鲍曼不动杆菌基因组全序列的研究Word文档格式.docx

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探究鲍曼不动杆菌多重耐药性及高耐药率的原因，有：

1）鲍曼不动杆菌主要在医院感染标本中检出，而医院感染病原体耐药性较高；

2）与广谱高档抗菌药使用有关，在鲍曼不动杆菌检出之前，几乎90%的病人使用过广谱抗菌药物；

3）与细菌本身耐药有关，鲍曼不动杆菌被称为“革兰氏阴性的MRSA”，对多种抗生素具有天然耐药性，其主要耐药机制是外膜微孔蛋白形成的通道小，从而导致外膜通透性低，抗菌药物不易进入。

其多重耐药性和高耐药率给治疗带来了一定困难，导致较高的病死率。

鲍曼不动杆菌具有显著的快速建立耐药性的能力，几十年内就可以建立多重耐药。

目前鲍曼不动杆菌的耐药性日益严重，其中的部分菌株甚至对目前所有已知的抗生素均耐药，即“全耐药”的鲍曼不动杆菌。

本实验的研究研究目的是鲍曼不动杆菌基因组的全序列。

利用基因测序技术测得鲍曼不动杆菌的基因组序列，利用软件进行缺失片段（gap）的拼接与组装，设计缺失片段的引物，利用引物进行PCR扩增反应，从而得到缺失片段的碱基和碱基数，从而得到鲍曼不动杆菌基因组完整的序列。

通过后期的基因组注释，分析这一条由数百万个4种碱基对线性排列而成的长链所包含的遗传信息，从而研究鲍曼不动杆菌的耐药机制，发现预防和治疗鲍曼不动杆菌引发的各种疾病的措施。

二、参考文献

[1]李影林主编．临床微生物学及检验[M]．长春：

吉林科学技术出版社，1991，309~310．

[2]DevaudM,KayserFH,BachiB.Transponson-mediatedmultipleantibioticresistanceinacinetobcterstrains[J].AntimicrobAgentsChemother,1982,22

（2）:

32-33.

[3]VilaJ,MarcosA,MarcoFetal.Invitroantimicrobialproductionofβ-lactamsesaminoglvcoside-modifyingenzymesandchloramphcnicolacctyltransfcrascbyandsuseptibilityofclinicalisolatesofacinetobacterbaumannii[J].AntimicrobAgentsChemother,1993,37

（1）:

138.

[4]ObaraM,NakaeT.Mechanismsofresistancetoβ-lactamantibioticsinacinetobactercalcoaceticus[J].JAntimicrobChemother,1991,28（6）:

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[5]吴劲松，卢月梅，吴伟元等．鲍曼不动杆菌的感染分布及耐药性分析[J]．中国感染控制杂志，2004，3（3）：

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[6]王凌伟，陈升汶．不动杆菌微生物学耐药研究新进展[J]．国外医药抗生素分册．2004，25（3）：

134—137．

[7]练向群，林亚雷，刘丁等．重复片段引物PCR用于鲍曼不动杆菌分型研究[J]．第三军医大学学报，2002，24（4）：

437—438．

[8]张军民，吴坚，陈民钧等．鲍氏不动杆菌5年耐药性监测结果分析[J]．中华医学检验杂志,1999，22

（1）：

512-513．

三、设计（研究）内容和要求

本实验的研究目标是利用基因测序技术、PCR技术等确定鲍曼不动杆菌基因组的全序列，从而进一步研究鲍曼不动杆菌的致病机制。

本实验的研究内容是利用primerprimer5.0设计PCR引物的方法和原则，设计出GC含量、Tm值、引物长度等符合实验要求的引物；

然后进行PCR扩增反应，根据引物设计的结果设计反应体系和反应条件，扩增后得到产量高，特异性强的PCR产物，通过对PCR产物的测序，根据测序后的序列和基因组图谱拼接出缺失片段的碱基，从而得到完整的鲍曼不动杆菌的基因组全序列。

本实验的关键在于引物设计的好坏，PCR反应体系和反应条件的优化以及基因组缺失片段的拼接和根据图谱对gap的碱基判断。

指导教师（签字）

年月日

审题小组组长（签字）

课题名称

学院名称

专业名称

学生姓名

指导教师

一、本课题的来源及研究意义

鲍曼不动杆菌（Ab）是医院感染的重要病原菌，近年来的感染也在增多，且耐药性日益严重，已引起临床和微生物学者的严重关注。

多重耐药性和全耐药性鲍曼不动杆菌的出现已成为人类健康的一大威胁。

自从人类基因组计划提出和实施后，基因测序技术有了快速迅猛的发展。

基因测序仪器的改进和发展为人类基因组和微生物基因组的测序提供了很大的技术支持，也在人类研究和探寻疾病起源和治疗方面起到了重要的作用。

因此，结合本课题，利用基因测序技术对鲍曼不动杆菌进行基因组全序列测序，在结合先进的PCR技术可以完整的得到该细菌基因组的全序列，从而为进一步研究析这一条由数百万个4种碱基对线性排列而成的长链所包含的遗传信息，探究鲍曼不动杆菌致病的内在机制，为医学上预防和治疗该细菌提供初期的准备。

二、国内外的研究情况

自1991年纽约首次爆发多重耐药的鲍曼不动杆菌（MDR-Ab）感染后，该菌的耐药性日益严重。

2000年，来自SENTRY的调查显示，该菌对一线药物碳氰霉烯类的耐药率从2%上升至46%~54。

这一事件成为全球性的标志事件。

“泛耐药”的鲍曼不动杆菌，对所有常规检测的抗菌药物均耐药。

此后该菌的耐药性仍在飞速进展，1998年台湾国立大学医院分离出对目前常规检测的药物全耐药的不动杆菌，称之为泛耐药菌（PDR-Ab）。

到2002年共治疗30名感染“全耐药”鲍曼不动杆菌败血症患者，死亡18人。

“全耐药”鲍曼不动杆菌肺炎和败血症患者死亡率高达60%。

自此，这一种菌株在全球迅速增加。

该菌的耐药并非偶然，他与细菌耐药变迁的总体趋势一致。

目前研究认为获得MDR-Ab感染的危险因素主要与患者病情严重程度、治疗干预程度、免疫力、基础心肺功能、接受多种侵袭性操作、机械通气、广谱抗生素使用等有关，这些决定了他在院内的分布以ICU、血液、移植、烧伤等病房多见。

它主要引起医院获得性肺炎尤其是呼吸机相关性肺炎、菌血症、尿路感染、脑膜炎等，其中在机械通气患者中引起的下呼吸道感染已越来越受到临床的关注。

该菌耐药变迁的重要意义在于：

对碳氰霉烯类的耐药将意味着同时多种抗生素耐药。

不仅如此，随着PDR-Ab的出现，将有可能把我们真正推向无药可治的地步，故近年来掀起了如何应对这一挑战的热潮。

2002年12月在我国台湾从住院患者的呼吸道分泌物中分离出1株“全耐药”鲍曼不动杆菌，具有独特的生物型。

此后的三个月内又从7里患者的各种标本中（主要是呼吸道）分离出15株。

此类菌的体外协同敏感试验，只有亚胺培南与氨苄西林、舒巴坦间有协同作用。

为了解决治疗问题，研究者用2种和3种药物的体外联合药敏试验，发现多粘菌素B和亚胺培南及利福平间有协同作用，多粘菌素B、亚胺培南和利福平三者间也有协同作用，且均有协同杀菌作用。

这为临床治疗危重患者提供了新的可选方案。

三、本课题的研究目标

本实验的研究目标是在基因测序技术基础上，利用PCR技术完成鲍曼不动杆菌基因组的全序列，从而为进一步研究鲍曼不动杆菌的致病机制和预防与治疗提供初期的准备。

四、本课题的研究内容和研究方法

1.PCR引物的设计

根据引物设计的原则和注意事项，利用primerprimer5.0设计基因组序列中缺失片段的引物。

2.PCR产物的获得

根据PCR引物的特点进行PCR反应体系和反应条件的设计和优化，进行PCR扩增反应后，将PCR产物进行核酸电泳，确定PCR产物的优劣。

3.缺失碱基的序列测定

将PCR引物和PCR产物送往测序，得到测序序列和碱基图谱。

4.缺失片段的碱基拼接

通过测序结果得到的碱基序列和图谱，并结合PCR引物，利用相关软件拼接处此处gap所缺失的碱基片段。

五、进度安排

进度安排

1.三月初至三月中旬：

查阅文献，准备实验所需的各种菌种，设计引物。

2.三月中旬之四月初：

确定PCR反应的反应体系和反应条件。

3.四月初至六月底：

开始PCR反应和测序，同时进行缺失片段的拼接。

5.六月底：

撰写毕业论文。

六、实验方案的可行性分析

本实验的研究目的在于通过设计实现PCR反应正常进行的Tm值和GC含量等的PCR引物，并利用PCR反应扩增DNA片段，得到相符合的PCR产物，然后将PCR产物进行DNA测序，最后利用测序序列和图谱，拼接出缺失片段gap处的碱基。

本实验涉及的PCR反应的各种技术设备和软件都可以很好的为本实验的进行提供支持。

故基于此分析，本实验方案可行。

七、实验已具备的条件

本实验的理论基础和实验技术都已成熟，并且已具备了实验所用的所有实验及实验试剂，即：

PCR仪，电子天平，15000X离心机，核酸电泳仪，超净台，高压蒸汽灭菌锅，干燥箱,紫外成像仪。

NaCl，蛋白胨，酵母提取物，琼脂糖等。

八、主要参考文献

选题是否合适：

是□否□

课题能否实现：

能□不能□

摘要

鲍曼不动杆菌（Acinetobacterbaumanii）是条件致病菌，属于不动杆菌属的一个菌种，是一种不发酵糖类、氧化酶阴性、不能运动的革兰氏阴性杆菌。

当机体抵抗力降低时，本菌可引起呼吸道感染、败血症、脑膜炎、心内膜炎、伤口及皮肤感染、泌尿生殖道感染等。

重症者可导致死亡。

因此，解释鲍曼不动杆菌的致病机制以及其基因组信息是预防和治疗该菌引起的疾病的一种重要手段。

鉴于此，本文旨在通过利用PCR技术对鲍曼不动杆菌基因组序列片段进行拼接，进而得到其完整的基因组全序列。

本课题利用前期测序实验测得的鲍曼不动杆菌的基因组序列片段，通过拼接和组装，找出该序列中缺失片段（gap）的位置和大小，然后根据PCR引物设计原则和注意事项利用primerprimer5.0进行各gap的PCR引物设计,引物设计的要求是引物长度在15-30碱基之间，引物GC含量在40%~60%之间，Tm值最好接近72℃；

引物自身及引物之间不应存在互补序列；

引物应具有高度特异性。

本实验共设计了39对PCR引物，然后进行PCR扩增反应。

最终扩增出32个gap，然后将PCR产物送北京奥科生物技术有限公司进行DNA测序，根据测序得到的碱基序列和NCBI数据库中的参考序列进行比对，最终将测序得到的基因组片段连接在一起，从而得到鲍曼不动杆菌基因组的全序列信息。

关键词：

鲍曼不动杆菌；

PCR；

DNA测序；

序列比对

ABSTRACT

Acinetobacterbaumanniiareopportunisticpathogens,belongtoagenusAcinetobacterspecies,itisanon-fermentedsugar,oxidasenegative,Gram-negativebacillicannotcampaign.Whenbodyresistanceislowered,thebacteriacancauserespiratorytractinfections,septicemia,meningitis,endocarditis,woundandskininfections,urinaryandreproductivetractinfections,etc。

Severecanleadtodeath。

InInrecentyears,AcinetobacterbaumanniipulmonaryinfectioncausedbythegradualincreaseintheemergenceofmultipledrugresistanceortotalresistanceinAcinetobacterbaumannii.Therefore,theinterpretationofAcinetobacterbaumanniipathogenicmechanismandthegenomicinformationispreventionandtreatmentofdiseasescausedbybacteriaisanimportantmeans.Inviewofthis,thepaperaimstodesignPCRreactionAcinetobacterbaumanniigenomesequence.

Thesubjectofpre-sequencingexperimentsusingthemeasuredAcinetobacterbaumanniigenomesequencetoidentifythemissingsequencefragment（gap）thelocationandsize,andthenPCRprimerdesignprinciplesandconsiderationsforthegapusingprimerprimer5.0ThePCRprimerdesign.Primerdesignrequirementisthatprimers15-30basesinlengthbetweentheprimerGCcontentof40%to60%,Tmvalueascloseto72℃;

primeritselfandthereshouldbecomplementaritybetweentheprimersequence;

primersshouldhighlyspecific.Theexperimentsweredesigned39pairsofPCRprimersandthenPCRamplification.Finalamplified32gap,andthensendDNAsequencingPCRproducts.AccordingtobasesequenceandthesequenceobtainedinthereferencesequenceNCBIdatabasetocompareandultimatelysequencingthegenomefragmentsarelinkedtobyAcinetobacterbaumanniigenomesequenceinformation.

Keyword：

Acinetobacterbaumannii；

PCR；

DNAsequencing；

SequenceAssembly

目　　录

致谢

第一章文献综述

1.1鲍曼不动杆菌的生物学特性

鲍曼不动杆菌（Acinetobacterbaumanii）是条件致病菌，属于不动杆菌属的一个菌种，它是一种不发酵糖类、氧化酶阴性、不能运动的革兰氏阴性杆菌。

当机体抵抗力降低时易引起机体感染，是引起医院内感染的重要机会治病菌之一。

本菌可引起呼吸道感染、败血症、脑膜炎、心内膜炎、伤口及皮肤感染、泌尿生殖道感染等。

多见于老年人和婴幼儿。

通常在水和土壤中出现，由于该菌一般只引起免疫功能下降者生病，因此常被认为是非致病菌或条件致病菌。

近年来，鲍曼不动杆菌引起的肺部感染逐渐增多，常引起住院患者和抵抗力明显降低者的肺部感染。

特别是慢性阻塞性肺病、呼吸道防御机能下降、支气管清除能力减弱或支气管肺癌致支气管阻塞时，易导致鲍曼不动杆菌的继发感染。

鲍曼不动杆菌也可以引起伤口感染。

严重的鲍曼不动杆菌感染可引起败血症，甚至导致死亡。

鲍氏不动杆菌有两大难题：

一是引起医院内感染，给患者带来雪上加霜的严重并发症；

二是它常对多种抗菌药物耐药，这给治疗带来了很大的困难。

1.2鲍曼不动杆菌的耐药机制

ouvet通过DNA杂交研究将不动杆菌属（Acinetobacter）分为6种，即醋酸钙不动杆菌（A.calcoaceticus）、鲁菲不动杆菌（A.lwoffi）、鲍曼不动杆菌（A.baumanii）、溶血不动杆菌（A.haemolytius）、琼氏不动杆菌（A.junii）和约翰逊不动杆菌（A.johnsonii）[1]。

不动杆菌的致病机理为条件致病菌。

药敏试验结果表明，不动杆菌对多种抗生素耐药，其中多重耐药株占大部分，同时同种菌株对同一抗生素的敏感性也有差异。

造成该菌对多种抗生素耐药的原因主要是该菌含有多种耐药机制，主要有以下几个方面：

（1）修饰酶的产生，包括β-内酰胺酶[2]及氨基糖苷类钝化酶[3]。

（2）胞浆膜的通透性改变，外膜微孔数量减少引起通透性障碍[4]。

（3）耐药基因的传播，不动杆菌极易以质粒结合方式获得耐药性，常有多种耐药质粒共存，转座子在不动杆菌的耐药基因胞内重组上也起了重要作用。

另外抗生素在医院内的广泛、大量、不规范使用也是细菌耐药率增加及多重耐药菌株不断出现的原因之一。

Ab主要引起呼吸道感染，也引发败血症、泌尿系感染、继发性脑膜炎等。

Ab在医院的环境中分布很广且易长期存活，对危害患者和冠心病监护病房（CCU）及重症监护病房（ICU）中的患者威胁很大，也将此类感染称为ICU获得型感染。

该菌临床分布以重症监护病房（ICU）多见[5]，已成为院内感染的主要病原菌之一，常可引起ICU、烧伤病房、新生儿室等院内感染的暴发和流行。

目前鲍曼不动杆菌的耐药性日益严重，国内耐碳青霉稀类的鲍曼不动杆菌发展最快，其中的部分菌株甚至对目前所有已知的抗生素均耐药，即“全耐药”的鲍曼不动杆菌[6]（Pandrugresistantacinetobacterbaumanii），在台湾以及内地均已出现，应引起高度警惕。

国内资料表明，Ab约占临床分离的不动杆菌的70%以上。

Ab对第三代和第四代头孢菌素的耐药率已达63.0%~89.9%。

对四种氨基糖苷类（阿米卡星、庆大霉素、奈替米星、妥布霉素）和环丙沙星的耐药率已达96.3%。

我国目前的绝大多数菌株对亚胺培南、美罗培南、头孢哌酮、舒巴坦和多粘菌素B保持敏感，但在呼吸道感染的治疗中效果较差。

1.3鲍曼不动杆菌多重耐药性及高耐药率的原因

基因型和耐药性有一定得相关性，菌株获得耐药基因成分如质粒、转座子等使得耐药性高的同时，基因型的条带也多而复杂[7]。

1）鲍曼不动杆菌主要在医院感染标本中检出，而医院感染病原体耐药性较高；

2）与广谱高档抗菌药使用有关，在鲍曼不动杆菌检出之前，几乎90%的病人使用过广谱抗菌药物；

3）与细菌本身耐药有关，鲍曼不动杆菌被称为“革兰氏阴性的MRSA”，对多种抗生素具有天然耐药性，其主要耐药机制是外膜微孔蛋白形成的通道小，从而导致外膜通透性低，抗菌药物不易进入[8]。

其多重耐药性和高耐药率给治疗带来了一定困难，导致较高