《冠心病患者血浆同型半胱胺酸水平和氧化应激指标的相关性Word文档格式.docx
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二、项目涉及的相关技术在国内外的研究现状和发展趋势
1995年,Boushey等[5]分析了总人数为4666例,27个分布在西方国家有关同型半胱氨酸与动脉硬化性血管疾病关系的多个临床试验,结果显示大约10%的冠心病由高同型半胱氨酸血症所致。
血浆总同型半胱氨酸水平每升高5umol/L,则冠心病危险性男性增加60%,女性增加80%,相对危险性男性为1.6,女性为1.8,相当于总胆固醇每升高20mg/dL的危险性,因此,高同型半胱氨酸血症成为冠心病的一个独立危险因素。
血浆同型半胱氨酸水平还与冠心病患者的远期预后、生存率、死亡率有关。
Nygard等[6]对587例经血管造影确诊的冠状动脉疾病患者进行了同型半胱氨酸与死亡率之间关系的前瞻性研究,平均随访4.6年,其间64例死亡。
结果发现血浆同型半胱氨酸升高与死亡率之间存在很强的分级相关性。
将同型半胱氨酸水平<
9umol/L的患者作为参照组,则同型半胱氨酸水平在9.0～14.9umol/L的患者死亡率为其1.9倍;
在15.0～19.9umol/L患者死亡率为其2.8倍;
测定值≥20.0umol/L者死亡率为4.5倍（P=0.02）。
研究表明,血浆同型半胱氨酸水平是一个强有力的死亡预测因素。
Hey是一种含羟基的氨基酸，大约80%的血浆Hcy为蛋白结合型，只有一小部分是以自由还原型的形式存在，与蛋白结合的大部分Hcy又氧化形成同型半胱氨酸或与半胱氨酸形成二硫化合物。
体内的Hcy经过以下的途径进行转归。
首先是再甲基化转变为蛋氨酸，这时主要是N5—甲基四氢叶酸提供甲基，并经过蛋氨酸合成酶的催化，其辅酶是VitB12；
其次hcy在胱硫醚β合成酶的催化下与丝氨酸形成胱硫醚，胱硫醚经过一系列的转化，最终进入三羧酸循环，演变为葡萄糖。
在胱硫醚途径中，两个关键的酶是胱硫醚β合成酶和硫醚酶，二者均是VitB12依赖性的酶。
有关高同型半胱氨酸血症致动脉粥样硬化的机制,目前尚未完全阐明。
但是,近年来研究发现,同型半胱氨酸可损伤内皮细胞,促进平滑肌细胞的增殖,改变血液系统的抗凝状态及血小板功能等。
由此可以看出,同型半胱氨酸参与了动脉粥样硬化斑块形成的各个阶段。
1、损伤血管内皮。
在动脉粥样硬化形成的病理形态学过程中,Ross提出的内皮损伤学说认为,血管内皮损伤是动脉粥样硬化的始动因素。
目前研究发现[7],血中同型半胱氨酸水平的升高可直接或间接导致血管内皮细胞的损伤。
2、一氧化氮（NO）绝对及相对不足。
正常内皮细胞产生NO与同型半胱氨酸反应,生成S2亚硝基硫,继而生成S2亚硝基高半胱氨酸,从而阻止同型半胱氨酸巯基自氧化作用产生的过氧化物,保护内皮细胞的完整性。
由此可见,NO可缓解同型半胱氨酸的病理作用。
因此,高同型半胱氨酸血症也被认为与NO的相对缺乏有关,然而确切机制不清,同型半胱氨酸可能通过减少NO的合成来降低NO的生物活性,或通过产生氧自由基,超氧化物或H2O2[8]来提高一氧化氮的降解,或通过提高脂质氧化,损伤NO合成酶而直接减少一氧化氮生成[9,10]。
由于NO相对或绝对缺乏,导致未被NO结合的游离同型半胱氨酸损伤内皮细胞,而受损的内皮细胞产生的NO更少,形成恶性循环,最终导致细胞变性坏死。
3、Hcy对凝血机制的影响。
血管内膜通过释放NO、前列环素、纤维酶原激活因子等，再通过内皮细胞表面表达凝血酶调节蛋白C以及抗凝血酶Ⅲ途径来维持血管的抗血栓形成状态，正常血管内膜的促凝和抗凝机制处于动态平衡状态，但Hcy可以破坏这种平衡。
表现在：
（1）、刺激促凝血因子的生成；
（2）．Hcy抑制抗凝血机制；
（3）．Hcy对纤溶机制有损伤作用。
4．Hcy具有黏附和聚集血小板的效应。
同型半胱氨酸可抑制内皮细胞ADP酶的活性,致使ADP降解减少。
ADP的增多可活化血小板,从而增加血小板的聚集,提高血液的凝固性[11]。
高HCY致病的确切机制目前尚未完全清楚，可能与其氧化产生大量中间产物如自由基和过氧化氢等抑制了血管内皮细胞一氧化碳的合成和释放，从而导致血管功能异常、血管内皮细胞受损。
HCY抑制超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（GPx）的活性，削弱了其阻止NO氧化失活的作用，增强了脂质过氧化物与过氧化氢的细胞损伤效应，从而加速了动脉粥样硬化、动脉血栓的形成[12]。
自由基是指最外层轨道上有未配对电子的原子、分子、离子或基团。
其化学活性高，不稳定，具有较强的氧化能力。
由氧衍生的自由基称氧自由基（OFH），通常包括超氧阴离子自由基O2-，羟自由基OH一和过氧化氢H202。
生物体内，自由基作用于脂质发生过氧化反应，氧化终产物为丙二醛，会引起蛋白质、核酸等生命大分子的交联聚合，且具有细胞毒性。
在正常生理情况下，体内需要利用的自由基或维持在低水平有利无害的动态生理浓度，并且生物体内存在着内源性自由基清除系统，如超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（GPx）以及内源性防止氧自由基生成的维生素C、E等，可以保护细胞免受氧自由基及脂质过氧化的损伤。
GSH-Px、SOD是机体内广泛存在的一种重要的过氧化物分解酶。
使有毒的过氧化物还原成无毒的羟基化合物，同时促进H202的分解，从而保护细胞膜的结构及功能不受过氧化物的干扰及损害。
因此，体内不会有更多的自由基积累，保持动态平衡，维持集体正常代谢，故GSH-Px、SOD活性越高越好。
自由基病理学是只有体内失控的，不正常的自由基反应所引起的病理过程，随着研究的不断深入，人们认识到，OFR诱发的细胞损伤是许多梗死性疾病的病理生理基础。
关于HCY与冠心病之间的关系在近年来的研究中，结论各不相同。
CHY升高应关于其动脉粥样硬化发生的可能性[13]。
积极采取有效措施，通过适当减少蛋白摄入、降低血清CHY，对预防和治疗CHD有积极作用。
HCY水平升高，可能引起血脂代谢异常对HCY与血脂水平及在CHD中有密切关系，对临床的诊断与治疗具有积极意义[14]。
参考文献
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三、研究开发的主要内容、关键技术及创新点
（一）研发主要内容
对拟诊为冠心病的患者行冠状动脉造影检查（分组为稳定性心绞痛组，不稳定心绞痛组，急性心肌梗死组，冠脉造影正常组），测定各组患者血浆同型半胱氨酸（HCY）、氧自由基、丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（GPx）水平，分析与血浆同型半胱氨酸水平的相关性。
（二）关键技术：
冠脉造影和氧化应激指标的检测技术。
（三）创新点：
经自检国内医疗卫生两大专业数据库（同方、万方），未发现不同临床类型的冠心病患者血浆同型半胱氨酸（HCY）与氧自由基、丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（GPx）水平测定的相关性文献报告。
四、项目预期目标（主要技术、经济指标和社会效益，知识产权目标、科研成果和发表论文等）
1.入选不同类型的冠心病患者120例；
2.完成对120例冠心病患者血浆同型半胱氨酸和氧化应激指标（氧自由基、丙二醛、超氧化物歧化酶、谷胱甘肽过氧化物酶）的测定；
3.完成HCY和氧化应激指标的相关性分析，为冠心病患者的风险评估、治疗、预后提供科学依据。
4.参加学术交流1-2次，在2级以上专业期刊发表论文3篇。
五、研究方案、技术路线、组织方式与项目组成员分工
（一）研究方案：
1.研究对象：
（1）诊断标准：
以2009年中国冠心病防治指南为诊断标准。
（2）纳入标准：
选择正常对照组：
详细询问病史并经体检与实验室检查（心电图、超声心动图、x线胸片检查和临床生化指标）均正常。
选择本院门诊和住院冠心病患者，分为稳定性心绞痛组、不稳定心绞痛组、急性心肌梗死组。
（3）排除标准：
排除严重脑血管系统、消化系统与营养不良性疾病患者。
2.实验对照类型：
同期平行对照（组间对照）。
3.标本量及分组：
正常对照组40例；
冠心病患者共120例，分为稳定性心绞痛组、不稳定心绞痛组、急性心肌梗死组，每组40例。
4.各组病例临床基线情况：
各组患者年龄、性别、基础疾病（高血压、糖尿病、血脂等）等没有明显统计学差异。
5.冠脉造影操作方法：
每支血管都至少进行2个体位以上（2个体位之间在90°
左右）的造影。
冠脉造影使用的机器是飞利浦公司大平板数字DSA机。
由两位以上经验丰富的心血管专家（副主任医师以上）判断冠状动脉的病变。
6.观察指标及检测方法:
（1）血浆HCY测定：
受检对象于上午6时空腹抽取2ml血液置入含有2％乙二胺四乙酸二钠10ml的试管内，离心的血浆标本置—30℃冷藏。
待血浆标本收集全后参照Jacobsen报导的方法稍作改良，测定血浆Hcy。
血浆Hcy测定采用岛津LC一9A型高效液相色谱仪，反相分析柱为碳18．5um（250．0rm×
4．6H肌内径），萤光检测仪为岛津RF535，激发波长为385nm，发射波长为515m；
所用流动相为0．1mol磷酸二氢钾（以正磷酸调至PH2．1），含10％乙月青。
（2）血脂、血糖测定：
甘油三酯（TG）、总胆固醇（TCH）、高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）、低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）。
血脂测定用速率法，仪器为BeckrnanLX20型全自动生化分析仪，试剂为东瓯生物工程有限公司提供。
（3）SoD、GPx、MDA、氧自由基测定：
SOD测定采用黄嘌呤氧化酶法，GPx采用同酶速法测定。
MDA测定采用硫代巴比妥法（TBA法），氧自由基测定用酶标仪法。
试剂盒为南京建成公司和台湾康华先进生物技术医药公司产品。
7．质量控制措施：
冠脉造影严格按照操作规程进行。
血浆HcY、SoD、GPx、MDA、氧自由基等检测严格按照试剂提供的操作说明书进行。
8.设计病例观察表（见附件）。
9.医院医学伦理委员会审查：
可行性报告提交医院医学伦理委员会审批。
10．统计学处理：
将患者检测结果进行统计分析，剔除吸烟、年龄、血脂、血糖等干扰因素，所有数据采用SPSS13.0软件进行分析，<
0.05为差异有统计学意义。
2.技术路线图（见下页）
3.组织方式：
以心血管内科为主持，检验科参与，共同完成。
4.项目组成员分工
表1项目组成员分工
姓名
性别
年龄
专业技术
职务、职称
专业
在本项目
中的分工
成员一
成员二
成员三
成员四
成员五
成员六
成员七
男
女
37
57
54
39
35
34
37
副主任医师
主任医师、教授
主治医师、研究生
主管技师
心血管内科
检验科
项目统计、介入操作、组织实施、总体分析
病例收集、临床研究
质量控制、数据分析
数据收集
图像、数据处理
统计分析
实验室数据检测
技术路线图
六、项目计划进度安排
2012年4月-2013年3月购买相关设备及制剂；
选择不伴有严重肝、肾、肺、脑及其它疾病的门诊和住院冠心病患者及正常对照组患者。
血浆HCY测定、SoD、GPx、MDA、氧自由基测定、血脂测定。
2013年4月-2013年9月检测结果进行统计分析，剔除干扰因素，所有数据采用SPSS13.0软件进行分析，<
2013年10月-2014年4月资料分析，总结撰写论文，申请验收。
七、现有的工作基础和条件
1．研究对象来源：
研究对象来自于本院门诊和住院患者。
2.项目负责人的工作经历、科研能力：
项目负责人从事心内科工作10余年，近8年来致力于心脏介入治疗及其并发症的研究，曾于2008年10月-2009年9月在浙江大学医学院附属第二医院心内科进修学习，在心脏介入治疗方面积累了丰富的经验。
3.研究团队的情况：
2001年本院心血管内科最先开展（全市范围）经皮冠状动脉造影术、经皮冠状动脉介入治疗术（PCI），以后逐渐开展埋藏式心脏起搏器植入术（包括单腔和双腔）、射频消融治疗室上性心动过速，目前能独立完成左主干病变、慢性闭塞病变、分叉病变等高难度的冠状动脉介入治疗手术，为本研究的开展提供保障。
科室有着较强的科研力量，曾以第一完成单位获得省医药科技创新奖三等奖二项，市科技进步奖三等奖一项，发表专业论文十余篇，积累了一定的科研经验。
4.研究所需要的设备、状况。
冠脉造影使用的机器是省内最先进的飞利浦公司生产的大平板数字DSA机。
血浆Hcy测定采用岛津LC一9A型高效液相色谱仪。
生化仪器为BeckrnanLX20型全自动生化分析仪。
5.医院支持：
院领导重视科研，配套经费有保障。
八、科研经费预算
科技计划项目经费预算表
项目名称：
冠心病患者血浆同型半胱胺酸水平与氧化应激指标的相关性研究金额单位：
万元
序号
预算科目名称
合计
财政经费
自筹经费
1
一、经费支出（合计）
10.00
5.00
2
1、设备费
2.00
3
（1）购置设备费
1.00
4
（2）试制（改造）设备费
5
（3）设备租赁费
6
2、材料费
4.00
7
3、测试化验加工费
8
4、燃料动力费
0.30
9
5、差旅费
0.50
10
6、会议费
0.40
11
7、合作/协作研究与交流费
0.00
12
8、出版/文献/信息传播/知识产权事务费
13
9、人员劳务费
14
10、专家咨询费
15
11、中期检查和验收费
16
12、管理费
17
13、其他开支项（填写具体科目）
二、经费来源（合计）
1、申请财政经费获得的资助
2、自筹经费来源
（1）配套财政拨款
（2）单位自有货币资金
（3）其他资金
财政科技经费拨付进度申请
第1年
第2年
第3年
金额
比例（％）
100
注：
支出预算按照经费开支范围确定的支出科目和不同经费来源编列，同一支出科目一般不同时在财政拨款经费和自筹经费中预算。
支出预算应在预算说明中对各项支出的主要用途和测算理由等进行详细说明。
经费概算说明：
设备费2万元，主要用于生化仪、DSA机的改造、租用、放射防护用品购买；
材料费及测试化验加工费共6万元，主要用于试剂购买及生化指标的测定；
燃料动力费0.3万元，差旅费0.5万元，会议费0.4万元，主要用于参加相关学习班及会议；
出版/文献/信息传播/知识产权事务费0.4万元，主要用于文献检索，论文版面费等；
专家咨询费0.4万元。
临床病例观察表
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