基因工程重点Word文件下载.docx

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5、Ⅱ型限制性内切酶命名：

寄主菌属名的第1个字母＋种名的前两个字母＋菌株或质粒代号＋空白＋发现序列（罗马数字）。

如：

EcoRⅠ表示在Escerichiacoli（大肠杆菌）中抗药性R质粒上发现的第一个限制性内切酶。

6、II型限制性核酸内切酶的基本特性：

（一）II型限制性内切酶的识别序列：

识别双链DNA分子中4-8对碱基的特定序列，识别切割序列呈典型的旋转对称型回文结构。

（二）II型限制性内切酶的切割方式：

大部分酶的切割位点在识别序列内部，少数在两侧。

根据产生末端形状两种切割方式：

A、粘性末端（stickyend）:

限制酶在两条DNA链上的切割点不一致，切断的DNA片断的末端上含有一条多个核苷酸的单链，称为粘性末端。

B、平头末端（bluntend）:

切割点位于识别位点的中间，切断的DNA片断具有平齐的末端。

（三）II型限制性内切酶不具备甲基化功能

7、同裂酶：

识别序列相同，切割位点有些相同，称为完全同裂酶，有些不同，称为不完全同裂酶。

8、同尾酶：

来源不同，识别的序列不同，但能切出相同的粘性末端，连接后不能被相关的酶同时切割。

三、连接酶（Ligase）

1、定义：

将两段乃至数段DNA片断拼接起来的酶称为DNA连接酶。

催化实质:

催化DNA链上裂口两侧相邻核苷酸裸露的3’羟基和5’磷酸之间形成磷酸二酯键，使两个断裂的DNA片断连接起来。

2、连接条件：

（1）必须是两条双链DNA上的切口。

（2）DNA3’端有游离的-OH，5’端有游离的磷酸基团。

（3）需要能源，动物或噬菌体细胞中连接酶需要ATP，大肠杆菌等细菌中连接酶需要NAD+。

3、种类：

⑴T4噬菌体DNA连接酶（T4DNA连接酶）：

需要ATP，能连接粘性末端DNA和一条链带切口的双链DNA分子，也能连接平末端。

（2）大肠杆菌连接酶：

需要NAD+，只能连接粘性末端DNA和一条链带切口的双链DNA//*-/*-分子，不能连接平末端。

⑶T4噬菌体RNA连接酶：

T4噬菌体基因63编码的

产物，需要ATP，催化单链DNA或RNA的5’磷酸与相邻的3’羟基共价连接。

四、DNA聚合酶

DNA聚合酶（DNApolymerase）能在引物和模板的存在下，把脱氧核糖核苷酸连续地加到双链DNA分子引物链的3’-OH末端，催化核苷酸的聚合作用。

2、分类：

DNA聚合酶分类（根据模板）：

依赖DNA的聚合酶和依赖RNA的DNA聚合酶

3、基因工程中常用的DNA聚合酶：

1）大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ2）Klenowfragment3）T7DNA聚合酶4）T4DNA聚合酶5）修饰过的T7DNA聚合酶（测序酶）6）逆转录酶7）TaqDNA聚合酶

4、大肠杆菌DNA聚合酶I：

基本性质：

5‘→3‘的DNA聚合酶活性；

5‘→3‘的核酸外切酶活性，切割双链DNA或DNA:

RNA；

3‘→5‘的核酸外切酶活性，切割单链或双链DNA分子。

基本用途：

缺口前移，探针的标记

探针：

能够同某种被研究的核酸序列特异性结合的一段核酸分子。

探针的标记：

让寡聚核酸分子带有标记物（如同位素标记物和非同位素标记物）。

5、Klenow酶：

大肠杆菌DNA聚合酶I经枯草杆菌蛋白酶处理，获得N端三分之二的大肽段，即为Klenow酶。

3‘→5‘的核酸外切酶活性

补平由核酸内切酶产生的5‘粘性末端；

DNA片段的同位素末端标记；

cDNA第二链的合成；

双脱氧末端终止法测定DNA序列。

5‘→3‘的DNA聚合酶活性和3‘→5‘的核酸外切酶活性；

在无dNTP时，可以从任何3‘-OH端外切；

在只有一种dNTP时，外切至互补核苷酸暴露时停止；

在四种dNTP均存在时，聚合活性占主导地位。

（A）切平由核酸内切酶产生的3’粘性末端；

（B）DNA片段的同位素末端标记。

7、反转录酶：

依赖于RNA的DNA聚合酶；

RNA酶H活性，能从5‘或3‘方向双向外切DNA-RNA杂合链中的RNA链。

以mRNA为模板合成cDNA。

8、TaqDNA聚合酶：

分离自极度嗜热的栖热水生菌Thermusaquaticus中，最适反应温度75℃，对95℃高温具良好稳定性，需Mg2+。

主要用于DNA的体外扩增（聚合酶链式反应，即PCR）。

5、末端脱氧核苷酰转移酶（terminaldeoxynucleotidyltransferase，TdT）：

简称末端转移酶

不需要模板的DNA聚合酶，随机掺入dNTPs。

给载体和外源DNA分别加上同聚体尾巴，以便两者在体外连接；

进行DNA的3’-OH末端标记。

6、核酸酶：

定义：

一类能降解核酸的水解酶。

分类：

只作用于RNA的叫做核糖核酸酶；

只作用于DNA的叫做脱氧核糖核酸酶；

既作用于RNA又可作用于DNA的叫做核酸酶。

①核糖核酸酶A：

特点：

低盐（0-100mmol/LNaCl）时，切割单链和双链RNA、DNA:

RNA杂交体中的RNA；

高盐（﹥300mmol/LNaCl）时，特异性切割单链RNA。

用于除去DNA样品中的RNA分子或出去杂交双链中的RNA。

②核糖核酸酶H：

特异性作用于DNA-RNA杂交分子中的RNA链；

与大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ和DNA连接酶一起参与cDNA文库建立时除去RNA链以便第二条链cDNA链的合成。

③脱氧核糖核酸酶I：

具内切酶活性，作用于单链或双链DNA，但无核苷酸序列特异性。

当酶浓度很低时，双链DNA分子上将形成切口，但不同类型二价阳离子对两条链上切口位置形成有不同影响：

Mg2+存在时，两条链上的切口独立无关；

Mn2+存在时，两条链上的切口几乎在同一位置。

1）与大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ切口移位，制备DNA探针；

2）制备RNA样品时除去DNA分子；

3）基因突变时产生切口。

④S1核酸酶：

基本特性：

降解单链DNA的速度比降解双链DNA快75000倍。

Zn2+必需；

最适pH范围为4.0-4.3；

需要NaCl10-300mM；

降解单链DNA的速度比降解单链RNA快7倍。

7、碱性磷酸酶：

（1）5’末端标记前的处理。

（2）去除DNA片断的5‘磷酸基团，防止自身连接。

第三章基因工程载体

1、基因工程载体（载体）的定义：

基因工程中能携带外源基因进入受体细胞的运载工具称为基因工程载体（vector）

功能：

运送外源基因高效转入受体细胞；

为外源基因提供复制能力或整合能力；

为外源基因的扩增或表达提供必要的条件。

应具备的条件：

具有针对受体细胞的亲缘性或亲和性；

具有与特定受体细胞相适应的复制位点或整合位点；

具有较高的外源DNA的载装能力；

具有多种单一的核酸内切酶识别切割位点（MCS）；

具有合适的筛选标记。

2、质粒载体

基因工程中的质粒载体，主要是以细菌质粒的各种元件为基础组建而成：

复制必需区、选择标记基因和限制性核酸内切酶的酶切位点（克隆位点）。

①质粒的一般生物学特性：

分子特性：

三种不同的构型：

①闭合环状DNA（closedcircleDNA,ccDNA）,通常呈超螺旋构型（supercoil），即SC构型。

②开环DNA（opencircleDNA,ocDNA）即为OC构型。

线性DNA（linerDNA,lDNA）,即L构型。

自主复制性：

质粒能利用寄主细胞的DNA复制系统进行自主复制，质粒DNA上的复制子结构决定了质粒与寄主的对应关系，根据在每个细胞中的分子数（拷贝数）多寡，质粒可分为两大复制类型，严紧型复制控制的质粒（1-3拷贝）和松弛型复制控制的质粒（10-200拷贝）。

不相容性：

在没有选择压力的情况下，两种不同质粒不能够在同一个宿主细胞系中稳定的共存的现象称为质粒的不相容性，不相容性的质粒组成不相容性群（不亲合群）。

利用同一复制系统的不同质粒不能在同一宿主细胞中共同存在,当两种质粒同时导入同一细胞时,它们在复制及随后分配到子细胞的过程中彼此竞争,在一些细胞中,一种质粒占优势,而在另一些细胞中另一种质粒却占上风。

当细胞生长几代后,占少数的质粒将会丢失,因而在细胞后代中只有两种质粒的一种，这种现象称质粒的不相容性（Incompatibility）。

可转移性：

质粒的转移性是指质粒从一个细胞转移到另一个细胞的特性。

根据质粒是否携带控制细菌配对和质粒接合转移的基因，可将质粒分为接合型（conjugative）和非接合型（nonconjugeative）。

接合型质粒:

能在天然条件下自发地从一个细胞转移到另一个细胞（接合作用），如F质粒等。

非接合型质粒:

不能在天然条件下独立地发生接合作用，如ColE1。

质粒的迁移作用:

如果在宿主细胞中存在一种相容的非接合型质粒，那么它也通常会被转移。

这种由共存的接合型质粒引发的非接合型质粒的转移，叫做质粒的迁移作用。

携带特殊的遗传标记：

物质抗性：

如抗生素、重金属离子、有机物等；

物质合成：

如细菌毒素、有机碱。

②理想质粒载体的必备条件：

①具有较小的分子量和较高的拷贝数；

②具有若干限制性核酸内切酶的单一酶切位点（）；

③具有两种以上的选择性标记基因；

④缺失mob基因；

插入外源基因的重组质粒较易导入宿主细胞并复制和表达。

③常用的质粒载体类型（各类型定义）：

克隆质粒载体：

是指专用于基因或DNA片断无性繁殖的质粒载体。

表达质粒载体：

是指专用于在宿主细胞中高水平表达外源蛋白质的质粒载体。

多功能质粒载体：

这类载体具有多种功能，它可以根据需要进行基因克隆、转录、测序、表达等方面的基因操作。

穿梭质粒载体（shuttleplasmidvector）是指一类由人工构建的具有两种不同复制起点和选择标记，可以在两种不同的宿主细胞中存活和复制的质粒载体。

通常在原核细胞和真核细胞中穿梭。

（1）克隆质粒载体pBR322（会分析质粒图谱）

pBR322特征：

①分子量较小②具有两种选择标记：

Ampr和Tetr③多克隆位点（mutiplecloningsites,MCS）④松弛型复制拷贝数50-100/cell。

质粒载体pBR322的应用：

将外源DNA片断在BamHⅠ、SalⅠ或PstⅠ位点插入（插入其中一个抗生素抗性基因之中），筛选：

Tetr/Amps或Tets/Ampr

（2）质粒载体pUC18/19（会分析质粒图谱）

特征：

①pBR322的复制起始位点；

②Ampr；

③选择颜色标记lacZ’；

④装有多克隆位点（MCS）；

⑤拷贝数2000–3000/cell。

3、噬菌体载体

λ-DNA载体的构建：

1、缩短长度；

2、删除重复的酶切位点；

3、加装选择标记。

噬菌体载体：

特点①λ-DNA可在体外包装成噬菌体颗粒，能高效转染大肠杆菌；

②λ-DNA载体的装载能力为20kb左右，远远大于质粒的装载量；

③重组λ-DNA分子的筛选较为方便；

④重组λ-DNA分子的提取较为简便；

⑤λ-DNA载体适合克隆和扩增外源DNA片段，但不适合表达外源基因。

4、柯斯质粒：

是一种带有黏性末端位点的质粒，又称黏粒质粒。

构建：

是一种以噬菌体为基础为克隆大片段而设计并和质粒共同构建的杂合载体，具有噬菌体的COS位点和质粒的复制子，具有噬菌体和质粒的双重特征。

柯斯质粒载体的特征：

（1）具有噬菌体的特点：

具有COS位点，体外包装成噬菌体颗粒环化，高效感染宿主。

（2）具有质粒载体的特点:

在寄主内复制和具抗生素抗性基因。

（3）克隆能力强：

40-50KB

5、人工染色体（定义）：

将细菌接合因子或酵母菌染色体上的复制区、分配区、稳定区与质粒组装在一起，即可构成染色体载体。

第四章核酸操作的基本技术

1、核酸提取技术

制取核酸样品的基本要求：

保持核酸的完整性，即保持天然状态。

A防止核酸酶对核酸的降解；

B防止化学因素和物理因素引起核酸变性或破坏。

提取核酸的三个步骤：

（1）细胞破碎；

（2）除去与核酸结合的蛋白质及多糖脂等杂质；

（3）除去其他杂质核酸。

（一）基因组DNA提取：

（1）CTAB—十六烷基三乙基溴化铵法提取原理：

CTAB溶解细胞膜、与核酸形成复合物，高盐溶液（0.7mol/LNaCl）中可溶，降低溶液盐浓度，低盐溶液（0.3mol/LNaCl）从溶液中沉淀，离心，CTAB与核酸复合物沉淀（与蛋白等物质分离，高盐溶液，复合物溶解，加入乙醇，核酸沉淀（CTAB溶于乙醇），从而将核酸和CTAB分离，核酸得到纯化

（2）SDS法——十二烷基磺酸钠法提取原理：

SDS（十二烷基磺酸钠）在较高温度（55-65℃）条件下裂解细胞、染色体离析、蛋白质变性、释放出核酸，提高盐浓度、降低温度，蛋白质、多糖沉淀，离心，得上清液，反复抽提去除蛋白质，乙醇沉淀核酸，核酸得到纯化。

（二）质粒提取方法：

碱裂解法、煮沸法、SDS法等

碱裂解法提取原理：

是基于DNA的变性和复性差异而分离的。

碱性条件使DNA变性，再将pH值调到中性，则质粒DNA能够正确复性并溶解于水中，而染色体DNA不能复性，缠结成网状物质，通过离心除去。

（三）RNA提取：

常采用TRIZOL法，TRIZOL法提取总RNA的原理：

TRIZOL试剂中的主要成分为异硫氰酸胍和苯酚，其中异硫氰酸胍可裂解细胞，促使核蛋白体的解离，使RNA与蛋白质分离，并将RNA释放到溶液中。

当加入氯仿时，它可抽提酸性的苯酚，而酸性苯酚可促使RNA进入水相，离心后可形成水相层和有机层，这样RNA与仍留在有机相中的蛋白质和DNA分离开。

水相层（无色）主要为RNA，有机层（黄色）主要为DNA和蛋白质。

2、核酸的检测与保存：

检测DNA/RNA的相对完整性方法：

琼脂糖凝胶电泳

DNA/RNA的质量鉴定方法：

DNA/RNA的纯度：

测紫外吸收值，OD值

吸收峰：

DNA/RNA紫外光260nm

蛋白质紫外光280nm

比值：

OD260/280=1.8-2.0较纯

OD260/280<

1.8-2.0杂质多

DNA浓度（µ

g/ml）=OD260值×

50μg/mL×

稀释倍数

RNA浓度（µ

40μg/mL×

单链DNA∶1OD=40μg/ml

双链DNA∶1OD=50μg/ml

3、凝胶电泳技术

㈠电泳：

带电物质在电场中向相反电极移动的现象称为电泳。

㈡凝胶电泳分离核酸分子的原理：

在碱性环境下，核酸分子带负电荷，在外加电场的作用下，分子在凝胶滤孔中从负极向正极泳动，其中主要由于分子筛效应和电荷效应达到分离不同大小核酸分子的目的。

㈢分类：

常用琼脂糖凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳；

琼脂糖：

一种从红色海藻产物琼脂中提取的线性多糖聚合物。

加热到沸点后冷却凝固便会形成良好的电泳介质。

聚丙烯酰胺凝胶由丙烯酰胺和交联剂亚甲基双丙烯酰胺在催化剂过硫酸铵的催化下形成。

㈣琼脂糖凝胶电泳特点：

①操作简单；

②分辨范围：

100bp-60kb；

③有效范围：

200bp-50kb；

④分辨率：

100bp左右。

聚丙烯酰胺凝胶电泳特点：

①常用于微卫星、测序分析；

5-500bp；

分辨率：

1bp。

单体有神经毒性。

㈤电泳指示剂：

常用溴酚蓝或二甲苯腈。

电泳指示剂作用：

（1）预知电泳的速率及方向；

（2）使样品呈现颜色，便于加样。

㈥DNA染色剂：

常用

（1）荧光染色剂，溴化已锭（EB,Ethidiumbromid）；

染色后紫外光下发白光；

（2）硝酸银（常用于聚丙烯酰胺凝胶的染色）：

常用0.1%；

（3）Goldview染料：

吸收紫外光，放出绿光（双链DNA）或橙红色光（单链DNA）。

㈦凝胶电泳过程：

①制胶：

称取一定量的琼脂糖用电泳缓冲液融解后倒入制胶槽配制；

②放胶：

胶放入电泳槽，加入电泳缓冲液至没过胶2－3mm,

③点样：

把DNA样品加入上样缓冲液混匀上样

④电泳：

接通电源，调好电压

⑤看结果：

紫外光观察。

4、核酸杂交技术

核酸杂交定义：

互补的核苷酸序列通过Waltson-Crick碱基配对形成稳定的杂合双链DNA分子、DNA-RNA分子的过程称为杂交。

主要类型及特点：

①Southern杂交，探针：

DNA，被检测对象：

DNA；

②Northern杂交，探针：

③Western杂交,探针：

抗体，被检测对象：

抗原；

④菌落原位杂交，探针：

DNA。

杂交三要素：

1、探针（DNA、RNA或抗体）；

2、被检测的对象（DNA、RNA或蛋白质）3、杂交膜:

硝酸纤维素滤膜、尼龙膜和Whatman541滤纸等。

探针定义：

探针是指经放射性或非放射性等物质标记的已知或特定的DNA或RNA序列。

探针分类：

按核酸分子的不同可分为DNA探针和RNA探针；

根据标记物的不同：

可分放射性标记探针和非放射性标记探针。

标记方法：

①放射性同位素32P、35S标记核酸探针：

A、切口平移法B、随机引物合成法。

放射性同位素标记方法优点：

灵敏度高；

特异性高；

方法成熟简便。

放射性同位素标记方法缺点：

半衰期短，需要经常标记探针；

费用高；

放射自显影的时间长；

放射性同位素对人体有害、实验室和环境容易被污染放射性废物处理困难。

②非放射性标记--化学标记法：

包括生物素、地高辛、荧光素、辣根过氧化物酶标记等

第五章PCR技术

⑴PCR（polymerasechainreaction）定义:

聚合酶链式反应PCR又称体外扩增技术，指在DNA变性温度下，DNA双链变性双螺旋解开成单链DNA，在退火温度中人工合成的特异引物根据碱基互补配对原则与单链DNA特异结合，然后在DNA聚合酶的作用下，在延伸温度下不同的脱氧核苷酸按照碱基互补配对原则在引物的引导下合成与模板DNA互补的新链，实现DNA的扩增的技术。

⑵聚合酶链式反应PCR扩增原理：

加热或其他理化因素作用可以使DNA双螺旋氢键断裂，空间结构破坏，DNA双链解开成两条单链的DNA，这称为DNA的变性（Denature）。

解除变性条件之后，变性的核酸重新通过碱基配对缔合成为双螺旋结构的过程称为复性（Renature）,若变性条件为加热，则复性的冷却过程称为退火（Annealing）。

⑶PCR反应过程：

变性温度下，DNA双链变性双螺旋解开成单链DNA，在退火温度中人工合成的特异引物根据碱基互补配对原则与单链DNA特异结合，然后在DNA聚合酶的作用下，在延伸温度下不同的脱氧核苷酸按照碱基互补配对原则在引物的引导下合成与模板DNA互补的新链，实现DNA的扩增。

⑷PCR每个反应三步:

1、变性，膜板DNA置于95℃，双链DNA的双链解开变成单链DNA；

2、退火，将反应体系的温度降到55℃左右，使得一对引物能分别与变性后的两条膜板链相配对；

3、延伸，将反应体系温度调整到TagDNA聚合酶作用的最适温度72℃，以目的基因为膜板，合成新的DNA链。

十二字反应过程：

高温变性、低温退火、中温延伸。

⑸PCR反应体系：

体系成分：

模板DNA、引物、Taq酶（热稳定性）、dNTP、反应缓冲液（Mg2+、BSA、Tween20、DTT、Tris.HCl）。

⑹PCR反应条件：

①变性温度和时间：

变性温度要求变性彻底，但要考虑聚合酶的半衰期：

92.5℃（2小时）94℃（40min）97℃（5min），常采用94℃，变性比较彻底，酶的半衰期也较长。

②引物退火温度与时间：

引物（primer），是一小段单链DNA或RNA，作为DNA复制的起始点，引物退火温度和所需时间主要取决于引物的长度、浓度和碱基组成；

退火温度与解链温度Tm的关系：

低五度；

退火温度一般在55-72℃；

引物G+C含量高、长度较长并与模板完全匹配时，应提高退火温度；

时间一般为30秒到60秒。

③延伸温度与时间：

与聚合酶有关，Taq酶72℃最佳，也有用68℃如LaTaq酶。

扩增时间多采用1min。

④循环数：

25-35cycles之间，过多则非特异扩增增加及平台效应。

平台效应指PCR循环后期，合成的产物达0.3-1pmol时，由于产物的堆积，使原来以指数增加的速率变成平坦曲线，扩增产物不再随循环次数明显上升。

⑺PCR技术的特点：

①高度的灵敏性；

②特异性；

③操作简便易行。

⑻PCR种类

反向PCR（InversePCR）：

是用反向的互补引物来扩增两引物以外的DNA片段对某个已知DNA片段两侧的未知序列进行扩增。

可对未知序列扩增后进行分析,如探索邻接已知DNA片段的序列；

用于仅知部分序列的全长cDNA的克隆,扩增基因文库的插入DNA；

建立基因组步移文库。

反转录PCR（ReversetranscriptionPCR,RT-PCR）：

将RN