）联用仪器为例其主要的构成如图12-1所示。
只要采用适当的连接方式，将色谱柱出口和质谱进样口连接起来，即可成为液相色谱和质谱联用的系统。
去掉连接件，将色谱柱接回到色谱检测器，仍是可独立使用的液相色谱和质谱仪。
1-液相入口；
2-雾化喷口；
3-离子源；
4-高压放电针；
5-毛细管；
6-CID区；
7-锥形分析器；
8-八极杆；
9-四极杆；
10-HED检测器
图12-1液相色谱-质谱的基本结构
在专用型液相色谱-质谱联用商品仪器尚未普及时，一些实验室使用的联用系统都是这样构成的。
如今已经有许多配置不同、性能各异的专用型液相色谱-质谱联用仪器，供不同用途选择。
不同厂家各种型号的LC-MS联用仪器多达几十种，有小型台式的液相色谱-单四极（singlequadrupole）质谱或三重四极（triplequadrupole）质谱联用仪，液相色谱-离子阱（iontraps）质谱联用仪，液相色谱-飞行时间（timeofflight，TOF）质谱联用仪（LC/TOF）以及液相色谱-扇形磁场（magneticsector）质谱联用仪等。
12.2.1.1高效液相系统
高效液相色谱仪一般包括四个部分：
高压输液系统、进样系统、分离系统和检测系统。
此外，还可以根据一些特殊的要求，配备一些附属装置，如梯度洗脱、自动进样及数据处理装置等，见图12-2。
图12-2HPLC流程图
高效液相色谱系统是构成液质联用仪的重要组成部分，这部分可以参考有关液相色谱部分的具体内容。
由于要与质谱联用，其在流动相组成、色谱条件等方面与常规的液相色谱之间存在着一定的不同。
在液质联用过程中，为了加快样品的分析过程，在液相上通常采用了梯度程序洗脱过程，通常的液质联用中配置了二元泵或四元泵系统。
色谱柱是实现样品分离的重要部件，在液质联用中根据使用方法、离子源的种类等的不同所选择的色谱柱也有一定的区别。
对于分析型的液相色谱而言如果质谱选择了ESI离子源，建议使用内径小于4.6mm的微径柱，如果质谱选择了大气压化学电离源（APCI），建议使用内径为4.6mm的色谱柱。
12.2.1.2质谱系统
液质联用仪是实现样品液相分离并检测过程的仪器，无论液质联用仪的类型如何变化，构成质谱系统的5个基本组成部分皆是相同的，它们是接口、电离源、真空系统、检测系统及数据处理系统。
电离源是将引入的样品转化为正或负离子，并使之加速，聚焦为离子束的装置。
电离样品分子所需要的能量随分子类型的不同而变化，因此，应根据分子的类型选择与之适配的电离源。
根据样品离子化方式和电离源能量高低，通常可将电离源分为：
（1）硬源：
离子化能量高，伴有化学键的断裂，谱图复杂，可得到分子官能团的信息，如电子轰击，快原子轰击。
（2）软源：
离子化能量低，产生的碎片少，谱图简单，可得到分子量信息，如化学电离源（CI），电喷雾电离源（ESI），大气压化学（APCI）电离源。
质谱仪中所有部分均要处于高度真空的条件下（10-4Pa~10-6Pa），其作用是减少离子碰撞损失。
真空度过低，将会引起：
大量氧会烧坏离子源灯丝；
引起其它分子离子反应，使质谱图复杂化；
干扰离子源正常调节；
用作加速离子的几千伏高压会引起放电。
液相色谱-质谱联用质量分析器的作用就是将不同离子碎片按质荷比m/z分开，将相同m/z的离子聚集在一起，组成质谱。
质量分析器类型：
磁分析器、飞行时间、四极杆、离子捕获等。
12.2.2液相色谱-质谱联用技术特点
质谱分析是先将物质离子化，变为气态离子混合物，并按离子质荷比的不同而分离，然后测量各种离子谱峰的强度而实现分析目的的一种分析方法。
它不仅弥补了GC-MS的不足之处，而且还有以下优点：
（1）高普适性：
质谱仪的出现，有效的解决了热不稳定性化合物分析检测的难题；
（2）高分离能力：
有些时候由于化合物极性非常接近，很容易出现在色谱柱上不能完全分离的状况。
质谱分析不仅可以有效的检测出所有化合物的分子量，而且还可以通过二级质谱图给出不同化合物各自的结构信息；
（3）高灵敏度：
质谱仪具有很高的灵敏度，一般在<
10-12g水平下的样品都可以通过质谱法进行检测。
与此同时，对于没有紫外吸收的复杂化合物，质谱分析法表现的更是得心应手；
（4）给生物化学家提供了一个从分子水平上进行研究的平台；
（5）高效的制备系统，有效地解决了传统UV制备中的难题，从很大程度上提高了制备系统的性能。
12.2.3液相色谱-质谱联用技术的接口
液相色谱-质谱联用的关键技术是液相色谱仪与质谱仪的接口装置。
该装置在去除溶剂以及促进样品分子离子化过程中发挥着巨大作用。
液相色谱-质谱联用技术的研究开始于20世纪70年代，与气相色谱-质谱联用联用技术相比，液相色谱-质谱联用技术经历了一个更加漫长的探索过程。
早期的接口装置，如传送带接口、热喷雾接口、粒子束接口等，都因存在不同程度的缺陷而使液相色谱-质谱联用技术没有得到商业化的应用。
直到90年代，大气压化学电离源（APCI）的出现才给液相色谱-质谱联用技术带来一次历史性的变革，也正是由于它的出现才进一步的推动了液相色谱-质谱联用技术商业化应用的步伐。
12.2.3.1直接液体导入接口
最初的直接液体导入接口（DLI）出现于20世纪70年代，但这一技术始终停留在实验室使用阶段，没有真正形成商品化仪器。
DLI接口是在真空泵的承载范围内，以细小的液流直接导入质谱。
实际操作中，LC的柱后流出物经分流，在负压的驱动下经喷射作用进入脱溶剂室形成细小的液滴并在加热作用下脱出溶剂。
脱溶剂的同时没有离子产生，其离子化的过程出现在离子源内，是被分析物分子和溶剂作用的结果，因此它应归于化学电离一类技术。
其碎片依然是靠EI源的电子轰击产生。
DLI技术中的喷射方式可以是金属毛细管（20μm~50μm），也可以是起“筛网”作用的带孔薄膜（2μm~5μm），其作用都是为了得到细小、均匀的液滴。
在以后的各种接口技术的讨论中，我们可以看到这细小液滴的形成，无论采用何种技术手段，对于离子化过程都是最为基本、必要的一步。
虽然DLI的接口简单易得，可以实现许多化合物由固态到气态的温和转化，然后通过样品以溶液的形式进入MS造成CI条件而获得化合物的相对分子质量，但也存在以下问题：
1由于质谱仪对真空度要求非常高，直接进入MS的液体通常会产生许多气体，当用传统的柱子操作时需要大量溶剂的分流，这样就大大减少了进入离子源的样品量，约减到1/100~1/20，从而使灵敏度下降。
但用微孔HPLC柱，较小的流量允许所有的洗提物导入离子源。
2容易堵塞隔膜。
一般情况下，LC流出物中的溶剂在MS的离子源中蒸发，因此，LC的流动相中应尽量使用挥发性的溶剂以及缓冲剂，避免难挥发的缓冲盐类物质的存在。
DLI-MS可以使用正相系统、反相系统以及富水性的流动相，大大减少了灯丝的使用寿命。
12.2.3.2移动带技术
移动带（MB）是在LC柱后增加了一个移动速度可调整的流出物的传送带，柱后流出物滴落在传送带上，经红外线加热除去大部分溶剂后进入真空室（见图3），传送带的调整依据流动相的组成进行，流量大，含水多时带的移动速度要相应的慢一些。
在真空中溶剂被进一步脱出，同时出现分析物分子的挥发。
离子化是以EI或CI进行，有的仪器也曾使用FAB。
由于使用了EI源，用MB技术可以得到与GC-MS相同的质谱图，这样就可使用多年研究积累的EI质谱数据库进行检索。
MB技术分离溶剂和被分析物是基于二者沸点上的差别，从这个意义上讲它可以被用于大部分有机化合物的质谱分析，但沸点很高即便是在源内真空下仍无法显著挥发的化合物则无法分析。
MB技术的主要问题：
低离子化效率及相应的低灵敏度。
在许多场合下，不能满足日益提高的质谱分析要求。
此外，移动带上残存的难挥发物质如果无法去除干净，容易造成记忆效应而干扰分析。
12.2.3.3热喷雾接口
热喷雾（TSP）接口是一个能够与液相色谱在线联机使用的LC-TS-MS“软”离子化接口。
该接口的工作原理是：
喷雾探针取代了直接进样杆的位置（如图12-3所示），当流动相流经喷雾探针时会被加热到低于流动相完全蒸发点5~10℃的温度，由于受热体积膨胀，将在探针处喷出许多由微小液滴、粒子以及蒸气组成的雾状混合物。
按照离子蒸发理论及气相分子离子反应理论的解释，被分析物分子在此条件下可以生成一定份额的离子进入质谱系统以供检测。
1-毛细管热电偶；
2-毛细管加热器；
3-加热的离子源
图12-3热喷雾接口示意图
热喷雾接口的主要特点是可以适应较大的液相色谱流动相流速（约1.0mL/min），较强的加热蒸发作用可以适应含水较多的流动相，适用于极性大、难气化、热稳定差的样品。
TSP技术出现后在药物，如抗生素及其他临床药物；
人体内源性化合物，如腺苷、肌苷咖啡因、茶碱、游离氨基酸；
化工产品；
环境分析等许多领域中都做了大量的工作，曾报道过许多很好的应用实例。
TSP是一种软电离技术，TSP接口下测得的化合物谱图只有分子离子峰，碎片结构信息极为匮乏。
为进一步获取化合物的碎片结构信息，推断化合物的结构，可通过在相斥电极上的高压加速碎片与残留溶剂分子之间的碰撞实现。
该接口的使用局限于相对分子质量为200amu~1000amu的化合物。
由于热喷雾谱图与工作条件关系极大、相同化合物测量结果的再现性差、低检测限以及对极性小的化合物几乎没有响应等因素的影响，目前还没有商品化的热喷雾MS谱库。
12.2.3.4粒子束接口
粒子束接口（PB）是一种应用比较广泛的LC-MS接口，如图12-4所示，又称动量分离器（momentumseparator）。
PB接口研制成功后，很快地由仪器厂商开发成为商品仪器并在很大程度上取代了MB技术。
在PB操作中，流动相及被分析物被喷雾成气溶胶，脱去溶剂后在动量分离器内产生动量分离，而后经一根加热的转移管进入质谱。
在此过程中分析物形成直径为μm或小于μm级的中性粒子或粒子集合体。
由喷嘴喷出的溶剂和分析物可以获得超声膨胀并迅速降低为亚声速。
由于溶剂和分析物的分子质量有较大的区别，两者之间会出现动量差；
动量较大的分析物进入动量分离器，动量较小的溶剂和喷射气体（氦气）则被抽气泵抽走。
动量分离器一般是由两个反向安置的锥形分离器构成，可以重复进行上述过程，以保证分离效率。
PB离子化仍由质谱的EI或CI方式进行，可以获得经典的质谱图，并可以使用谱库检索，分析工作获得很大便利。
但PB的电离方式仍以电子轰击为主，是一种“硬的”电离方法，不适合热稳定性差的化合物的分析检测。
图12-4粒子束接口示意图
PB接口主要用于分析非极性或中等极性的，相对分子质量小于1000amu的化合物。
该技术在分析农药、除草剂、临床药物、甾体化合物及染料方面曾有过许多报道和成功的分析实例。
PB接口的效率则强烈地依赖于所生成的气溶胶的均匀性，因为气溶胶的大小分布越窄，动量分离器工作得越好。
PB接口虽然应用广泛，但在实际应用中，仍然存在一些不足，主要表现在：
（1）检出限不适当（ng绝对范围），灵敏度变化范围大（即便对结构类似的化合物也这样）及缺乏较宽浓度范围内线性响应。
（2）两种化合物的协同洗脱会产生巨大影响，高速氦用于溶剂的雾化，成本较高。
（3）PB的电离方式仍以电子轰击为主，是一种“硬的”电离方法，不适合热稳定性差的化合物的分析检测。
12.2.3.5动态快原子轰击（FAB）接口
用加速的中性原子（快原子）撞击以甘油（底物）调和后涂在金属表面的有机化合物（“靶面”）而导致这些有机化合物电离的方法称之为快原子轰击（FAB）。
FAB是在最初用于无机化合物表面分析的离子轰击源（FIB）的基础上发展起来的，是20世纪80年代中发展的一种新型离子源，也是一种“软”离子化技术。
以电子轰击气压为100Pa的中性气体（氩或氦），产生的惰性气体离子经聚焦和加速后撞击靶面导致分析物的离子化是所谓离子轰击作用。
在此基础上将氩离子还原为中性原子，在以加速的中性原子轰击“靶面”即为快原子轰击。
分析物经中性原子的撞击获取足够的动能可以离子或中性分子的形式由靶而逸出，进入气相。
产生的离子一般是准分子离子。
无论是FAB或是FIB都是“冷”离子源，对热不稳定，但对难以气化的化合物的分析有独到的长处。
尤其是它对肽类和蛋白质分析的有效性，在电喷雾接口出现前其他接口是无法相比的。
FAB在肽类和蛋白质分析方面有大量的报道和成功的蛋白质分析实例，显示出在此领域很强的实用性。
由于它特殊的制样方法，FAB的一个很大问题是混合物样品中共存物质的干扰，它们常常会抑制分析物的离子化，造成灵敏度下降甚至根本没有信号产生。
在FAB基础上发展起来的连续流动快原子轰击（continuous-flowfastatombombarment，CFFAB）及类似技术，如动态FAB（dynamicFAB）、Frit-FAB、动态LSIMS（dynamicliquid-assistedseconuryionmassspectrometry）至今作为LC-MS接口有着广泛的使用。
与静态FAB不同的是甘油是以很少的量加入流动相的。
测定过程中，“靶面”不断的更新，其化学物理性质不会产生很大的改变；
同时经液相色谱分离后共存物质不会同时出现在靶面上，因而干扰因素被大大减少。
噪声和灵敏度同时得到改善。
文献报道的LC-CFFAB-MS的灵敏度比静态FAB要高，可达100fmol（相对分子质量为1000amu～2000amu的肽类）。
作为联机使用技术，它的主要缺点是只能在低流量下工作（5μL/min），严重限制了液相柱的分离效果。
流动相中含有的1%～5%的甘油也会使离子源很快变脏，液体通过石英毛细管时容易造成堵塞，所以有人将FAB和LC-CFFAB-MS称为“脏”离子化技术。
此外，由于它的特殊的制样方法，FAB的一个很大的问题是混合物样品中共存物质的干扰，它们常常会抑制分析物的离子化，造成灵敏度下降甚至根本没有信号产生。
12.2.3.6激光解吸离子化和基质辅助激光解吸离子化
基质辅助激光解吸（MALDI）离子化技术首创于1988年，是在1975年首次应用的激光解吸（LD）离子化技术上发展起来的，目前已经得到了广泛的接受和应用。
随着肽类的合成和基因工程科学的快速发展，迫切需要一种高灵敏度和准确的方法来测定肽类和蛋白质的分子量。
MALDI具有很大的潜力来适应这一需要。
目前开发出的MALDI接口仪可以测定高达上百万的分子量，其精度可达0.2%，所需样品一般为50pmol～100fmol。
这样一个灵敏度和反相HPLC（UV检测器）相比，甚至还要高于HPLC。
MALDI以激光照射靶面的方式提供离子化能量，样品底物中加入某些小分子有机酸，如肉桂酸、芥子酸等作为质子供体（donor）。
一般MALDI的操作是将液体样品加入进样杆中，经加热抽气使之形成结晶。
将进样杆推入接口，在激光的照射和数万万伏高电压的作用下，肉桂酸可以将质子传递给样品分子使之离子化，经高电场的“抽取”和“排斥”作用直接进入真空。
20世纪90年代初，MALDI开始与飞行时间质谱连接使用，形成商品化的基质辅助激光解吸-飞行时间质谱仪（MALDI-TOF）。
MALDI技术所产生的离子在飞行管中由于所需飞行时间的差异而得到分离。
MALDI-TOF具有很高的灵敏度，肽类和蛋白质的多电荷离子化可由MALDI产生并由TOF采集到多电荷峰，折算而得的分子量测定范围可以高达百万。
目前，MALDI-TOF已经成为生物大分子分子量测定的有力工具，在生物和生化研究中发挥着重要的作用。
已经有大量的文献报道了应用MALDI-TOF在蛋白质分子量测定、一级结构测定、生物多糖和糖化蛋白质研究等诸多方面的工作，形成了一个蓬勃发展的领域。
与FAB很相同的是，在MALDI应用中，共存物质的干扰也是很明显的。
如果样品含有大量的共存物质（混合物）时，制成的结晶不透明或透明度较差，此时质谱信号会很弱或根本没有信号出现。
为解决这个问题，同时也为了得到一个真正的液相色谱在线连接使用的接口，即可以直接测定液体样品的接口，数年前开始了电喷雾接口与TOF连接的尝试，目前已有商品仪器上市。
12.2.3.7大气压化学电离接口
大气压化学电离源（APCI）与电喷雾电离源（ESI）的作用机理类似，区别是APCI喷嘴的下端装有一个针状放电电极（见图12-5），通过尖端放电，空气中的中性分子（如水蒸汽、氮气、氧气等）以及溶剂分子都会被电离成相应的离子形式，这些离子进而与样品分子发生离子-分子交换，最终使样品分子离子化。
整个电离过程包括了由质子转移和电荷交换产生的正离子，质子脱离和电子捕获产生负离子等。
由于物质结构以及电离源电离方式的不同，当ESI不能产生满意的离子信号时，可以采用APCI方式增加离子化产物的产率，因此可以把APCI看做是ESI的补充。
一般来说，ESI主要用于中等以及大极性化合物的分析检测，APCI一般用于极性以及极端非极性化合物的分析检测。
此外，APCI的离子化产物碎片极少，主要是准分子离子峰，所以可用于检测的的化合物的分子量一般小于1000Da。
1、雾化器气；
2、流出液；
3、修饰气；
4-5、加热器；
6、气帘；
7-8、N2；
9-10、二级泵区；
11、试样流
图12-5大气压化学电离源接口示意图
12.2.3.8电喷雾电离接口
1984年Fenn等人发表了他们在电喷雾技术方面的研究工作，这一开创性的工作引起了质谱界的极大重视。
在其后的十几年中开发出的电喷雾电离（ESI）及大气压化学电离（APCI）商品接口是一项很实用、高效的软离子化技术，被人们称为LC-MS技术乃至质谱技术的革命性突破。
随后的10年中，配套于各种类型质谱的接口乃至液质专用机纷纷被开发上市。
ESI的用途十分广泛，例如药物及其在体内代谢成分的分析检测、有机合成化学中间体的分析鉴定、大分子多肽化合物的分子量检测、氨基酸测序及结构研究以及分子生物学等许多重要的研究和生产领域，并以其如下的特点得到了广泛的认可。
（1）高的离子化效率。
对蛋白质而言接近100%。
（2）多种离子化模式供选择。
ESI（+）、ESI（-）、APCI（+）、APCI（-）。
（3）由于蛋白质中含有多个羧基以及氨基等官能团，理论上可以带多个电荷。
因此，可以测量的蛋白质分子量可达几十万甚至上百万。
（4）ESI的电离方式相对较“软”，很好的解决了热不稳定性化合物分析检测的难题。
（5）气动辅助电喷雾技术为实现与大流量（约1mL/min）的HPLC联机使用提供了可能。
（6）仪器专用化学站的开发使得仪器在调试、操作、HPLC-MS联机控制、故障自诊断的各方面都变得简单可靠。
12.3液相色谱-质谱联用技术
近几年，高效液相色谱-质谱接口技术的不断发展和完善，使HPLC-MS的应用领域越来越广泛。
HPLC与串联质谱联用可在一级质谱（MS）条件下获得很强的待测物准分子离子峰，并可借助MSn（n=2~10）对准分子离子进行多级裂解，从而获得丰富的化合物碎片信息，以判断化合物的结构，辨认重叠色谱峰以及在背景或干扰物存在的情况下对目标化合物定量分析。
近年来，LC-MSn（n=1~10）在药物分析、食品检测、农药残留等领域的应用发展十分迅速。
12.3.1液相色谱-质谱联用的方法原理
HPLC-MS是利用液相色谱作为质谱的进样系统，使复杂的化学组分得到分离；
利用质谱作为检测器进行定量和定性分析。
12.3.1.1高效液相色谱法的基本原理
色谱法作为一种分离分析方法，其最大的特点在于能将一个复杂的混合物分离为各个有关的组成，然后一个个的检测出来。
那么究竟这一过程是怎么发生的呢？
是什么原因促使不同物质得以分离？
一般而言，色谱过程中不同组分在相对运动、不相混溶的两相间进行交换，相对静止的一相称为固定相，另一相对运动的相称流动相，利用吸附、分配、离子交换、亲和力或分子大小等性质的微小差别，经过连续多次在两相间的质量交换，使不同组分得到分离。
根据填充材料和分离原理的不同，液相色谱法主要可分为吸附色谱、分配色谱、凝胶色谱、离子色谱四大类。
12.
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