大肠杆菌抗氧化应激反应的蛋白质组学讲解Word格式.docx

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摘要

第1章细菌抗氧化应激反应的研究进展1

1.1蛋白质组学分析在细菌抗氧化应激研究中的应用1

1.1.1金黄色葡萄球菌的蛋白质组学分析1

1.1.2幽门螺旋杆菌的蛋白质组学分析1

1.1.3枯草芽孢杆菌的蛋白质组学分析2

1.1.4在其他菌株上的蛋白质组学分析2

1.2蛋白质组学分析的概括3

第2章材料和方法5

2.1实验流程图5

2.2材料及主要实验仪器6

2.3试剂7

2.4实验过程10

2.4.1大肠杆菌扩大培养10

2.4.2氧化应激处理10

2.4.3细胞破碎11

2.4.4膜蛋白提取11

2.4.5制胶11

2.4.6样品处理12

2.4.7SDS-PAGE分析12

2.4.8MALDI-TOF-MS/MS质谱鉴定13

第3章实验结果14

第4章讨论18

4.1过氧化氢的浓度18

4.2质谱结果分析18

4.3前景展望19

参考文献20

致谢23

第1章细菌抗氧化应激反应的研究进展

1.1蛋白质组学分析在细菌抗氧化应激研究中的应用

1.1.1金黄色葡萄球菌的蛋白质组学分析

中性白细胞通过活性氧物质杀伤细菌，借助蛋白质组学方法可以发现不同菌株在氧化应激中蛋白表达差异，以研究其抗氧化机制。

Danchenko等[1]用LC-MS/MS技术对分别经H2O2处理后的RN6390和UAMS1两种金葡菌菌株蛋白质特征进行分析，发现了157种UAMS1菌株特有的蛋白，其中78种是未知的；

有131种RN6390菌株特有的蛋白，其中17种是未知蛋白。

这些差异蛋白将有助于对涉及去氧化毒性和毒力的相关机制进一步研究。

Weber等[2]利用高分辨率的2-DE与MALDI技术分析了金葡菌COL菌株对氧化应激的特点。

在指数生长期加入H2O2后，细菌出现生长停滞，甘油醛-3-磷酸脱氢酶（Gap）、还原酶（AhpC）和酶（MvaS）的等电点明显改变。

由于氧化应激的条件下ATP水平和Gap活性密切相关，因此H2O2引起的Gap活性失活可能是其生长停滞的原因之一。

相反，Throup等[3]用2-DE研究了缺氧时srhSR基因突变株蛋白表达特征，发现srhSR剔除后导致了涉及到能量代谢和其他代谢过程如精氨酸分解、黄嘌呤分解以及细胞形态学的蛋白改变，提示葡萄球菌srhSR体系在应答氧获得性发生改变时能量转移的调节起重要作用。

1.1.2幽门螺旋杆菌的蛋白质组学分析

游运辉[4]等利用固相pH梯度双向凝胶电泳分离胃炎与胃癌相关幽门螺杆菌菌株的总蛋白质，凝胶经蓝银显色后，采用PDQuest图像分析软件比较、分析、识别差异表达的蛋白质，应用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱得到相应的肽质指纹图谱，然后搜索数据库鉴定部分差异蛋白质点。

鉴定出14个差异蛋白质，包括抗氧化作用、分子伴侣、解毒和DNA修复相关蛋白质、三大代谢相关酶类、细胞结构相关蛋白质以及信号传导相关蛋白质。

1.1.3枯草芽孢杆菌的蛋白质组学分析

Mostertz等[5]对枯草芽孢杆菌（Bacillussubtilis）在过氧化物刺激及超氧化物刺激下的应激反应进行了转录组学和蛋白质组学研究，结果发现氧化压力下的反应蛋白可以分为2类：

一类是在2种氧化压力下具有相似表达模式的蛋白，如PerR和Fur调控元中的成员；

另一类是仅对其中一种刺激敏感的反应蛋白，如SOS调控元中的成员在过氧化物刺激下会表达上调，而参与硫酸盐同化过程及甲硫氨酸生物合成的蛋白仅在超氧化物刺激下诱导表达。

在嗜热脂肪芽孢杆菌氧化应激的蛋白质组学研究中，氧化压力能够诱导过氧化物酶的表达发生变化[6]。

此酶在凝胶上的位置不同，表现为4种异构体形式（PrxI、Prx1I、PrxIII、PrxIV），它们都具有相同的相对分子质量（27000），却具有不同的等电点（分别是5．0、4．87、4.8l和4.79）。

H2O2能诱导PrxⅡ、PrxIII、PrxIV蛋白的丰度增加，却使PrxI的丰度减少。

另外，延长氧化压力的作用时间不能改变这些异构体的表达水平。

因此，这种异构体丰度之间的转化，可能是一种翻译后修饰现象造成的。

此外，变异链球菌在氧化压力下，也有69个蛋白的表达量升高，其中l5个是特异性感受氧化压力的应激蛋白；

另外还有24个蛋白的表达量降低[7]。

1.1.4在其他菌株上的蛋白质组学分析

Okano[8]等对革兰阴性菌——牙龈卟啉单胞菌（Porphyromonasgingivalis）进行了有氧压力下的蛋白质组学分析。

虽然牙龈卟啉单胞菌是一种厌氧病原菌，但仍具有一定的氧耐受能力，因此能够引起慢性牙周炎。

为了研究这种耐氧机制，Okano等对比了该菌在有氧压力条件下和厌氧条件下培养的蛋白表达谱。

结果发现，在有氧压力情况下很多蛋白的表达受到了影响，特别是HtpG、GroEL、DnaK、AhpC、含有TPR结构域的蛋白，以及引发因子的表达量都持续升高。

从这些研究可以看出，厌氧菌与需氧菌的氧化应激研究策略也不相同：

对于厌氧培养的细菌，有氧培养的条件就可以激发氧化应激反应；

而对于有氧培养的细菌，则需要使用过氧化物来创造氧化压力条件。

1.2蛋白质组学分析的概括

蛋白质组学（proteomics）是在基因组学、蛋白质分离和质谱等技术相结合的基础上发展起来的，从整体的角度研究某一种细胞、组织或生物体蛋白质组成及其动态变化规律，了解蛋白质之间的相互作用与联系，获得蛋白质水平上的关于疾病发生、细胞代谢等过程的整体而全面的认识的一门新型学科。

蛋白质组的研究不仅能为生命活动规律提供物质基础，也能为众多种疾病机理的阐明及攻克提供理论根据和解决途径。

蛋白质组学是对基因组学研究的重要补充和延伸。

传统的单个蛋白质研究方式已无法满足后基因组时代的要求。

要对生命的复杂活动有全面深入的认识，必然要在整体、动态、网络水平上对蛋白质进行大规模研究。

蛋白质组具有动态的特点，蛋白质组学注重研究参与特定生理或病理状态的所有蛋白质种类及其与环境分子的关系。

不仅是生命科学研究进入后基因组时代的里程碑，也是后基因组时代生命科学研究的核心内容之一。

蛋白质组学的技术平台主要包括蛋白质分离技术、蛋白质鉴定技术和生物信息学技术。

在蛋白质分离方面，双向凝胶电泳（2-DE）[9]是最常用最经典的技术，此外还有高效液相色谱（HPLC）、毛细管电泳（CE）和毛细管色谱等非凝胶的蛋白质分离技术。

在蛋白质鉴定方面，生物质谱（Bio-MS）是蛋白质组学研究所采用的核心技术。

从质谱仪所采用的离子源来讲，生物质谱主要指以电喷雾电离（ESI）[10]和基质辅助激光解吸电离（MALDI）为代表的两种“软电离”质谱技术，称为电喷雾电离质谱（ESI-MS）和基质辅助激光解吸电离质谱（MALDI-MS），都具有高灵敏度和宽质量检测范围的特点。

从质谱仪的质量分析器来讲，生物质谱常采用三级四极杆（TQ）、三级四极杆-飞行时间（Q-TOF）、串联飞行时间（TOF/TOF）、离子阱（IT）和傅里叶回旋共振（FTICR）等质量分析器。

采用不同的离子源和质量分析器组合，就可构成性能各异的质谱仪。

此外，有关蛋白质相互作用的研究技术也属于广义的蛋白质鉴定技术，如酵母双杂交、免疫共沉淀、生物传感器技术（BIA-core）、荧光共振能量转移（FRET）、蛋白质芯片（ProteinChip）和基于免疫荧光、荧光蛋白融合和激光共聚焦的细胞共定位技术等。

由于生物信息学能将生物学实验数字信号转换成具有生物学意义的实验结果，在蛋白质组学研究中具有十分重要的意义：

①采用图像获取、识别、定量及其差异对比等技术获取生物实验信息；

②通过肽质量指纹图谱结合数据库搜索识别蛋白质；

③用串联质谱数据搜索数据库识别蛋白质；

④从串联质谱数据直接推测肽序列。

在实际应用中，各种蛋白质组学研究技术可灵活组合、整合联用。

最常见的策略是将上游的液相蛋白质分离技术与ESI-MS[11]在线联用（如CE-MS或LC-MS联用），整合成高通量自动化的蛋白质分离鉴定系统。

还可将MALDI-TOF-MS和ProteinChip[12]结合，形成所谓表面增强激光解吸离子化（surface-enhancedlaserdesorption/ionization，SELDI）技术（Merchant和Weinberger2000），这种新的方法是将待测蛋白质混合物和具有不同特性的芯片结合，洗去非特异性结合的蛋白后，再用MALDI-TOF-MS鉴定特异性结合的蛋白质，就可获得基于不同相互作用的多维蛋白质图谱。

值得注意的是。

ESI-MS[13]对样品的前期处理要求较高，能与HPLC等高通量分离技术在线联用，有利于提高效率。

MALDI-MS对样品的前期处理要求较低、适于混合样品鉴定，但只能与上游分离技术实现固相联用，不利于效率提高。

此外，蛋白质组学还引入了定量分析[14]和差异表达[15]的研究方法：

基于质谱分析技术的化学标记定量法[16]，如同位素编码亲和标签（isotope-codedaffinitytag，ICAT）技术[17]（Gygi等，1999）。

基于荧光染料的定量分析法，如二维差示凝胶电泳（2-DDIGE）技术（Lil-ley等，2004）。

蛋白质组学研究的基本技术路线如细胞或组织样品、样品制备、2DE分离蛋白[18]。

随着蛋白质组学研究技术的不断成熟，蛋白质组学在研究疾病发病机制[19]、药物作用原理等方面都得到了广泛的应用。

细菌和真菌蛋白质组领域的研究正进人快速发展阶段。

第2章材料和方法

2.1实验流程图

通过正常及氧化应激条件[20]下对肠致病性大肠杆菌的培养，差速离心[21]提取膜蛋白，对已提取的蛋白质做SDS电泳[22]，MALDI-TOF-MS/MS对差异蛋白进行鉴定分析。

通过差异蛋白的功能分析阐明细菌对氧化应激应答的作用机制。

通过对正常及氧化应激条件下的差异蛋白质组分析，找到相关蛋白，通过对其功能分析来阐明细菌的应答作用机制。

PBS孵育1小时

2.2材料及主要仪器

大肠杆菌菌株K12由浙江理工大学浙江理工大学蛋白质组学与分子酶学研究所保存；

琼脂糖，电泳级SDS、购自BoehringerMannheim公司。

蛋白胨（tryptone）、酵母提取物（YeastExtract）为英国Oxoid公司产品。

NaCl购自上海试四赫维化工有限公司，十二烷基硫酸钠（SDS）、甲叉双丙烯酰胺购自上海双向西巴斯科技发展有限公司，丙烯酰胺购自BIO-RAD公司，甘氨酸（Glycine）、TRISBase购自KH公司，其余试剂为国产分析纯。

主要仪器如下：

超净工作台

上海博讯实业有限公司

紫外/可见分光光度计DU800

BECKMAN公司

pH计Delta320

METTLER公司

台式离心机

Eppendorf公司

高速冷冻离心机

超低温冰箱

Thermo公司

恒温培养摇床

上海智城分析仪器制造有限公司

高压蒸汽灭菌锅

上海医用核子仪器厂

恒温培养箱

超纯水仪

ELGA公司

电子称ALC-110.4

上海精密科学仪器有限公司

DHG-9140A型电热恒温鼓风干燥箱

上海一恒科技有限公司

XB70制冰机

Grant公司

2.3试剂

LB（Luria-Bertani）液体培养基

氯化钠（NaCl）10g

蛋白胨（Tryptone）10g

酵母提取物（Yeastextract）5g

溶于800mL去离子水中，用NaOH调pH至7.0，加去离子水至总体积1L，121℃高压蒸气灭菌20min。

LB固体培养基

在LB液体培养基中加入琼脂粉至终浓度为1.0%，121℃高压蒸气灭菌20min，铺制平板，4℃保存备用。

PBS缓冲液

NaCl8g

KCl0.2g

Na2HPO4•12H2O2.9g

KH2PO40.2g

溶于800mL去离子水中，用NaOH调pH至7.0，加去离子水至总体积1L,121℃高压蒸气灭菌20min。

膜蛋白提取液

50mMTris-HCl

150mMNaCl

10%甘油

0.8%Triton@X-100

向烧杯中分别加入50mMtirs固体，150mMNaCl固体，100ml甘油，8mlTriton@X-100，然后加入800ml去离子水，充分溶解后，用pH计Delta320测量PH，HCl调PH到7.6，然后定容到1L。

10%过硫酸铵（AP）

过硫酸铵0.1g

超纯水1ml

溶解后，4℃保存，保存时间为1周。

（可先将过硫酸铵干粉称好放在EP管中，一次性多装几管，使用时加入超纯水即可）

1.5mol/LTris-HCl（pH8.8）

TrisBase45.43g

超纯水200ml

溶解后，用浓盐酸调pH至8.8，最后用超纯水定容到250ml，室温下保存。

0.5mol/LTris-HCl（pH6.8）

TrisBase15.14g

溶解后，用浓盐酸调pH至6.8，最后用超纯水定容到250ml，室温下保存。

30%Acr/Bic

丙烯酰胺（Acr）29g

甲叉双丙烯酰胺（Bic）1g

超纯水至100ml

溶解后4℃保存，使用时恢复至室温且无沉淀。

10%SDS

SDS10g

蒸馏水至100ml

50℃水浴下溶解，室温保存，如在长期保存中出现沉淀，水浴溶化后，仍可使用。

12%分离胶（2块胶，10ml）

超纯水3.35ml

30%Acr/Bic4ml

1.5mol/LTris-HCl（pH8.8）2.5ml、

10%SDS100μL

TEMED3.3μL/4μL（冬）

AP100μL

4%浓缩胶（2块胶，5ml）

超纯水3ml

30%Acr/Bic667μL

1.5mol/LTris-HCl（pH8.8）1.25ml

10%SDS50μL

TEMED5μL

AP30μL

最后加AP，加完后立即混匀，灌胶。

（为了加快凝胶，可以将AP和TEMED的量加大，一般为原来的2-3倍，视制胶环境温度而定）

电泳缓冲液

50mMTrisBase30.3g

甘氨酸144.1g

加800ml超纯水充分溶解后，定容到1L，这是10x的缓冲液。

使用时需用超纯水稀释10倍。

样品loadingbuffer（2X）

100mMTris-HCl（pH6.8）

4%（w/v）SDS

0.2%（w/v）溴酚蓝

20%甘油（v/v）

200mM巯基乙醇

充分混匀，-20℃保存，使用前在沸水中加热1min。

考马斯亮蓝染色液

考马斯亮蓝R-2501g

甲醇450ml

蒸馏水450ml

冰醋酸100ml

脱色液

乙醇250ml

冰醋酸80ml

超纯水定容至1L。

2.4实验过程

2.4.1大肠杆菌扩大培养[25]

配置液体LB培养基分装到10支试管中，密封，每支试管约2ml；

100ml固体LB培养基于250ml锥形瓶，将这些培养基和洗干净的4个培养皿在121℃，1MPa条件下灭菌20min，于烘箱中烘干，在紫外线灭菌30min的超净工作台中倒平板，从-80℃冰箱中取出大肠杆菌k12菌株，将4支装有2ml左右LB液体培养基的试管放到超净台中，在酒精灯附近用20μL的枪头蘸下，小心丢进试管中，放在37℃恒温摇床上培养过夜（约12h）。

然后在超净台中，用灭菌后的接种环在固体培养基上划线，放到37℃恒温箱中过夜。

待培养基上长出明显的菌斑时，在超净台中，用20μL枪头挑取菌斑分别投入4支含有液体培养基的试管中，酒精灯烧一下管口，然后密封，在37℃恒温摇床上培养过夜（约12h）。

2.4.2氧化应激处理

在超净台中，将培养好的细菌分别倒入4瓶装有500ml液体培养基的锥形瓶中，分别标号1、2、3、4。

将4个锥形瓶放在恒温摇床上，37℃，转速250rpm培养，每隔半个小时，在超净台取1ml于分光光度计中，测量其OD600的值。

经过大约3小时，1号OD600为0.5855，2号OD600为0.5654，3号OD600为0.5862，4号的OD600为0.6144。

取4个500ml已灭菌的离心管，分别标号1、2、3、4。

将锥形瓶中的菌液分别倒入对应的离心管中，每管约300ml，在电子天平上称量，使每两管之间的重量误差在0.05g以内，然后放到离心机中，4500rpm，4℃离心10min，小心倒去上清液，将剩下的菌液倒入对应离心管，重复上述步骤。

向每个离心管中分别加入30mlPBS缓冲液，用1ml枪轻轻吹打，使沉淀充分重悬，将重悬后的溶液用5ml的移液枪转移到50ml离心管中，分别标号1、2、3、4。

然后放到离心机中，4500rpm，4℃离心10min，离心完毕后，小心倾倒去上清液。

将四瓶装有500mlPBS缓冲液的锥形瓶标号1、2、3、4，从中取出30ml缓冲液加入到对应的离心管中，用5ml移液枪充分吹打混匀，然后转移到对应编号的锥形瓶中。

向1、2号锥形瓶中加入10mmol过氧化氢溶液，轻轻摇晃混匀，把混匀的锥形瓶放到恒温摇床上，37℃，200rpm孵育1小时。

2.4.3细胞破碎

将孵育好的大肠杆菌分别从四个锥形瓶取一部分（约300ml）到500ml离心管中，在天平上平衡后，放入离心机，5000rpm，4℃离心10min，然后小心倾去上清液，将锥形瓶中剩余液体倒入离心管中，重复上述步骤，得到沉淀。

向每管中加入10ml膜蛋白提取液，用移液枪轻轻吹打，充分混匀。

然后将液体转移到新的离心管中，分别标号1、2、