TaqMan实时荧光定量RT.docx

TaqMan实时荧光定量RT.docx

《TaqMan实时荧光定量RT.docx》由会员分享，可在线阅读，更多相关《TaqMan实时荧光定量RT.docx（60页珍藏版）》请在冰豆网上搜索。

TaqMan实时荧光定量RT

ＴaqMan实时荧光定量RT-PCＲ检测ERCC1变异剪接体检测平台的建立

前言

对一个基因的各个变异剪接体分别进行精确定检测是深入研究变异剪接的基础。

在ＴａqＭａｎ实时荧光定量RＴ-ＰCR技术（　TaqMaｎreal-timequantity　RT-PＣR）出现前，传统的检测方法有4种［1,2]：

（１）Noｒthｅrnbｌot;

（2）核酶保护分析;（3）相对定量RT-PＣR,（4）竞争定量ＲT-PCＲ这些方法都有其内在的局限性。

Nortｈｅrｎｂloｔ耗时,随时面临ＲNＡ降解的困扰，而且灵敏度不高，需要相对大量的RNA才能检测出来，仅仅适合相对定量分析[3］。

核酶保护分析比Northｅrｎ　blｏｔ相对灵敏，但是仍然耗时而且需要相对大量的RNA才方便检测[4-8]。

相对定量RＴ-ＰCＲ则需要在每个反应的指数扩增期停止反应后进行凝胶电泳分析，由于每个样本的起始拷贝数不一致，很难确保每个样本均处于相同的指数扩增期。

而且此方法需要将PCR产物进行琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶电泳分析，增加了步骤，而且增加了污染的可能性[9]。

竞争定量RT-PＣR则需要根据不同的目的基因片断构建相应的竞争子，然后需要确定每个反应体系中竞争子和目的基因的不同比例，不仅仅耗时而且繁琐,更重要的是竞争子的构建不仅仅需要很大的技巧性,而是是一件极其艰难的工作[１0,11]。

这些传统技术不仅繁琐耗时,而且对mＲＮＡ的质量要求较高,结果不稳定。

而且，这些传统的方法由于方法学上的差异性,导致研究结果不十分可靠,各研究机构之间的结果差异较大。

应用TaqMan实时荧光定量ＲT-PＣR技术则可以分别精确检测各个变异剪接体的表达量,结果稳定，可重复性高，方便快捷，程序简单，无需后续处理,几无污染［1,12-１4］。

本研究拟建立对切除修复交叉互补基因1即EＲCC1（eｘcisionｒepaircroｓs-ｃomｐleｍenｔationｇroup1）变异剪接体的TａqMａｎ实时荧光定量RT－ＰＣR检测平台,为深入研究ＥＲＣＣ1的变异剪接奠定基础［１5]。

TａqＭaｎ实时荧光定量RT-PCR技术的基本原理是通过设计与目的序列互补的一段寡核苷酸作为TaｑMan探针，在此探针的5’端标记报告基团（如FＡＭ），在3’端标记淬灭基团（如ＴAMＲA）。

当探针完整时,报告基团所发射的荧光通过荧光共振能量传递（ＦRET）被淬灭基团所吸收，从而不能检测到其荧光。

Taq酶则具有５’外切酶活性，在PＣR的延伸阶段，可以从探针的5’端将报告基团水解掉，并将整个探针完全水解,使得报告基团和淬灭基团的原有空间结构被打散,荧光共振能量传递不复存在,从而可以探测到反应体系中报告基团所发射的荧光。

随着PCＲ循环的增加，荧光也不断的累加,从而反映产物的生成情况[16-1８]。

在研究变异剪接时,只需要将TaｑMａn探针设计在发生了变异剪接的外显子的前后邻近两个外显子处,即跨在前一个外显子的末端和后一个外显子的前端，便可检测到目的变异剪接体的表达量。

在不同的探针上标记不同的荧光物质，便可以在同一个反应体系中同时检测各个变异剪接体的表达量[12，１9-21]。

变异剪接（ａlｔernaｔiｖe　splｉcｉng）是真核生物中广泛存在的一个现象[２2-27]，可以调节基因的表达水平[２８],增加蛋白质的多样性[2９，３0],并对肿瘤的生物学行为有很大的影响[2２，　27,31-34]，和肺癌[13]、乳腺癌[35-3７]、卵巢癌等的发生发展存在一定的关系。

ＥRCC1是核酸切除修复系统NＥR（ｎuclｅotidｅexcisionreｐair）的一个关键基因,在以铂类为基础的化疗中扮演着重要角色。

铂类药物通过与细胞DＮA形成加合物（Pt-DNAadduｃts）从而杀伤肿瘤细胞，NEＲ则可以通过切除加合物并修复被损伤的DNＡ,从而降低化疗的效果。

研究表明ERCC１的ｍRNＡ表达量与　肿瘤患者的化疗敏感性和生存时间具有一定的相关性[38]。

EＲＣC1基因共１０个外显子，细胞中存在不同比例的两种形式的剪接体,为含10个外显子的全长剪接体mＲNＡ（fuｌl　lenｇth,FL），和缺失第VＩII外显子（长72ｂp），仅含９个外显子的变异剪接体mRNＡ（aｌtｅrnａtivｅsｐliｃinｇ,AS）［３９－41］。

1ERＣＣ１基因结构特征分析（文章写作不规范，[ERCC１基因结构特征分析］一节是属于材料方法，还是前言部分?

我认为这部分ERCC1在GenBank的背景，可以放在综述里）

根据GenBａnk数据库提供的信息，ERＣC１基因ＩD为ＧeneID:

2067,位于１９号染色体长臂，处于１9q13.2－ｑ13．3位置。

ERCＣ1在染色体的位置：

chromosome:

1９；Loｃation:

１９q13.2-ｑ13.３

ＯfficialＳyｍbolERCC1　and　Nａｍe:

　excｉsiｏn　rｅpairｃrｏss-coｍplementingｒodeｎt　repair　dｅfｉcｉency,compｌｅmentaｔiｏn　ｇroup１　（includesｏverlappingaｎｔisense　ｓｅquｅnce）[Hoｍo　sapｉens]

OthｅrAliases:

　COFＳ4,ＵV20

Other　Ｄesｉgｎatiｏnｓ:

excｉsｉoｎrepａircroｓｓ-cｏｍplｅmeｎtiｎg１；exｃisiｏnrepairprotein

Chromoｓome:

19;Location:

1９q13.2-q13．3

Annoｔａtion：

Chｒomosoｍe1９,NＣ_０00０19．8（５060４７12．.５0６19０17,compleｍｅnｔ）

MIM：

１263８0

ＧｅneID:

　２067

EＲＣＣ1是研究比较多的基因，ＥＲCC1在染色体的位置图可以在文章中不列出,而且ERCC1基因的染色体位置,与其外显子剪切无关。

基因组全长14３0６　bp,转录为含有10个外显子的ｍＲNA全长为１101bp，编码氨基酸的mRNA序列从147开始至１０40结束，共计894ｂp是编码氨基酸的序列，以ATG作为起始密码子,以ＴＧＡ作为终止密码子（任何一个蛋白质都是与ATＧ为起始密码子，以TGA作为终止密码子,这句多余）。

产物ＥRＣC１蛋白含２97个氨基酸。

编码核酸序列占基因组核酸的6.25%。

每个外显子的长度在10０bp左右，最长外显子是第IＩI外显子，长2１6ｂp，最短外显子是第IＸ外显子,长69ｂp,平均外显子长度是1１０bp。

ＥＲＣC１基因内含子与外显子的序列

ＥxoｎsandIntronofＥRＣC1Gene

成熟的全长ERCC１mＲNA含有10个外显子,全长１101bp，从１至1４６ｂp是3’非编码区3’UTR（3’　uｎtrａnslateｄregiｏｎ），从1041到１101是5’非编码区５’ＵＴＲ　（5’untranｓｌatedregion）

ERＣC1基因mRＮA的结构分析

Ｔhe　sｔrｕcｔureofERＣC１　mRNA

使用BLASＴ在人基因组和转录子库里面比对ERＣC1的mRNＡ序列,可以发现ERＣC1的mRＮＡ序列是非常特异的。

（在人基因组和转录子库里比对，应用的是贪婪比对法则，而且只与人的基因组比对,当然只有ERＣC1可比对，这些与外显子检测无关,可删除）

ERCC１基因的BLASTA同源性比对

Homｏｌｏｇyｏf　ＥRＣＣ1ｇｅnｅ　usiｎgBLASTＡsoftware（删除）

第八外显子7２bp序列

GTＧACTGAATGＴCTGAＣＣAＣCＧTGAAGTＣAGTCAACAAAACGGACAGＴCAGACＣCTCCTＧＡＣＣACAＴTTＧＧA

２.EＲＣC1全长及缺失第ＶIII外显子变异剪接体TA质粒的构建（这一节属方法部份,放到方法里）

试验流程如下：

２.1　材料与试剂

2.1．1　标本

标本组织来源来自正常卵巢组织（标本来源单位,时间，何种病人,正常人是不可能被切卵巢的）,标本切下后迅速置于液氮中保存直至提取RNA时取出。

质粒与菌株

大肠埃希菌（DH－5à）EsｃｈerichiaColｉ，E.Coli为本实验室保存留种。

pMD18－T　TＡ克隆质粒够自日本Takarａ公司[４2,４3]。

其结构如下：

ｐMD１8-T质粒结构和酶切位点示意图

Thｅsｔructｕre　andenｚymesite　of　pMD18-ＴVｅｃtｏｒ

2.1.2　主要仪器

超速低温离心机　　德国西门子公司（本实验室没有该品牌）

TGL-１6C台式高速离心机　　　上海安亭科学仪器厂

Gelｄoc　20０0凝胶成像分析系统　美国Bio-Rad公司（本实验室没有该品牌）

紫外可见分光光度计　　　　北京普析通用仪器有限责任公司

PCＲ扩增仪　　　美国热电公司Therｍoeｌeｃtｒoncorpｏrａtion

电动玻璃匀浆机　　　　宁波玻璃仪器厂

　　OLYMPUS光学显微镜　　　　　　　日本OLYMＰUS公司

恒温水浴箱　　　　　　　国产

冰浴加样盒　　　　　　国产

桥式水平电泳仪槽　　　　　　　　北京崇文东方仪器厂

　　　DＹY－型稳压稳流电泳仪　　　　　北京六一仪器厂

　　　　　Eppendorｆ管　　　　　国产

　　　微量移液器　　　　　　美国Gilson公司

　　超低温冰箱　　　　中国海尔公司

荧光定量ＰCＲ管0．2ｍl－－-－-－-－------薄壁美国Cepｈeiｄ公司Ｓｍartcyclｅr　？

?

？

／

2．１.3试剂　

（1）TＲｉzol试剂　购自Inviｔrｏgen公司

（2）FiｒstＳtrand　cDNASynthesiｓKｉt逆转录试剂盒购自MBIＦerｍｅｎtas公司，内含：

M-Mｕlｖ　反转录酶

Oliｇo（dT）1８　（0.５μg／μl）

高浓度dＮTP１0ｍＭｄＮＴP

RNA酶抑制剂Rnａｓiniｎhibitoｒ

5×reactｉonｂuｆfer

（3）Ｔaq　ＰCRMasteｒＭix购自TIＡNGＥN生物有限公司

（４）DNＡ片段纯化回收试剂盒　购自日本宝生物ＴａKaＲａ公司

　（5）氨苄青霉素贮存液（1０0μg／mｌ）　-２0℃保存备用

（6）LＢ培养基:

NaCｌ10g;　Yeasｔeｘtｒａct5g;Tryｐｔｏｎe　　1０g;加蒸馏水溶解,用５ＭNａOH调至7.0,定容至10００ｍｌ,高压灭菌消毒20miｎ。

若加氨苄青霉素到终浓度为1０0μg/mｌ则为AMP（＋），不加氨苄青霉素为AＭP（-）。

（７）SOＣ培养基:

Trｙpｔone2．0g；Yｅastｅｘtrａｃt0.5ｇ；NａＣl0.05ｇ；０.25ＭKCl1．0ｍl;5M　NaＯH调节ＰＨ值至7.０，加蒸馏水至100ｍｌ,高压消毒。

使用前加入２mol／ＬＭgCl20．５ml和1M葡萄糖2mｌ（过滤除菌）。

（8）感受态细胞制备CaCｌ２:

　连云港润泰化工有限公司

（9）LB培养板:

营养琼脂１5ｇ,加LB培养基1０0ｍl,高压灭菌，冷却至5０℃-６0℃时，加入氨苄青霉素使终浓度为100μｇ/ml,每只无菌平皿中（直径φ10ｃm）倒入１５mｌ，超净台中紫外灯照射下冷却，即为Amp（+）,同时制备不含氨苄青霉素的LB培养板,为Amp（-），作为对照使用。

（10）ＤL20０0DＮＡＭa