elisa酶联免疫吸附实验报告docx文档格式.docx

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ELISA法是免疫诊断中的一项新技术，现已成功地应用于多种病原微生物所引起的传染病、寄生虫病及非传染病等方面的免疫诊断。

也已应用于大分子抗原和小分子抗原的定量测定，根据已经使用的结果，认为ELISA法具有灵敏、特异、简单、快速、稳定及易于自动化操作等特点。

不仅适用于临床标本的检查，而且由于一天之内可以检查几百甚至上千份标本,因此，也适合于血清流行病学调查。

本法不仅可以用来测定抗体，而且也可用于测定体液中的循环抗原，所以也是一种早期诊断的良好方法。

因此ELISA法在生物医学各领域的应用范围日益扩大，可概括四个方面：

1、免疫酶染色各种细胞内成份的定位。

2、研究抗酶抗体的合成。

3、显现微量的免疫沉淀反应。

4、定量检测体液中抗原或抗体成份。

基本方法一　用于检测未知抗原的双抗体夹心法:

　　1.　包被：

用0.05MPH9.牰碳酸盐包被缓冲液将抗体稀释至蛋白质含量为1～10μg／ml。

在每个聚苯乙烯板的反应孔中加0.1ml，4℃过夜。

次日，弃去孔内溶液，用洗涤缓冲液洗3次，每次3分钟。

（简称洗涤，下同）。

　　2.　加样：

加一定稀释的待检样品0.1ml于上述已包被之反应孔中，置37℃孵育1小时。

然后洗涤。

（同时做空白孔，阴性对照孔及阳性对照孔）。

　　3.　加酶标抗体：

于各反应孔中，加入新鲜稀释的酶标抗体（经滴定后的稀释度）0.1ml。

37℃孵育0.5～1小时，洗涤。

　　4.　加底物液显色：

于各反应孔中加入临时配制的TMB底物溶液0.1ml，37℃10～30分钟。

　　5.　终止反应：

于各反应孔中加入2M硫酸0.05ml。

　　6.　结果判定：

可于白色背景上，直接用肉眼观察结果：

反应孔内颜色越深，阳性程度越强，阴性反应为无色或极浅，依据所呈颜色的深浅，以“+”、“-”号表示。

也可测O•D值：

在ELISA检测仪上，于450nm（若以ABTS显色，则410nm）处，以空白对照孔调零后测各孔O•D值，若大于规定的阴性对照OD值的2.1倍，即为阳性。

基本方法二　用于检测未知抗体的间接法：

用包被缓冲液将已知抗原稀释至1～10μg／ml，每孔加0.1ml，4℃过夜。

次日洗涤3次。

↓

加一定稀释的待检样品（未知抗体）0.1ml于上述已包被之反应孔中,置37℃孵育1小时,洗涤。

（同时做空白、阴性及阳性孔对照）

于反应孔中，加入新鲜稀释的酶标第二抗体（抗抗体）0.1ml，37℃孵育30-60分钟，洗涤,最后一遍用DDW洗涤。

其余步骤同“双抗体夹心法”的4、5、6。

（二）酶与底物

酶结合物是酶与抗体或抗原,半抗原在交联剂作用下联结的产物。

是ELISA成败的关键试剂，它不仅具有抗体抗原特异的免疫反应，还具有酶促反应，显示出生物放大作用，但不同的酶选用不同的底物。

免疫技术常用的酶及其底物

酶底物显色反应测定波长

辣根过氧化物酶邻苯二胺橘红色492*

四甲替联苯胺黄色460**

氨基水杨酸棕色449

邻联苯甲胺兰色425

2,2＇-连胺基-2（3-乙基-并噻唑啉磺酸-6）铵盐蓝绿色642

碱性磷酸酯酶4-硝基酚磷酸盐（PNP）黄色400

萘酚-AS-Mx磷酸盐+重氮盐红色500

葡萄糖氧化酶ABTS+HRP+葡萄糖黄色405,420

葡萄糖+甲硫酚嗪+噻唑兰深蓝色

β-Ｄ－半乳糖苷酶甲基伞酮基半乳糖苷（4MuG）荧光360,450

硝基酚半乳糖苷（ONPG）黄色420

*终止剂为2mol/LH2SO4

**终止剂为2mol/L柠檬酸，不同的底物有不同的终止剂。

可催化下列反应：

HRP+H2O2→复合物复合物+AH2→过氧化物酶+H2O+AAH2——为无色底物,供氢体；

A——为有色产物。

（三）ELISA常用的四种方法

1．直接法测定抗原

将抗原吸附在载体表面；

加酶标抗体，形成抗原—抗体复合物；

加底物。

底物的降解量＝抗原量。

2．间接法测定抗体

将抗原吸附于固相载体表面；

加抗体,形成抗原-抗体复合物；

加酶标抗体；

测定底物的降解量＝抗体量。

3．双抗体夹心法测定抗原

将抗原免疫第一种动物获得的抗体吸附于固相表面;

加抗原，形成抗原-抗体复合物;

加抗原免疫第二种动物获得的抗体，形成抗体抗原抗体复合物;

加酶标抗抗体（第二种动物抗体的抗体）;

4.竞争法测定抗原

将抗体吸附在固相载体表面;

（1）加入酶标抗原；

（2）,（3）加入酶标抗原和待测抗原；

对照孔与样品孔底物降解量的差＝未知抗原量。

三．仪器和材料

1.聚苯乙烯微量细胞培养板（平板,40,96孔）。

2.酶联免疫检测仪

3.辣根过氧化物酶羊抗兔IgG,工作稀释度1:

1000。

4.包被液:

：

0.05mol/LpH9.6碳酸缓冲液,4℃，保存,　Na2CO30.15克,NaHCO30.293克,蒸馏水稀释至100ml。

5.稀释液：

0.01mol/LpH7.4PBS－－Tween－－20,４℃，保存.NaCl8g,KH2PO40.2g,Na2HPO4.12H2O2.9g,Tween—20，0.5ml.蒸馏水加至1000ml。

6.洗涤液：

同稀释液

7.封闭液：

0.5%鸡卵清蛋白，pH7.4PBS。

8.邻苯二胺溶液（底物）：

临用前配制0.1M柠檬酸（2.1g/100ml）,6.1ml0.2MNa2HPO4.12H2O　（7.163g/100ml）　6.4ml,蒸馏水12.5ml,邻苯二胺10mg,溶解后,临用前加30%H2O240微升。

9.终止液：

2mol/LH2SO4。

四.操作步骤

1.包被抗原：

用包被液将抗原作适当稀释,一般为1～10微克/孔，每孔加200微升，37℃温育1小时后，4℃冰箱放置16～18小时。

2.洗涤：

倒尽板孔中液体，加满洗涤液，静放三分钟，反复三次，最后将反应板倒置在吸水纸上，使孔中洗涤液流尽。

3.加封闭液200微升，37℃放置一小时。

4.洗涤同2。

5.加被检血清：

用稀释液将被检血清作几种稀释,，每孔200微升。

同时作稀释液对照。

37℃放置2小时。

6.洗涤同2。

7.加辣根过氧化物酶羊抗兔IgG,每孔200微升,放置37℃1小时。

8.洗涤同2。

9.加底物：

邻苯二胺溶液加200ml，室温暗处10－－15分钟。

10.加终止液：

每孔50微升。

11.观察结果：

用酶联免疫检测仪记录490nm读数。

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考试知识点技巧大全

一、考试中途应饮葡萄糖水

大脑是记忆的场所，脑中有数亿个神经细胞在不停地进行着繁重的活动,大脑细胞活动需要大量能量。

科学研究证实,虽然大脑的重量只占人体重量的2%-3%,但大脑消耗的能量却占食物所产生的总能量的20%,它的能量来源靠葡萄糖氧化过程产生。

据医学文献记载,一个健康的青少年学生30分钟用脑,血糖浓度在120毫克/100毫升,大脑反应快,记忆力强；

90分钟用脑，血糖浓度降至80毫克/100毫升，大脑功能尚正常；

连续120分钟用脑，血糖浓度降至60毫克/100毫升，大脑反应迟钝，思维能力较差。

我们中考、高考每一科考试时间都在2小时或2小时以上且用脑强度大，这样可引起低血糖并造成大脑疲劳，从而影响大脑的正常发挥，对考试成绩产生重大影响。

因此建议考生，在用脑60分钟时，开始补饮25%浓度的葡萄糖水100毫升左右，为一个高效果的考试加油。

二、考场记忆“短路”怎么办呢？

对于考生来说，掌握有效的应试技巧比再做题突击更为有效。

1.草稿纸也要逐题顺序写草稿要整洁，草稿纸使用要便于检查。

不要在一大张纸上乱写乱画，东写一些，西写一些。

打草稿也要像解题一样，一题一题顺着序号往下写。

最好在草稿纸题号前注上符号，以确定检查侧重点。

为了便于做完试卷后的复查，草稿纸一般可以折成4-8块的小方格，标注题号以便核查，保留清晰的分析和计算过程。

2.答题要按先易后难顺序不要考虑考试难度与结果，可以先用5分钟熟悉试卷，合理安排考试进度，先易后难，先熟后生，排除干扰。

考试中很可能遇到一些没有见过或复习过的难题，不要蒙了。

一般中考试卷的题型难度分布基本上是从易到难排列的，或者交替排列。

3.遇到容易试题不能浮躁遇到容易题，审题要细致。

圈点关键字词，边审题边画草图，明确解题思路。

有些考生一旦遇到容易的题目，便觉得心应手、兴奋异常，往往情绪激动，甚至得意忘形。

要避免急于求成、粗枝大叶，防止受熟题答案与解题过程的定式思维影响，避免漏题，错题，丢掉不该丢的分。

4.答题不要犹豫不决选择题做出选择时要慎重，要关注题干中的否定用词，对比筛选四个选项的差异和联系，特别注意保留计算型选择题的解答过程。

当试题出现几种疑惑不决的答案时，考生一定要有主见，有自信心，即使不能确定答案，也不能长时间犹豫，浪费时间，最终也应把认为正确程度最高的答案写到试卷上，不要在答案处留白或开天窗。

5.试卷检查要细心有序应答要准确。

一般答题时，语言表达要尽量简明扼要，填涂答题纸绝不能错位。

答完试题，如果时间允许，一般都要进行试卷答题的复查。

复查要谨慎，可以利用逆向思维，反向推理论证，联系生活实际，评估结果的合理性，选择特殊取值，多次归纳总结。

另外，对不同题型可采用不同的检查方法。

选择题可采用例证法，举出一两例来能分别证明其他选项不对便可安心。

对填空题，则一要检查审题;

二要检查思路是否完整;

三要检查数据代入是否正确;

四要检查计算过程;

五要看答案是否合题意;

六要检查步骤是否齐全，符号是否规范。

还要复查一些客观题的答案有无遗漏，答案错位填涂，并复核你心存疑虑的项目。

若没有充分的理由，一般不要改变你依据第一感觉做出的选择。

6、万一记忆短路可慢呼吸考试中，有些考生因为怯场，导致无法集中精神，甚至大脑忽然一片空白，发生记忆堵塞。

此时不要紧张，不妨尝试如下方式：

首先是稳定心态，保持镇静，并注意调节自己的呼吸率。

先慢吸气，当对自己说放松时缓慢呼气，再考虑你正在努力回忆的问题，如果你仍不能回想起来，就暂时搁下这道题，开始选做其他会的试题，过段时间再回过头来做这道题。

第二，积极联想。

你不妨回忆老师在讲课时的情景或自己的复习笔记，并努力回忆与发生记忆堵塞问题有关的论据和概念，把回忆起的内容迅速记下来，然后，看能否从中挑出一些有用的材料或线索。

第三，进行一分钟自我暗示。

即根据自己的实际，选择能激励自己，使自己能心情平静和增强信心的话，在心中默念3至5遍。

比如：

我已平静下来，我能够考好、我有信心，一定能考出理想的成绩等等。

第四，分析内容，查找相关要点。

借助试卷上其它试题，也许会给考生提供某些线索。

因此不要轻易放弃，查看试题中的相关要点，看看是否能给考生提供线索或启发。