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2.数量：
每种植物至少有15种微生物；
3.微生物催化作用于数量有关；
4.微生物功能在微观上，但可以在宏观上看出来；
5.代谢多样性，它几乎能参与地球上所有的反应，微生物代谢远远超过动植物；
6.微生物有营养、捕食者及对环境变化的耐受决定种群的数量级地位；
7.微生物易变化；
8.一种必须元素可以决定生境中的微生物；
9.营养（有限营养）可以限制微生物生长；
10.微生物之间的竞争。
8、微生物生态学3个基本问题：
1.生态系统中微生物的功能？
2.生态系统中微生物数量？
3.生态系统中微生物种类？
9、可培养微生物：
可以重复地在受控条件下以一个确定的方式生长。
10、未培养微生物:
从自然界分离出来却不能通过实验室培养大量繁殖的微生物。
这些微生物通过现有的实验室技术，没有找到合适的培养条件。
11、未培养微生物的研究策略：
1.元基因组
2.高通量培养技术
12、微生物分离培养：
1.“寡营养”技术和方法：
1.普通培养基：
一般长得快；
2.稀释培养基：
一般长得好。
数量、种类也不一般。
2、PCR-引导的微生物菌种分离培养。
13、“未培养微生物”
内涵：
–生理/生态功能未知，没有相应培养技术。
可能代表一大类微生物；
–生理/生态功能已知，具有培养技术，但尚未获得培养，目前分离报道的多数菌种属于此类；
–“未培养菌株”：
重要性状例如降解某种污染物等，是菌株特性。
第三讲微生物生态学的技术与方法
1、传统方法：
1）样品采集
2）直接计数
3）ColonyFormingUnits--CFU
4）MostProbableNumber--MPN
5）酶活测定
6）菌种的分离培养---纯培养技术
7）分离菌株的鉴定、特性及功能研究
2、分子生物学方法：
1）基本原理：
目前主要采用的分子生物学方法都是根据生物所独具的特征分子（本身具有的：
如核酸、蛋白、脂肪酸、呼吸醌等；
或人为赋予的：
如绿色荧光蛋白），建立在对生物的特征分子（组成、结构、序列、数量等的特征）的定性与定量分析，从而分析该类群（种）微生物在生态环境中的数量与功能。
2）目前采用的主要有以下几种：
a）核酸探针杂交;
荧光原位杂交（FISH）;
b）PCR扩增与多态分析及核苷酸序列分析;
c）变性梯度凝胶电泳（DGGE）或温度梯度凝胶电泳（TGGE）;
d）醌指纹法和脂肪酸指纹法;
e）荧光蛋白标记法；
f）QC-PCR法、RT-PCR等。
g）基因文库构建及序列测定与系统发育分析
h）序列测定与分析
3、核酸分子（探针）杂交法：
1）杂交：
指两个以上的分子因具有相近的化学结构和性质而在适宜的条件下形成杂交体，杂交体中的分子不是来自一个二聚体分子。
2）复性：
同一个二聚体中的两个分子在变性解离后重组合称为复性。
3）核酸杂交：
利用两条不同来源的多核苷酸链之间的互补性而使它们形成杂交体双链。
4）探针技术：
是指利用标记分子对其它分子的识别而实现对后者进行检测的一种技术，这种标记的分子叫探针。
4、核酸分子（探针）杂交法依据的是核酸的解链和复性原则及碱基配对原则，因此核酸杂交过程是高度特异的。
杂交的双方是待测核酸及探针。
探针以放射核素或非放射性核素标记，以利于杂交信号的检测。
5、核酸杂交的特点
1）操作简单
2）灵敏
3）可定量
6、核酸杂交法的原理：
1）DNA的变性
2）DNA复性
3）复性过程中的碱基配对原则
4）探针与靶分子的反应
7、探针的种类：
1）根据标记方法:
a）放射性探针
b）非放射性探针
2）根据探针的核酸性质
a）DNA探针:
单链和双链
b）RNA探针
c）cDNA探针
d）寡核苷酸探针
8、核酸分子杂交可按作用环境大致分为固相杂交和液相杂交两种类型。
1）固相杂交是将参加反应的一条核酸链先固定在固体支持物上，一条反应核酸链游离在溶液中，固体支持物有硝酸纤维素滤膜、尼龙膜、乳胶颗粒、磁珠和微孔板等。
2）液相杂交所参加反应的两条核酸链都游离在溶液中。
9、在固相杂交中，未杂交的游离片段可容易地漂洗除去，膜上留下的杂交物容易检测和能防止靶DNA自我复性等优点，所以比较常用。
10、常用的固相杂交类型有：
1）菌落原位杂交、
2）斑点杂交、
3）狭缝杂交、
4）Southern印迹杂交、
5）组织原位杂交和夹心杂交等。
11、固相膜核酸分子杂交：
1）菌落原位杂交：
是将细菌菌落从一主平板转移到硝酸纤维素滤膜上，然后将滤膜上的菌落细胞裂解以释放出DNA，将DNA烘干固定于膜上与32P或荧光标记的探针杂交，通过放射自显影或激发荧光以检测菌落杂交信号、并与主平板上的菌落对位。
2）斑点杂交：
是将被检标本点到膜上，烘烤固定。
这种方法耗时短，可做半定量分析。
一张膜上可同时检测多个样品。
3）Southern印迹杂交：
基本方法是将DNA标本用限制性内切酶消化后，经琼脂糖凝胶电泳分离各酶解片段，然后经碱变性，Tris缓冲液中和和高盐下通过毛吸作用，将DNA从凝胶中转印至硝酸纤维素膜上、烘干固定后即可用于杂交。
4）Northern印迹杂交：
这是一种将RNA从琼脂糖凝胶中转印到硝酸纤维素膜上然后再以探针进行杂交的方法。
DNA印迹技术由Southern于1975年创建，称为Southern印迹技术，RNA印迹技术正好与DNA相对应，故被称为Northern印迹杂交，与此原理相似的蛋白质印迹技术则被称为Westernblot。
12、液相分子杂交:
1）HAP吸附杂交
2）亲和吸附杂交
3）磁珠吸附杂交
13、荧光原位杂交：
一种非放射性原位杂交技术，归根结底属于核酸杂交的一种方式。
目前这项技术已经广泛应用于动植物基因组结构研究、染色体精细结构变异分析、病毒感染分析、人类产前诊断、肿瘤遗传学和基因组进化研究等许多领域。
也是微生物生态学研究中最为常用的分子生物学技术
14、FISH的基本原理:
用已知的标记单链核酸为探针，按照碱基互补的原则，与待检材料中未知的单链核酸进行异性结合，形成可被检测的杂交双链核酸。
15、FISH的特点：
与传统的放射性标记原位杂交相比，荧光原位杂交具有快速、检测信号强、杂交特异性高和可以多重染色等特点。
16、PCR扩增及其产物的多态性分析与序列测定：
微生物生态学中目前频繁采用的另一个分子生物学技术就是PCR扩增技术及其产物的分析技术，包括片段长度多态性分析（简称多态性分析）和序列分析。
17、PCR扩增技术基本原理：
1）双链DNA的解链和复性特点；
2）碱基配对原则；
3）DNA聚合酶的反应特性及耐高温聚合酶的发现。
采用PCR技术可以将目的核酸片段在短时间内扩大几个数量级，甚至达到100万倍，极大地方便了对目标片段的研究。
18、PCR技术强调的几点：
1）样品的采集与总DNA的提取（要有代表性；
尽可能都提出）
2）引物的设计与选择
3）PCR扩增条件的优化
19、竞争PCR：
是一种定量PCR，通过向PCR反应体系中加入人工构建的带有突变的竞争模板、控制竞争模板的浓度来确定目的模板的浓度，对目的模板作定量研究。
20、PCR产物的分析：
经常采用构建基因文库的方法，随机选取文库中的一部分进行分析。
通常采用先进行多态性分析，根据多态性分析结果选取有代表性的克隆进行序列测定，进一步分析样品的微生物多样性和生态组成。
21、PCR产物的分析方法：
1）多态性分析——或称基因指纹图谱分析
a）PCR扩增的混合DNA产物+载体-----转化大肠杆菌（兰白斑筛选）-----构建文库-----随机选取克隆子提取质粒-----多态性分析
b）多态性分析：
i.包括RELP、ARDRA。
ii.原理：
采用识别4个碱基的限制性内切酶对克隆获得的DNA进行酶切，通过电泳分析酶切后的片段长度多态性；
iii.已有证据表明，用4个限制性内切酶，足以区别两个相似性大于95%的16SrRNA基因序列。
这些方法能够反映多个酶切位点所包含的信息，适用于较为复杂的群落之间的比较或大量的不同基因序列的比较。
但是所得到的酶切片段图谱中片段的排列顺序和结构复杂，会造成错误的分析结果。
2）序列测定及系统发育分析
最主要的是针对上述多态性分析中筛选具有不同酶切图谱的克隆子的典型代表，进行核苷酸序列的测定，然后依据这些序列通过一系列的计算机软件进行计算和分析，构建系统进化树。
22、变形梯度凝胶电泳（DEEG）：
1）原理：
a）使用一对特异性引物PCR扩增微生物自然群体的16SrRNA基因，产生长度相同但序列有异的DNA片段的混合物，然后用DGGE分离产物混合物。
b）DGGE胶是在6％聚丙烯酰胺胶中添加线性梯度的变性剂，变性剂的浓度由上到下，从低到高成线性梯度。
c）在一定温度下，在同一浓度的变性剂浓度下,序列不同的产物,其部分解链程度也不同,而产物解链程度又直接影响其电泳迁移率，结果不同的产物在凝胶上就可以分离开来。
2）DGGE需要注意的几个问题：
a）凝胶的制备；
b）变性剂浓度梯度范围的选择；
c）电泳温度。
23、QC-PCR原理：
1）QC-PCR：
是指在PCR反应体系中加入一定已知量的竞争性模板作为内标，与未知浓度的目标模板一起进行PCR扩增。
2）通过二者产物的比值反映初始目标模板的浓度。
为了达到相近的扩增效率，竞争性模板应当具有与目标模板相同的引物结合位点，而且竞争性模板的扩增产物与目标模板的扩增产物大小应相近。
3）由于处理系统中微生物的种类及数量较多，通过传统的培养技术无法对某一菌株进行有效分离培养，因此对其进行定量研究存在一定困难。
通过测定16SrRNA基因的浓度可以确定某一菌株的存在及数量，而PCR技术的应用使得处理系统中即使含量很低的菌株也能检测。
24、文库构建、测序及系统发育分析：
1）目标片断的选择，
2）PCR扩增、产物回收与纯化，
3）连接载体、转化，
4）文库克隆的随机筛选，
5）测序、序列比较分析，
6）系统发育树构建----系统发育分析
25、高通量测序技术的应用
eg：
P454测序技术
1）DNA提取
2）样品的直接测序
3）PCR扩增后测序
4）序列分析
第四讲废水/污水处理微生物系统
1、废弃物的处理
1）固体废弃物的处理
2）废水/污水的处理
3）废气的处理
处理方法：
1）物理方法
2）化学方法
3）生物方法
4）多种方法的结合
2、污水的生物处理---环境生物技术
1）环境生物技术的显著特点:
污染消除技术，而非污染转移技术。
核心是微生物。
2）环境生物技术的4大优点：
a）没有二次污染
b）操作相对简单
c）作用条件温和
d）成本低廉
3、污水生物处理的基本原理：
发挥各种微生物群落的代谢活性，以去除污水中的各种污染物。
4、各种反应器与运行工艺的根本目的，体现在3个方面：
1）维持高的细胞浓度；
2）调节系统的微生物种群结构；
3）提高微生物的代谢活性。
5、污水/废水处理的主要指标及其微生物学原理：
1）废水处理的指标有很多，但最主要的是：
a）COD/BOD（有机物）、
b）TN、
c）TP等三项指标的控制。
2）COD：
以强氧化剂（如重铬酸钾）在强酸性介质下氧化样品，以氧化剂的消耗量折算成氧的消耗量，因此COD包括了所有可以被该氧化剂所氧化的物质，如有机物、一些小分子无机物等。
3）BOD：
通常以活性污泥为测定物对样品进行生物氧化而消耗的氧量，包括所有可以被活性污泥所氧化的物质。
BOD/COD<
1（<
0.3,>
0.7）
4）TN、TP：
样品中所含的全部氮素和磷素。
5）微生物的作用：
有机物去除
有机污染物的生物去除处理可以分为：
好氧生物处理、厌氧生物处理和兼氧生物处理。
a）好氧生物处理：
好氧微生物利用氧将废水中的有机物氧化成CO2和H2O。
相对来说，需要动力消耗较多，负荷比较低。
b）厌氧生物处理：
有机物在无氧的条件下被厌氧微生物降解为CH4、CO2和H2O的过程。
厌氧消化分为高温厌氧消化（550C）、中温（350C）厌氧消化和常温厌氧消化，不需要曝气动力消耗，负荷比较高。
c）兼性生物处理：
在兼性厌氧条件下将大分子难降解有机物转换为小分子有机物的过程，实际上为厌氧处理的第一阶段---水解酸化阶段。
6、厌氧微生物降解废水中的溶解性有机物及部分非溶解性有机物，分解后的主要产物是：
CO2、H2O、CH4及合成厌氧微生物菌体。
厌氧消化可分为四阶段，见下图：
1）第一阶段：
水解酸化阶段。
有机物在水解酸化菌的作用下转化为H2，CO2，乙酸和其他有机酸以及新细胞。
部分大分子有机物转化为溶于水的小分子有机物。
2）第二阶段：
有机酸的进一步降解阶段。
第一阶段产生的有机酸被产氢产乙酸菌利用，转化为甲酸，H2/CO2和乙酸。
3）第三阶段：
产甲烷阶段。
H2/CO2和甲酸、乙酸被产甲烷菌利用而转化为CH4、CO2和H2O。
4）第四阶段：
同型产乙酸菌阶段。
该同型产乙酸菌将H2/CO2转化为乙酸而被产甲烷菌所利用。
7、参与厌氧消化的微生物类群
1）Ⅰ类微生物：
水解酸化菌将有机物转化为H2/CO2，乙酸和其他有机酸。
该类微生物生长速度较快，世代时间从几十分钟到数小时。
代谢速度快，对环境的适应能力较强。
2）Ⅱ类微生物：
产氢产乙酸菌将除H2/CO2和乙酸外的有机酸转化为H2/CO2和乙酸，从而再被产甲烷菌所利用。
3）Ⅲ类微生物：
产甲烷菌只能利用一碳单位的有机物（如甲酸、甲醇和H2/CO2等）和唯一的二碳单位的乙酸，将其转化为甲烷。
该类微生物的生长速度很慢，世代时间一般为3-5天，产甲烷菌代谢速度较慢，对环境的敏感度比其他几类菌高。
因此在通常情况下，厌氧消化系统的启动过程即是产甲烷菌的适应和富集过程。
因此产甲烷阶段成为厌氧消化的限速阶段。
4）Ⅳ类微生物：
同型产乙酸菌利用H2/CO2合成乙酸,该类细菌可以降低废水中的氢分压，从而有利于产氢产乙酸菌的代谢和产甲烷菌的生长与代谢。
8、污水生物处理系统的基本类型
按微生物细胞在处理系统中的存在状况，可以将污水生物处理系统分为：
1）悬浮细胞污水处理系统
2）生物膜污水处理系统
3）活性污泥处理系统
9、生物膜污水处理系统的基本类型：
1）滴滤系统；
2）旋转生物接触氧化系统（RBC）或叫生物转盘；
3）流化床系统（FBR）。
10、活性污泥是由很多微生物（包括细菌、丝状真菌）、原生动物等组成的共生体系的微生物群落，当污水停留在好氧反应池期间，一部分有机物被矿化，另一部分转化为微生物细胞物质。
11、活性污泥法中最主要的因素：
污泥的沉降性能。
1）如果活性污泥沉降性能差，将导致活性污泥膨胀，主要是由于丝状细菌和真菌的过分繁殖引起的，虽然活性污泥的膨胀机理尚不完全清楚，但通常是在高的C：
N、C：
P比及低溶氧条件下容易产生活性污泥膨胀。
2）为维持良好的处理效果，应当避免污泥膨胀的产生，因此在活性污泥法中严格控制进水的C：
P比及较高的溶氧水平是避免污泥膨胀，维持良好运行状态的重要条件。
产生的活性污泥的一部分回流利用，另一部分则需要通过处理或厌氧消化或填埋或干燥处理以用作农业肥料。
12、活性污泥处理法
1）优点：
a）活性污泥法是一个连续的处理过程，因而易于计算机控制而实现监控自动化。
b）活性污泥法的效率具有可塑性。
2）缺点：
它的主要问题是有剩余污泥的产生，需要其他办法来处理（用各种处理系统以减少剩余污泥的产量）。
13、污水生物处理工艺的基本类型：
按处理系统对氧气的需求情况，可以将污水生物处理工艺分为：
1）好氧工艺
2）厌氧工艺
3）各种组合工艺
14、污水生物处理反应器的基本类型：
1）好氧反应器
2）厌氧反应器
3）SBRorCASS
4）UASB
5）MBR
15、好氧反应器：
1）好氧微生物的生长需求；
2）有些污染物需要在好氧条件下才能降解。
特点：
1）可控制溶氧水平
2）处理比较彻底
3）负荷相对较低
4）运行成本相对较高
16、厌氧反应器：
1）厌氧微生物的生长需求；
2）有些污染物需要在厌氧条件下才能降解。
1）负荷可以很高（>
30kg/m3/d）
2）可回收生物质能源（0.6m3甲烷/kgCOD）
3）运行成本低
4）但处理不彻底
17、UASB反应器（厌氧反应器）
a）应用范围广，能耗低，负荷高，剩余污泥量少，
b）氮、磷营养需要量较少，处理过程有一定杀菌作用
a）厌氧微生物增殖缓慢，因而启动和处理时间比较长
b）出水往往需要进一步处理
c）处理系统操作控制因素较为复杂
3）主要应用范围：
a）有机污泥处理
b）高浓度有机废水
18、MBR（膜生物反应器）：
1）膜生物反应器：
将膜分离技术和生物反应器的生物降解作用集于一体的生物化学反应系统。
它以超滤或微滤膜业件替代传统活性污泥法中的沉淀池实现泥水分离。
2）特点：
a）该系统具有处理能力强、
b）固液分离效率高、
c）出水水质好、
d）占地空间小、
e）运行管理简单等。
3）、缺点（膜）：
易被破坏；
成本高；
使用周期短。
19、生物强化技术：
指在生物处理系统中，通过投加具有特定功能的微生物、营养物或基质类似物，达到提高废水处理效果的手段和方法。
20、生物强化技术在污水处理中的应用：
1）在城市污水处理中的应用
2）在工业废水处理中的应用
3）在养殖废水处理中的应用
21、生物滤器生物膜的微生物种群与功能：
1）分离培养;
2）MPN;
3）16SrRNA基因文库分析。
系统探讨了封闭式循环水养殖中生物滤器挂膜过程中的微生物种群与功能及其变化。
22、随着挂膜的进程，生物膜中的优势微生物以有机物降解为主的类型向以硫代谢与氮代谢为主的类型转变，同时条件致病菌的比例也明显上升。
23、处理系统中微生物种群及其功能的调控
能否对处理系统中的微生物种群与功能加以调控以及如何实现这种调控，使处理系统处于高效与稳定的运行状态，是生物处理过程中的又一重要课题，对于环境保护也具有重要意义。
24、微生物种群及其功能的调控策略
1）合理的处理工艺
2）合适的反应器
3）最佳的运行工艺与条件
4）生物强化技术的应用
5）其他
第五讲微生物生物被膜
1、生物被膜：
由胞外多聚基质包被的高度组织化、系统化的微生物膜性集合体。
2、生物被膜不是简单的细菌集合体：
1）细菌之间有信息的交流来控制群体的行为（社会微生物学）
2）胞内信号分子控制生物膜的形成和发育
3）类似高等生物的发育周期
3、单细胞微生物如何维持其群体？
－胞外多聚基质（EPS）将单个的细菌相联合。
EPS包含：
多糖；
外DNA；
外蛋白质。
4、微生物为何形成生物被膜？
1）可以让整个群体附着并停留在营养较为充足的环境中，利于群体的壮大；
2）增强微生物在自然环境中的生存能力（生物被膜与单细胞微生物相比有更强的环境适应性和抵抗力）。
5、生物被膜在环境治理中的应用
1）生物被膜中的微生物可降解工业化带来的污染物，对污染的环境进行生物修复。
2）土壤表面的微生物生物被膜形成自然的生物屏障，净化污水，保护土壤和地下水免受污染。
6、生物被膜发育的周期：
1）可逆吸附期；
2）不可逆吸附期；
3）生物膜形成初期；
4）生物膜成熟期；
5）‘种子散播’期。
7、影响生物被膜形成的因子：
1）EPS：
多糖，eDNA，蛋白；
2）多聚体菌细胞附属物：
鞭毛、菌毛、纤毛等；
3）信号分子：
胞内（如cyclic-di-GMP），胞外（QS）.
8、多聚体菌细胞附属物：
由一种或几种结构蛋白及其附属蛋白组成的细菌表面结构。
它们在生物膜形成过程中，主要参与菌体与载体或寄主表面的吸附以及菌细胞间的粘附。
9、纤毛不介导菌的运动，主要介导菌细胞之间，及其与载体或寄主表面的吸附。
10、Cyclic-di-GMP调控生物被膜的机制：
1）通过调控生物膜形成相关的多糖或蛋白的转录与合成来影响生物膜的形成；
2）直接参与基因的转录；
3）通过GGDEF和EAL蛋白在菌体内的定位聚集影响生物被膜形成和撒播。
11、小结：
1）
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