生物显微技术实验Word文档格式.docx
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（3）整体封藏法将完整细小的组织块进行处理，封藏为永存片，如叶表皮整体制片、团藻、水绵、黑根霉等装片。
（4）整体透明法用透明剂将较小的材料整体透明，经透明以后可以在显微镜下观察其内部结构。
（5）胚囊酶法分离技术对植物的胚珠进行酶解，将胚珠内部的完整胚囊分离出来，用于研究胚囊的发育、或者进一步分离出卵细胞。
（二）按是否能长期保存来分，可分为二类：
（1）临时制片法：
制片用于临时观察，不需要长期保存（如临时装片、徒手切片、冰冻切片等）。
（2）永存片制片法：
制片可以长期保存（如石蜡切片、半薄切片、超薄切片等）。
四、教学基本要求
1、要求重点掌握的技术：
石蜡制片技术（包括：
取材、固定、脱水、包埋、切片、展片、烤片、染色、透明与封藏）；
2、要求掌握的一般技术：
（1）植物其它切片制片方法（徒手切片法）；
（2）非切片制片技术（压片法、涂片法、整体透明法、酶解法等）
（3）摄影及照相机的使用方法；
实验一生物制片样品的选取与固定技术（2h）
一、实验目的要求
了解生物制片样品的选材与固定技术，为石蜡切片做准备。
二、实验原理
1、选材与切割：
根据不同制片目的和制片方法选取合适的材料；
材料要求新鲜，无病虫害；
先作徒手切片或剥离检查，决定适宜的材料立即固定处理；
材料大小要适当，如根的直径在5mm以内的，可切取5-10mm长的小段，直径在5mm以上者可纵分割成1／2或1／4，横切厚度约3-5mm；
叶的切割可切成2-5mm，若叶较宽可切10mm的长条，叶面切取的部位，以研究者的目的灵活选取。
切取材料必须使用新刀片，刀口和叶面垂直迅速切割下来；
花、果的切割：
花药和雌蕊切割，花芽和幼穗的切割，须剥去外部鳞片及叶鞘和其它部分，切去多余部分再放入固定液，有的花序则需去掉外方苞片，一般小的花不经切割可投入固定掖，大花果才进行分割处理。
2、杀生（杀死）：
在制片过程中，将拟制片的材料（细胞或组织块）迅速杀死，使组织块尽量保持原生活时状态，这种处理通称杀生。
杀生时常用一种或多种化学药品处理。
一般以渗透力较强的药剂作杀生剂效果比较好。
3、固定：
在杀生处理的过程中，将器官、组织、细胞按原来的形态保存下来，并为后续制片保持固有形态，这样才达到固定的要求。
杀生与固定关系密切，通常二者兼有作用。
4、保存：
组织块经杀生固定后，能较长时间保存下来，经久保存下来的组织块，仍能制片，如酒精、醋酸，福尔马林液保存时间较长；
而铬酸类固定液，常须转换70%酒精液后保存，才可较长时间保存。
三、实验材料与试剂
材料：
南瓜茎或禾木植物的茎
试剂：
1、F.A.A固定液（福尔马林－冰醋酸－酒精）
（1）福尔马林（38%甲醛）5mL
（2）冰醋酸5mL（3）70%酒精90mL
2、F.P.A固定液（福尔马林－丙酸－酒精）制片效果有时较F.A.A好。
（1）福尔马林（38%甲醛）5mL
（2）丙酸5mL（3）70%酒精90mL
3、CanoysFluid（卡诺氏固定液）
（1）纯酒精（或95％酒精）15mL
（2）冰醋酸5mL
四、实验操作步骤
1、取样：
用锋利刀片将南瓜茎切成小段，用作横切的切成0.8cm长，用作纵切的切成1cm长，并切去相对两侧少许，最好选择髓腔较大的样品纵切为两半，髓腔较小的样品不用纵切；
2、固定：
用FAA固定24h，抽气，除去材料中的气体，并保存于固定液中；
3、软化：
先经70%、50%、30%酒精及降至蒸馏水（每次瓶装1/3试剂）分别处理2-4h后，置于15%氢氟酸中软化10-15d备用。
氢氟酸可将硅化物软化去除南瓜茎表面的硅化物颗粒，便于制片。
思
考
题
与
参
文
献
思考作业：
1、生物制片如何选择材料？
2、杀生和固定有何意义？
参考文献：
1、王灶安．植物显微技术．北京：
农业出版社，1992
2、李和平．植物显微技术．华中农业大学，2006电子版
3、李正理．植物组织制片学．北京：
北京大学出版社，1996
实验二植物显微化学制片（2h）
掌握植物徒手切片的制作技术与方法。
利用临时装片进行显微化学鉴定，掌握常用植物显微化学实验的原理与方法。
植物显微化学：
将材料以徒手切片方法制成薄片，应用化学反应或染色与化学反应相结合的方法，将组织或细胞内的某种化学成分（淀粉粒、蛋白质、脂肪、果胶质、纤维素及木质素等）在组织切片内予以显示。
用于研究和测定植物的器官、组织及细胞中内含物的存在、化学性质、含量和分布，简便迅速的方法，是野外调查和室内鉴定的极好方法。
土豆
碘-碘化钾溶液：
（1）碘化钾2g；
（2）碘1g；
（3）蒸馏水300mL
配法：
先将碘化钾加热溶于5mL蒸馏水中，然后加入碘，待其溶化后再将溶液稀释至300mL。
四、实验操作步骤
1、制作土豆临时装片：
徒手切片法制作
（1）将材料切成长约2～3厘米的小段，削平切面。
（2）左手的三个指头拿住材料，使之固定不动摇。
为防止刀伤，材料上端应超出手指2～3mm，不可高出过多，否则切片时材料容易动摇，也不容易切薄。
（3）右手大拇指和食指捏住刀片的右下角（刀片要非常锋利，双面刀片必须是新用的），刀口向内，并与材料切面平行，切片前先将材料和刀口上蘸些水，使之切时滑润。
（4）切的方法，以刀口自外侧左前方向内侧右后方拉切，这样可以边切边看清切片的进展情况，同时切起来也比较顺手。
切片时只用臂力而不要用腕力及握刀指关节的力量，左手保持不动，不要两手同时拉动，两手不要紧靠身体或压在桌子上，并且动作要敏捷，材料要一次切下，切忌中途停顿或推前拖后作“拉锯”式切割。
关键是要切得薄而平。
如此连续切片，切下数片后，用湿毛笔将切片轻轻移入培养皿的清水中备用。
（5）在切片过程中刀口和材料要不断蘸水，以保持刀口锋利和避免材料失水变形。
所切的材料和刀片一定要保持水平方向，不要切斜，如果切斜，即使很薄，但由于细胞切面偏斜，同样影响观察。
（6）切下足够多的切片后，挑选薄而平的切片做成临时装片供镜检。
挑选切片时，不一定要材料切得很完整，只要切得很薄就行，有时只要有一小部分就可以看清其结构了。
因此切下的切片不是每一片都适用，也不是只有全面切得薄的才能用，要根据需要进行选择，一次可多选几片置于载玻片上，制成临时装片，通过镜检再进一步选择理想的材料用以观察。
2、染色：
I2-KI溶液染色，取一滴配好的溶液滴在切片材料上染色30S，水洗；
3、观察：
盖上盖玻片置显微镜下观察，可见细胞内含许多被染成蓝色的卵圆形
或椭圆形颗粒，即为淀粉粒。
于高倍镜下观察，可见马铃薯淀粉粒依脐点和轮纹不同有单粒、复粒和半复粒三种类型。
（1）单粒淀粉（图A）：
每粒淀粉有一个脐点，围绕脐点有许多同心环，即轮纹。
（2）复粒淀粉（图B-D）：
每粒淀粉有二个或二个以上的脐点和各自的轮纹，而无共同的轮纹层。
（3）半复粒淀粉（图E）：
每粒淀粉具有二个或二个以上的脐点和各自少数的轮纹，还有共同的轮纹层。
作业
1、碘液染色时间稍长（30s以上）出现黄色为何物质？
2、绘制马铃薯三种类型的淀粉粒图，并引线注明。
备
注
实验三生物样品的非切片制片法－木材解离制片
掌握生物样品的非切片制片法－木材解离制片原理与方法，并观察木质部各组成细胞的形态结构。
不经过切片而是以机械或药物将一部分细胞（或组织）或各个细胞分开的制片法称非切片制片，如用机械法分离叶表皮制片；
用药物解离根尖、茎尖、木材等。
木材
浓硝酸
1、解离将被检查的木质部切成火柴梗粗细，长约1-2cm的小段。
解离方法常有两种，任意选择。
（1）将切好的材料置于试管或烧杯中，加浓硝酸使材料浸没，再加入数小粒氯化钾，水浴（或酒精灯）上加热至有气泡发生并使材料变白为止（为了安全需在排气柜内进行）。
此法解离效果较好。
（2）将切好的材料放于培养皿中，加入过氧化氢一冰醋酸液（以过氧化氢1份+冰醋酸1份配制）密闭后，放置25-30℃温箱（台）中，解离1－2小时，待解离适当转入下一步。
该法解离效果欠佳。
2、水洗：
用尼龙纱网滤去酸液，再换水浸泡数次，尽量除去酸液。
3．保存：
用玻璃棒捣散组织，转入离心管中进行离心处理，或静置沉淀后，吸去上清液，另加入50%酒精保存备用。
4．染色：
取少量木质部解离组织，置1%番红液染5min左右。
5．水洗：
水洗数次去浮色。
（至少3次）
6．粘片：
用玻棒蘸取含有木质部细胞的水液，均匀涂布载玻片上，转置36℃温箱中烘干。
7．封片：
二甲苯过一遍，加拿大树胶封片（可不做）。
8、观察：
解离细胞呈深红色。
作
业
（茎）缘孔纹导管阶纹导管（茎）网纹导管
木质部发达的螺纹导管木质部发达的缘孔纹、螺纹导管
思考题与作业：
绘图并描述导管细胞的形态。
单孔导管
参考文献
实验四石蜡法制片——样品的脱水、透明与浸蜡（8h）
掌握石蜡制片中脱水、透明和包埋的主要原理与方法。
了解各种透明剂的特点，了解实验中出现问题的原因。
1、脱水：
用的脱水剂去除组织内的水分，并使其组织细胞变硬；
从而使溶解的石蜡顺利进入细胞内，以便进行石蜡切片。
常用脱水剂有：
乙醇（酒精）、二氧六环、正丁醇、叔丁醇、丙酮等药剂。
2、透明：
是制片过程中的基础工作，材料经各级酒精脱水以后，要经过常用的有机溶剂进行透明，这样便于包埋剂（石蜡）及封藏剂（加拿大树胶）进入和溶合。
只有当组织材料全为透明剂所占，并在显微镜下观察呈透明状态时，这种材料才符合制片要求，故透明是制片的重要环节。
常用的透明剂有氯仿，二甲苯等。
3、浸蜡：
在装有材料的纯氯仿瓶中，分次逐步加入纯石蜡蜡片，以石蜡透入细胞组织内的全过程，称为浸蜡。
浸蜡完全的材料，组织块显得十分透明。
氢氟酸处理的南瓜茎
1、苯胺番红酸性染料溶液
（1）苯胺蓝1g
（2）85%或95%酒精100mL
2、无水及不同浓度的酒精溶液
3、纯氯仿
4、石蜡：
软材料用54－56℃熔点的石蜡，若切5μm以下的厚度或炎热夏季切片时，宜用58－60℃的石蜡。
石蜡商标上须注明为“生物组织切片用蜡”字样，选用时还必须检查石蜡细致度、无气泡、无灰尘、无透明点痕、切片时不断裂、不碎等优点。
工业用蜡不能使用。
新石蜡和用后已切碎的石蜡，都必须经过先熔化，然后用3－4层桑皮纸，折叠成漏斗形，进行过滤除去渣滓。
50%石蜡：
一半石蜡和一半二甲苯配制而成；
70%石蜡：
70%石蜡与30%二甲苯配成；
1、整染：
将氢氟酸处理（13d）后的南瓜茎取出，用流水冲洗20h，蒸馏水浸泡洗涤3次，每次2h，然后经苯胺番红整染48h。
2、多级酒精脱水：
经30%、50%、70%、85%、95%及无水酒精处理各2h。
3、多级氯仿透明：
经1/5、2/5、3/5、4/5及纯氯仿通明各2h。
4、浸蜡：
经50%、70%及纯蜡A、B置恒温箱中浸蜡各2h。
包埋时作横切的样品竖放，作纵切的样品卧放。
附步骤及过程表
思考题与作业
脱水、透明对材料的浸蜡与包埋有何影响？
实验四脱水、透明与浸蜡步骤及过程表
天数
时间
步骤
第一天
实验课内
取流水冲尽酸液（自来水冲20h），换蒸馏水冲6h，再用苯胺番红整染48h。
第三天
7：
3030%
9：
4050%
11：
4070%
15：
4085%
19：
4095%
酒精完全浸没材料超过1～2cm
第四天
30
40
无水酒精
无水酒精最好3次，最后1次划格子，共划5格
1/5氯仿
2/5氯仿换软木塞，每次吸出一格，加入一格纯氯仿
3/5氯仿
第五天
304/5氯仿
40纯氯仿
40纯氯仿15：
40碎蜡
同上
全部吸出后，再加纯氯仿
再换1次纯氯仿
第一次加少量碎蜡
第二次加溶液体积的20%36℃恒温
第六天
50%蜡40～42℃
70%蜡48～50℃
纯蜡A再换橡胶塞
纯蜡B56～58℃
纯蜡C63℃石蜡溶化为止
第七天
课内完成
包埋
附
录
一、几种常用的脱水剂及脱水方法
1、乙醇（酒精）（ethylalcohol）乙醇是常用的脱水剂，但因易使组织收缩及发硬，故不是理想的脱水剂。
在配制脱水剂时，用95%酒精配制为15%、30%、50%、70%、85%等各种浓度的酒精。
由低浓度到高浓度按级过渡脱水过程。
一般材料从30%酒精开始，细胞学常以15%酒精开始，有时用与固定液同浓度的酒精开始脱水。
低浓度中不能停留时间太久，否则材料易吸水膨胀，高浓度（在95%无水酒精内）中也不能停留时间过长，否则材料易脆化收缩。
为脱水彻底，在无水酒精中应两次，如果材料转入二甲苯中，有乳白悬浮液出现时，说明脱水不彻底，应退回无水酒精中继续脱水，在脱水进行中，应避免在无水酒精内过夜处理。
2、二氧六环（dioxan）（CH2）4O2又名二氧杂环己烷、氧化二乙烯。
为无色液体，易挥发燃烧，有毒性化合物，不适宜学生实验用，因其毒气是无臭的，吸入后，毒性有积累作用，故开瓶后须十分小心，勿使毒气扩散出。
二氧六环与水及酒精、油类以任何比例混合，其优点：
①兼有脱水和透明作用，不会使组织硬化和收缩，在脱水时，以逐级二氧六环脱水至纯二氧六环后进入石蜡，但其比重大于石蜡，故在进入石蜡前，通过一次氯仿处理驱赶尽二氧六环后再转入浸蜡为好。
②固定液中含有苦味酸的，不必多冲洗即可转入二氧六环中。
③大的材料在浸入二氧六环前，先浸入苯胺油，其结果更好。
④重铬酸钾在二氧六环中不溶解，可在材料中成黄色的染色剂。
⑤浸入冷的二氧六环中，放于冰冻切片机的冻盘上，可冰冻切片。
3、正丁醇（normalbutylalcohol）此剂可与水、酒精、二甲苯等剂混合，也可单独或与酒精配级混合使用，是常用的脱水剂。
为黄色液体，易挥发，吸入后有人会产生头痛，有人则无反应。
其优点：
不会使组织收缩或变硬，能溶解石蜡，可不经透明剂直接浸蜡，脱水时，用正丁醇和酒精配成一定比例，逐级处理至纯正丁醇后，再转移至正丁醇与石蜡等量
混合液中，最后移入包埋蜡杯中，完成包埋工作。
4、叔丁醇（Tertiarybutylalcohol）（简称TBA）是较正丁醇更好的一种脱水剂，可单独用或与酒精混合用；
为无毒性、不会使组织收缩和变脆，还可不经过透明剂，其比重轻，易从石蜡中除去，故可简化脱水、透明、浸蜡等步骤；
因其价格较贵，不宜一般实验用。
熔点为25℃。
具体脱水级别与配法如下（单位：
mL）：
浓度级别1234567891011
95%酒精5111830405050402500
蒸馏水958983705030155000
TBA（叔丁醇）00001020355575100100
相当于酒精（%）511183050708595100100100
1）材料经固定水冲洗后，先由5%浓度酒精开始脱水至50%酒精（每级经1h）。
2）到第六级时转入欲配制的TBA级别（此时处理时间为一夜）。
3）7级至9级又为1h。
4）10-11级为12-24h；
从11级即可加碎蜡进行透蜡处理。
5、丙酮（Acetone）可代替酒精作脱水剂，脱水能力强于酒精，但对组织收缩力较大，能使蛋白质沉淀，组织硬化。
与水、醚、酒精、氯仿、苯等能任意混合，但不能溶解树脂、石蜡，所以仍需经过透明剂处理后才能包埋。
以上脱水剂各有其优缺点，但使用最多的仍为酒精。
6、甘油（Glycerin）是藻类、菌类、高等植物的原丝体、原叶体等良好的脱水剂。
使用时较少收缩现象，甘油脱水前，必须冲洗干净固定液，以免影响包埋、染色等处理。
脱水级差从5%开始，到纯甘油。
如发现水仍未脱尽，临时以正丁醇补充脱水一次。
二、几种常用的透明剂及透明方法
透明剂都是石蜡的溶剂，不能与水相混。
现介绍以下透明剂。
1、二甲苯（xylol）为较其他透明剂价格便宜，应用普遍的一种无色透明液体，能与酒精混合，也可溶解石蜡，并能与树胶混合成封藏剂，但不溶于水，
透明力强、速度快；
其缺点是：
使组织收缩变脆，故在二甲苯中不宜停留时间过长，同时必须在材料完全脱水后方可使用二甲苯，若有极少量水分在组织内存在，就会出现乳雾状现象，通常在无水酒精与二甲苯之间，增添1／2无水酒精和1／2二甲苯的混合液，以便脱水彻底又可使材料减少收缩。
装二甲苯的器具盖，要随手关闭，以免挥发污染室间空气。
2、氯仿（chloroform）为常用的透明剂，能与酒精混合，溶解石蜡，在石蜡制片中，浸蜡前的透明多采用氯仿，本编者习惯使用此剂。
其优点是：
①组织在氯仿中浸久虽有收缩，但不强烈；
②易挥发，如浸蜡时渗入组织中的氯仿经蜡温易驱赶出去。
不足之处是：
渗透力稍弱（如比二甲苯、苯透明慢），可延长透明时间便于工作安排，另外，氯仿能退色，一般染色后的切片，不以氯仿处理。
一般用三级氯仿透明，若材料柔嫩可以增加到五级透明处理。
3、冬青油（wintergreenoil）即水杨酸甲酯（Methylsalicylate），又称冬绿油。
可作整体制片的透明剂，效果较好，对维管系统的制作透明也很理想，但其渗透力很慢，且具毒性，用时要小心。
4、丁香油（cloveoil）为切片染色后封固前最好的透明剂；
有的染料，如固绿、桔红G可以丁香油配成饱和溶液，有作染色、分色、透明三步合并应用效果。
另能溶于酒精及氯仿，可用95％酒精混合使用，而二甲苯必须用纯酒精混合；
丁香油的透明力比二甲苯效果好。
其缺点是易使组织变脆，且经丁香油透明的切片，需经二甲苯复处理，染色的部分才鲜明，封片后干燥时间较二甲苯长。
5、香柏油（cedaroil）为无色或绿色的芳香挥发性油，极毒，用时必须小心。
纯香柏油常用于油镜使用上，使用此油作透明剂，不易使材料收缩变硬，作用慢，一般透明时间在10h以上，且不易为石蜡代替。
如用石蜡制片，仍须通过二甲苯一次，以除尽香柏油才利于石蜡透入组织内。
6、苯（benzene）苯的透明作用与二甲苯相似，用法相同，且收缩较少，但易挥发、爆炸，吸入苯后会引起中毒，尽量少用。
7、甲苯（toluene）甲苯的性能与二甲苯相同，可作二甲苯的代用品；
其透明力慢，
组织浸置甲苯中10h以上也不变脆。
实验五细胞组织分离制片法（4h）
掌握组织分离制片原理与方法，并观察表皮细胞的形状及气孔的构造。
学习数码显微照相技术。
以机械或药物将一部分细胞（或组织）或各个细胞分开的制片法，如用机械法分离叶表皮制片。
器材：
生物显微镜、滴瓶、镊子、大方滤纸、培养皿、毛笔、染色缸、载玻片、剪刀、
蚕豆叶
1%番红水溶液；
1%龙胆紫；
无水乙醇；
盐酸；
二甲苯；
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