《化工原理》实验教学大纲Word格式.docx
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实验成绩评分办法：
实验技能占40%，实验态度占20%，实验报告
占20%，实验室常识占20%。
四、实验项目一览表
生物化学与分子生物学综合实验项目一览表
序
实验类型
实验要
求
适用专业
学
时
号
实验项目名称
1
蛋白质含量测定（考马斯亮蓝G-250法）
设计性
必做
农科类、植保、工程类
3
蛋白质含量测定（双缩脲法）
2
蛋白质含量测定（Folin酚试剂法）
蛋白质含量测定（紫外吸收法）
淀粉酶活力测定
综合性
6
4
质粒DNA的提取
5
质粒DNA的琼脂糖凝胶电泳分析
聚合酶链式反应（PCR）技术及电泳检测
7
SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定蛋白
质分子量
五、实验项目的具体内容
实验一蛋白质含量测定（考马斯亮蓝G-250法）
1、本次实验的目的和要求
学习和掌握考马斯亮蓝G-250法测定蛋白质含量的原理和方法。
比较不同方法测定蛋白质含量的异同。
2、实验内容或原理
考马斯亮蓝G-250在游离状态下呈棕褐色，当它与（浓度0~100卩g/ml）蛋白质结合呈蓝
色，颜色随蛋白质浓度的增加而加深，在595nm波长下光吸收和蛋白质浓度成正比。
3、需用的仪器和试剂
试管、离心管、研钵、移液管、离心机、分光光度计、牛血清白蛋白、考马斯亮蓝G-250
4、实验步骤
标准曲线的配制、样品中蛋白质的提取、结果与计算
5、教学方式
学生为主，教师辅助，充分预习，独立完成。
6、考核要求
以出勤、随堂提问、实验报告和预习报告为主要考核内容。
7、实验报告要求
实验报告应包括下列各项：
（1）报告的题目（要简明确切）；
（2）写报告人及共同测定人员的姓名；
（3）实验目的；
（4）实验原理；
（5）实验仪器和试剂（包括主要仪器的规格、主要试剂的名称）；
（6）实验数据记录（包括原始数据记录表格和整理后的数据记录表格）；
（7）实验结果。
明确提出本次实验的结论，用公式计算。
（8）分析与讨论，要对实验结果做出估计，分析误差大小及原因，对实验中发现的问题应进行讨论，对实验方法、实验设备有何改进建议也可写入此栏；
（9）回答思考题。
实验二蛋白质含量测定（双缩脲法）
1、本次实验的目的和要求
学习和掌握双缩脲法测定蛋白质含量的原理和方法。
比较不同方法测定蛋白质含量的异同。
碱性溶液中双缩脲（NH2-C0-NH-C0-NH）能与Cu2+产生紫红色的络合物，这一反应称为“双缩脲反应”。
蛋白质分子中的肽键也能与铜离子发生双缩脲反应，溶液紫红色的深浅与蛋白质含量在一定范围内符合朗伯-比尔定律，而与蛋白质的氨基酸组成及分子质量无关。
其可测定范围为1〜10mg蛋白质，适用于精度要求不高的蛋白质含量测定。
Tris，—些氨基酸，
EDTA等会干扰该测定。
试管、离心管、研钵、移液管、离心机、分光光度计、牛血清白蛋白、双缩脲试剂、NaOH
5、教学方式学生为主，教师辅助，充分预习，独立完成。
6、考核要求以出勤、随堂提问、实验报告和预习报告为主要考核内容。
7、实验报告要求实验报告应包括下列各项：
（1）报告的题目（要简明确切）；
（2）写报告人及共同测定人员的姓名；
（5）实验仪器和试剂（包括主要仪器的规格、主要试剂的名称）；
实验三蛋白质含量测定（Folin酚试剂法）
掌握Folin-酚法测定蛋白质含量的原理方法，熟悉分光光度计的操作。
比较不同方法测定蛋白质含量的异同。
Folin-酚法测定蛋白质含量的过程包括两步反应:
第一步是在碱性条件下蛋白质与
CuSQ作用生成络合物，第二步是此络合物还原Folin试剂（磷钼酸和磷钨酸试剂），生成深蓝色的化合物，且颜色深浅与蛋白质的含量成正比关系。
该方法灵敏度高于双缩脲法100倍。
3、需用的仪器和试剂
分光光度计、水浴锅、试管、具塞试管、小烧杯、漏斗及架、电子天平、吸管、容量瓶、滤纸、玻棒、研钵、离心机、离心管、Folin-酚试剂
4、实验步骤
7、实验报告要求
实验四蛋白质含量测定（紫外吸收法）
1、本次实验的目的和要求学习用紫外吸收法测定蛋白质含量。
熟悉分光光度计的操作。
比较不同方法测定蛋白质含量的异同。
蛋白质分子中的酪氨酸、色氨酸和苯丙氨酸等残基在280nm波长下具有最大的吸收。
由
于各种蛋白质中都含有酪氨酸，因此280nm的吸光度是蛋白质的一种普遍性质。
在一定程度
上，蛋白质溶液在280nm吸光度与其浓度成正比，故可用作蛋白质定量测定。
3、需用的仪器和试剂紫外分光光度计，离心机，电子天平，研钵，容量瓶，刻度吸管
（1）取4ml的豆菜提取液，在紫外分光光度计上，于280nm和260nm波长下分别测其吸光度。
（2）根据公式计算出蛋白质含量：
蛋白质（卩g/ml）=（1.45A280-0.74A26。
）X稀释倍数
（8）分析与讨论，要对实验结果做出估计，分析误差大小及原因，对实验中发现的问题
应进行讨论，对实验方法、实验设备有何改进建议也可写入此栏；
实验五淀粉酶活力测定
学习酶活力测定的一般方法，巩固并熟练分光光度计的使用。
淀粉酶主要包括a-淀粉酶、B-淀粉酶、葡萄糖淀粉酶和R-酶。
a-淀粉酶随机作用于
直链淀粉和支链淀粉的直链部分a-1,4糖苷键，单独使用时最终生成寡聚葡萄糖、a-极
限糊精和少量葡萄糖。
它比较耐热但不耐酸，pH3・6以下可使其钝化。
淀粉酶从非还原端作用于a-1,4糖苷键，遇到支链淀粉的a-1,6键时停止。
单
独作用时产物为麦芽糖和极限糊精，70C保温15min可使其钝化。
通常提取液中a-淀粉酶和B-淀粉酶同时存在。
可以先测定（a+B）淀粉酶总活力，然后在70C加热15min钝化B-淀粉酶，测出a-淀粉酶活力，用总活力减去a-淀粉酶活力，就可求出B-淀粉酶活力。
淀粉酶活力大小可用其作用于淀粉生成的还原糖与3，5-二硝基水杨酸的显色反应来测
定。
还原糖作用于黄色的3，5-二硝基水杨酸生成棕红色的3-氨基-5-硝基水杨酸，生成物
颜色的深浅与还原糖的量成正比。
以每克样品在一定时间内生成的还原糖（麦芽糖）量表示酶活力大小。
电子天平、研钵、容量瓶、具塞刻度试管、吸管、离心机、恒温水浴、分光光度计
1%淀粉溶液、柠檬酸缓冲液、NaOH、3，5-二硝基水杨酸、麦芽糖标准液（1mg/ml）
（1）酶液提取
称取2g萌发3天的小麦种子（芽长1cm左右）,置研钵中加少量石英砂和2ml左右蒸馏水，研成匀浆，无损地转入100ml容量瓶中，用蒸馏水定容至100ml。
每隔数分钟振荡1次，提取20min。
3000r/min离心10min，转入上清液备用。
（2）标准曲线的制作
取25ml刻度试管7支，编号。
分别加入麦芽糖标准液（1mg/ml）0、0.1、0.3、0.5、0.7、0.9、1.0ml，然后用吸管向各管加蒸馏水使溶液达1.0ml，再各加3，5-二硝基水杨酸试剂1.0ml,置沸水煮沸5min。
取出冷却，用蒸馏水稀释至12.5ml。
混匀后用分光光度计再520nm波长下进行比色，记录吸光度。
以吸光度为纵坐标，以麦芽糖含量（mg）为横坐标，
绘制标准曲线。
（3）a-淀粉酶活力测定
1取试管4支，标明2支为对照管，2支为测定管。
2于每管中各加酶液1ml,在70C恒温水浴中准确加热15min，钝化B-淀粉酶。
取出后
迅速用流水冷却。
3在对照管中加入4ml0.4mol/L氢氧化钠。
4在4支试管中各加入1mlpH5.6的柠檬酸缓冲液。
5将4支试管置另一个40C0.5C恒温水浴中保温15min，再向各管分别加入40C下预热的1%淀粉溶液2ml，摇匀，立即放入40C恒温水浴准确记时保温5min。
取出后向测定管
迅速加入4ml0.4mol/L氢氧化钠，终止酶活动，准备测糖。
（4）淀粉酶总活力测定
取4支试管编号，2支为对照，2支为测定管。
然后加入提取的酶液1ml。
在对照管加入4ml0.4mol/L氢氧化钠。
4支试管中各加1mlpH5.6的柠檬酸缓冲液。
以下步骤重复a-淀粉酶测定第⑸步的操作，同样准备测糖。
（5）样品的测定：
取步骤2,3中酶作用后的各管溶液1ml,分别放入相应的4支25ml具
塞刻度试管中，各加入1ml3，5—二硝基水杨酸试剂。
以下操作同标准曲线制作。
根据样品比色吸光度，从标准曲线查出麦芽糖含量，最后进行结果计算。
实验六质粒DNA的提取
通过该实验使学生掌握质粒培养的方法，条件（包括培养基的配制、灭菌、接种、培养）、以及提取质粒的方法。
从大肠杆菌中提取质粒DNA勺方法很多，其中的碱性SDS法提取质粒是基于染色体DNA与质粒DNA的变性与复性存在差异而予以分离的。
在强碱性条件下，染色体DNA和质粒DNA
均变性（双链解开）。
由于质粒DNA是共价闭合环状超螺旋结构，变性后两条互补链不会完全
分开。
当溶液pH调节到中性时，质粒DNA容易复性并溶解在溶液中，而染色体DNA不容易
复性，互相缠绕，在离心时极易和蛋白质-SDS复合物等一起沉淀下来。
转移出上清液，再用乙醇沉淀出其中的质粒DNA。
以具有质粒pETblue-2的大肠杆菌实验材料，用碱性SDS法可从该菌体中提取到质粒
DNA经琼脂糖凝胶电泳可以检测出。
3、需用的仪器和试剂高压蒸汽灭菌锅、超净工作台、恒温振荡摇床、台式高速离心机、真空干燥器、低温冰箱、恒温水浴、移液器、LB培养基、羧苄青霉素（Carb）、四环素（tet）、TE、溶
液I、溶液n、溶液川、无水乙醇、70比醇
（1）先在3mLLB液体培养基中加入3uL羧苄青霉素（Carb,终浓度50ug/mL）和7.5uL四环素（Tet,终浓度12.5ug/mL），然后接入一个含pETBIue—2质粒的大肠杆菌单菌落，37C190r/min振荡培养过夜。
（2）将过夜培养的菌液加入1.5mL小指管管中，4000r/min离心1分钟，吸去培养液将所有菌体细胞收集在一个小指管中。
（3）加入100卩L溶液I于含菌体细胞的小指管中，旋涡振荡将细菌沉淀悬浮，室温放置10分钟。
（4）加入200卩L溶液II（新鲜配制），轻轻混匀内容物，将小指管置于冰上使菌液裂解变清（不可用旋涡震荡器）。
（5）加入150卩L溶液III（冰上预冷）,盖紧管口，轻轻混匀数次。
冰上放置15分钟让质粒DNA复性（不可用旋涡震荡器）。
（6）12000r/min离心10分钟，将上清转至另一1.5mL小指管中。
（7）向上清中加入等体积酚：
氯仿：
异戊醇（去蛋白和脂类），旋涡混匀，12000r/min离心5分钟，将上清转移到另一1.5mL小指管中。
（8）向上清中加入等体积氯仿：
异戊醇（去微量酚和脂类），旋涡混匀，12000r/min离心5分钟，将上清转移到另一1.5mL小指管中。
（9）向上清中加入2倍体积无水乙醇，旋涡混匀后，室温放置30分钟。
12000r/min离心10分钟，吸去上清液。
（10）用1mL75%乙醇洗涤质粒DNA沉淀两次（每次12000r/min离心5分钟），吸去上清液，真空抽干或空气中干燥。
（11）加20卩LTE，使质粒DNA完全溶解，—20C保存。
6）实验数据记录（包括原始数据记录表格和整理后的数据记录表格）；
7）实验结果。
明确提出本次实验的结论
8）回答思考题。
实验七质粒DNA的琼脂糖凝胶电泳分析
掌握电泳鉴定的基本操作技术，为从事基因工程和分子生物学研究奠定初步基础。
琼脂糖凝胶电泳适于分离鉴定200〜20000bp的核酸片段。
在中性pH条件下，核酸带负
电荷，在电场中向正极移动，电泳后，核酸在凝胶中的位置通过“染色”来显现。
GoldView是一种可代替溴化乙锭的新型核酸染料，其灵敏度与EB相当，使用方法与之
完全相同，当与DNA吉合后，在紫外透射光下双链DNA呈现黄色荧光，由于未发现GoldView有致癌作用，且灵敏度与EB相当，将有可能逐渐取代EB而得以广泛应用。
琼脂糖、标准分子质量DNA、上样缓冲液（6Xloadingbuffer）、TAE、GoldView电泳仪、水平电泳槽、移液器
（1）将有机玻璃内槽，洗净，晾干，用橡皮膏将有机玻璃内槽的两端边缘封好（一定封
严，不能留缝隙）。
（2）将有机玻璃内槽放置于水平位置，并放好样品梳子。
（3）将称取0.25g琼脂糖放入三角瓶中，加入25mL1XTAE,用封瓶膜封住三角瓶的上口，在微波炉中将琼脂糖溶化。
（4）待冷到60C左右的琼脂糖凝胶液时，加入2卩LGoldView核酸染料，轻轻混匀，将混匀的胶液缓缓倒入有机玻璃内槽,直至有机玻璃板上形成一层均匀的胶面（注意不要形成气泡）
（5）待胶液凝固后,取下橡皮膏,将机玻璃内槽放入电泳槽内。
（6）加入电泳缓冲液（1XTAE）至电泳槽中使缓冲液刚好没过胶平面，轻轻取出梳子。
（7）加样：
DNA样品中按照5:
1的比例添加6X凝胶加样缓冲液（loading-buffer），混合均匀，用移液枪将DNA样品加入样品孔中。
（记录点样顺序及点样量）。
（8）电泳：
接通电泳槽与电泳仪的电源,恒压80V（注意正负极,DNA片段从负极向正
极移动）。
DNA的迁移速度与电压成正比，最高电压不超过5V/cm。
当溴酚蓝指示剂移动到
距凝胶前沿1〜2cm处,停止电泳。
（9）254nm紫外灯下观察DNA条带的完整性及亮度。
学生为主,教师辅助,充分预习,独立完成。
明确提出本次实验的结论；
（8）回答思考题。
实验八聚合酶链式反应（PCR）技术及电泳检测
了解PCR实验原理及操作技术，讲授引物设计的原则，观看PCR课件
PCR是一种在体外扩增的DNA的技术，其基本原理是通过高温使双链DNA解旋成单链，然后退火，使特征引物与互补序列配对，最后在TaqDNA聚合酶的作用下合成DNA片段，经多次循环，直至产生足够的DNA片段。
Khorana等早在1971年就提出PCR概念，但直到1988年Saiki等从真细菌ThurmasaquticusrT1中开发出热稳定的TaqDNA聚合酶并实现PCR技术的完全自动化后，PCR才在生命科学研究领域被广泛用来扩增DNA片段。
PCR技术可在一个酶促反应中产生大量已知序列的DNA片段，简化了克隆、鉴定、修饰核酸等程序。
正是因为具有如此快速、简便、经济、高效的特点，使得PCR技术成为分子生物学研究强有力的技术工具。
酶：
来源TaqDNA聚合酶最适温度90多度，但那时其半衰期短不足以支持30个循环。
所以选择72C作为延伸温度足以支持30个循环。
DNA片段快速扩增的方法：
即通过引物在DNA聚合酶的作用下，延伸核酸某个区域而引起的双向DNA合成。
反应物含有：
（1）模板：
阳性对照
（2）Taq酶：
（3）引物1
（4）引物2
（5）dNTPs（dATP、dCTP、dGTP、dTTP）
（6）电极缓冲液TAE:
Tris-乙酸
（7）buffer缓冲液含有：
20-24个核苷酸，40%-50%的鸟苷酸、胞苷酸，以及反应所需
的MgCl2。
反应的过程:
变性、扩增、复性、延伸
PCR仪、水平电泳槽、恒压电泳仪、加样器、封口膜、PCR管、台式高速离心机、紫
外检测仪、10XPCR反应液、、中性dNTP、引物1、引物2、DNA模板、Taq酶（2.5U/卩I）、
电泳缓冲液（1xTAE）、琼脂糖、Goldview、DNAMarkers（标准DNA
PCR扩增目的基因（碱性磷酸酶AKP
（1）在0.2mLPCR管内配制50卩L反应体系
2.5mmol/LdNTPMixture4uL10xPCRbuffer5uL
10umol/mLsense2uL
10umol/mLanti-sense2uL
模板DNA1uL
Ex-Taq1uL（1U）
ddH2O35uL
2）按下述程序进行扩增
1）
94
C
预变性
分钟
2）
变性
3）
55
退火
4）
72
延伸
5）
重复步骤
一4）30次
6）
C延伸
10
分钟。
（3）琼脂糖凝胶电泳分析PCR结果。
配制0.8％琼脂糖凝胶
30mL（1xTAE,力口1.5ulGoldView。
50卩LPCR扩增产物+6uL10xloading-bufer+6uLSYBR核酸染料，混匀，全部上样电泳，恒压80V。
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