纸色谱法分离氨基酸实验报告文档格式.docx

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（二）试剂

1.扩展剂（水饱和的正丁醇和乙酸混合液）

将正丁醇和乙酸以体积比4?

1在分液漏斗中进行混合，所得混

合液再按体积比5?

3与蒸馏水混合;

充分振荡，静置后分层，放

出下层水层，漏斗内即为扩展剂。

2.氨基酸溶液

0.5%赖氨酸、脯氨酸、亮氨酸以及它们的混合液（各组份均为

0.5%）。

?

3.显色剂

0.1%水合茚三酮正丁醇溶液。

【实验步骤】

1.准备滤纸

取层析滤纸（长22?

、宽14?

）一张，在纸的一端距边缘2,3?

处用铅笔划一条直线，在此直线上每间隔3?

作一记号，如右图所示。

2.点样

用毛细管将各氨基酸样品分别点在这4个位置上，干后重复点样2,3次。

每点在纸上扩散的直径最大不超过3mm。

3.扩展

用线将滤纸缝成筒状，纸的两边不能接触。

将盛有约20ml扩展剂的培养皿迅速置于密闭的层析缸中，并将滤纸直立于培养皿中（点样的一端在下，扩展剂的液面需低于点样线1?

）。

待溶剂上升15,20?

时即取出滤纸，用铅笔描出溶剂前沿界线，自然干燥或用吹风机热风吹干。

4.显色

用喷雾器均匀喷上0.1%茚三酮正丁醇溶液，然后用吹风机吹干或者置烘箱中（100?

）烘烤5min即可显出各层析斑点。

5.计算

计算各种氨基酸的Rf值。

【要点提示】

1.取滤纸前，要将手洗净，这是因为手上的汗渍会污染滤纸，并尽可能少接触滤纸;

如条件许可，也可戴上一次性手套拿滤纸。

要将滤纸平放在洁净的纸上，不可放在实验台上，以防止污染。

2.点样点的直径不能大于0.5?

，否则分离效果不好，并且样品用量大会造成“拖尾巴”现象。

3.在滤纸的一端用点样器点上样品，点样点要高于培养皿中扩展剂液面约1cm。

由于各氨基酸在流动相（有机溶剂）和固定相（滤纸吸附的水）的分配系数不同，当扩展剂从滤纸一端向另一端展开时，对样品中各组分进行了连续的抽提，从而使混合物中的各组分分离。

【思考题】

1.纸层析法的原理是什么,

2.何谓Rf值,影响Rf值的主要因素是什么,

篇二:

生物化学实验二——纸层析法分离氨基酸

实验二氨基酸的分离鉴定——纸层析法

一、实验目的

1、掌握氨基酸纸层析的方法和原理，学会分析待测样品的氨基酸成分。

2、学习用纸层析法分离、鉴定氨基酸

二、实验原理

纸层析是以滤纸为惰性支持物的分配层析。

滤纸纤维上的羟基具有亲水性，吸附一层水作为固定相，有机溶剂为流动相。

当有机相流经固定相时，物质在两相间不断分配而得到分离。

溶质在滤纸上的移动速度用Rf值表示:

Rf=原点到层析斑点中心的距离/原点到溶剂前沿的距离

在一定的条件下某种物质的Rf值是常数。

Rf值的大小与物质的结构、性质、溶剂

系统、层析滤纸的质量和层析温度等因素有关。

本实验利用纸层析法分离氨基酸。

三、实验器材

a）大烧杯（5000mL）:

1只/组

b）毛细管。

c）喷雾器:

公用。

d）培养皿:

1只/组。

e）层析滤纸（长22cm、宽14cm的新华一号滤纸）:

1张/组。

f）直尺、铅笔:

自备。

g）电吹风:

h）托盘、针、白线:

1套/组。

i）手套:

1双/组。

j）塑料薄膜:

k）小烧杯:

50mL，1只/组。

四、实验试剂

（1）扩展剂:

将4体积正丁醇和1体积冰醋酸放入分液漏斗中，与5体积水混合，充分振荡，静置后分层，弃去下层水层。

（2）氨基酸溶液:

0.5%的已知氨基酸溶液3种（亮氨酸、赖氨酸、苯丙氨酸、缬氨酸，脯氨酸氨酸），0.5%的待测氨基酸液1种。

（3）显色剂:

五、实验操作

检查培养皿是否干燥、洁净;

若否，将其洗净并置于干燥箱内120?

烘干。

（1）平衡:

剪一大块塑料薄膜铺在桌面上，将层析缸或大烧杯到置于塑料薄膜上，再把盛有约20mL展层溶液的小烧杯置于倒置的层析缸或大烧杯中，用塑料薄膜密封起来，平衡20min。

（2）规划:

带上手套，取宽约14cm、高约22cm的层析滤纸一张。

在纸的下端距边缘2cm处轻轻用铅笔划一条平行于底边的直线A，在直线上做4个记号，记号之间间隔2cm，这就是原点的位置。

另在距左边缘1cm处画一条平行于左边缘的直线B，在B线上以A、B两线的交点为原点标明刻度（以厘米为单位），参见左图。

（3）点样:

用毛细管浸液取样，点在这四个位置上。

同一位置上需点2,3次，每点完一点，立刻用电吹风热风吹干后再点，以保证每点在纸上扩散的直径最大不超过3mm。

每人须点4个样，其中3个是已知样，1个是待测样品。

（4）层析:

用针、线将滤纸缝成筒状，纸的两侧，边缘不能接触且要保持平行，参见图3-3。

向培养皿中加入扩展剂，使其液面高度达到1cm左右，将点好样的滤纸筒直立于培养皿中（点样的一端在下，扩展剂的液面在A线下约1cm），罩上大烧杯，仍用塑料薄膜密封。

当上升到12,15cm，取出滤纸，剪断连线，立即

用铅笔描出溶剂前沿线，迅速用电吹风热风吹干。

（5）显色:

用喷雾器在通风厨中向滤纸上均匀喷上0.1%茚三酮正丁醇溶液，然后立即用热风吹干，即可显出各层析斑点，参见右图。

（6）计算各种氨基酸的Rf值，并判断混合样品中都有哪些氨基酸，各人将自己的实验结果贴在实验报告上，见表3-2。

（7）实验完毕，倒掉用过的展层液和平衡液，将培养皿洗净，整理好桌面上的仪器和试剂，并注意清洁自己的操作台，请老师验收，实验报告当场交给老师。

计算:

Rf=原点到层析斑点中心的距离/原点到溶剂前沿的距离

六、注意事项

.点样时要避免手指或唾液等污染滤纸有效面（即展层时样品可能达到的部分）。

.点样斑点不能太大，防止层析后氨基酸斑点过度扩散和重叠，且点样后吹风温度不宜过高，以免样品变性（斑点发黄）。

.展层开始时切勿使样品点浸入溶剂中。

.展层剂要临用前配制，以免发生酯化，影响层析结果。

.如果样品中溶质种类较多，且某些溶质在某一溶剂系统中的Rf值十分接近时，单向层析分离效果不佳，则可采用双向层析，即将样品点在一方形滤纸的角上，先用一种溶剂系统展层。

滤纸取出干燥后，再将滤纸转90度角，用另一溶剂系统展层。

所得图

谱分别与这两种溶剂系统中作的标准物质层析图谱对比，即可对混合物样品中各成分进行鉴定。

篇三:

实验三__纸色谱

实验三纸色谱

一、实验原理、方法、注意事项1、原理

纸层色谱为在纸上将混合物进行分离的色谱方法，分为分析型和制备型纸层色谱。

多数

情况下，纸层色谱的原理属于分配色谱原理，色谱滤纸为支持剂，滤纸纤维可以吸附25%,

30%的水分，其中6,7%的水分和滤纸结构中的羟基以氢键结合，为固定相。

其他溶剂可

自由通过，为流动相。

流动相流经支持物时，与固定相之间连续抽提，使物质在两相间不断

分配而得到分离。

物质被分离后在纸

色谱图谱上的位置用Rf值（比（转载于:

wWw.xIeL写论文网:

纸色谱法分离氨基酸实验报告）移值）来表示:

Rf值=原点到色谱点中心的距离/原点到溶剂前沿的距离

在一定条件下某种物质的Rf值是常数，其大小受物质的结构、性质、溶剂系统物质组

成与比例、pH值、选用滤纸质地和温度等多种因素影响。

此外，样品中的盐分、其他杂质

以及点样过多均会影响的有效分离。

但由于影响比移值的因素

较多，因而一般采用在相同实

验条件下与对照物质对比以确定其异同。

作为药品的鉴别时，供试品在色谱中所显主斑点的

颜色（或荧光）与位置，应与对照品在色谱中所显的主斑点相同。

作为药品的纯度检查时，

可取一定量的供试品，经展开后，按各药品项下的规定，检视其所显杂质斑点的个数或呈色

（或荧光）的强度。

作为药品的含量测定时，将主色谱斑点剪下洗脱后，再用适宜的方法测

定。

无色物质的纸色谱图谱可用光谱法（紫外光照射）或显色法鉴定，氨基酸纸色谱图谱常

用茚三酮显色法鉴定。

纸层色谱适用于极性较大的亲水性化合物或极性差别较小的化合物的

分离。

2、实验方法

之饱和，一般可在展开室底部放一装有规定溶剂的平皿或将浸有规定溶剂的滤纸条附着在展

开室内壁上，放置一定时间，俟溶剂挥发使室内充满饱和蒸气。

然后添加展开剂使浸没溶剂

槽内的滤纸，展开剂即经毛细管作用沿滤纸移动进行展开，展开至规定的距离后，取出滤纸，

标明展开剂前沿位置，俟展开剂挥散后按规定方法检出色谱斑点。

（2）上行法

点样方法同下行法。

展开室内加入展开剂适量，放置俟展开剂蒸气饱和后，再下降悬钩，

使色谱滤纸浸入展开剂约0.5cm,展开剂即经毛细管作用沿色谱滤纸上升，除另有规定外，

一般展开至约15cm后，取出晾干，按规定方法检视。

展开可以向一个方向进行，即单向展开;

也可进行双向展开,即先向一个方向展开,取出，

俟展开剂完全挥发后，将滤纸转动90?

再用原展开剂或另一种展开剂进行展开;

亦可多次展

开、连续展开或径向展开等。

3、注意事项

[1]层析纸使用前，应在烘箱中干燥，具体方法为100度的温度下，烘1~2小时。

否则会

产生拖尾现象。

[2]画线时只能使用铅笔，不能使用其它的笔。

其它笔的颜色为有机染料，在有机溶剂中

染料溶解，颜色会产生干扰。

[3]无论是画线还是点样，不能用手接触层析纸前沿线以下的任何的部位，因为，手指上

有相当量的氨基酸，并足以在本实验方法中检出干扰实验。

[4]纸层析须在密闭容器中展开。

加入展开剂后，再等20分钟左右，使标本缸内形成此

溶液的饱和蒸汽。

[5]喷有显色剂的层析纸，在烘干时应注意温度的控制，温度太高，不但氨基酸会产生颜

色，茚三酮也会产生颜色干扰实验现象。

[6]Rf值随分离化合物的结构，固定相与流动相的性质、温度以及纸的质量等因素而变化。

当温度、滤纸等实验条件固定时，比移值就是一个特有的常数，因而可作定性分析的依据。

二、实验——用纸色谱法分离氨基酸

（一）实验目的

通过对氨基酸的分离，学习运用纸色谱法分离混合物的基本原理，掌握纸色谱的操作方

法。

（二）药品和仪器

1（仪器

层析缸毛细管（内径为0.5mm）层析纸喷雾器

7.5cm×

15cm标本缸新华1号（5×

14cm。

）直尺、铅笔

2（试剂

0.1,甘氨酸水溶液0.1,亮氨酸水溶液0.1,茚三酮乙醇溶液

正丁醇甲酸未知液

（三）实验原理

（参见本节一、1、）

（四）实验步骤

1、层析纸的准备:

将活化[1]的一张5×

14厘米的层析纸条，在离底边1.5厘米处用铅笔[2]画一直线作为始

线，在起始线上点A、B、C三个点，各点之间的距离为1.5厘米，A、C两点分别离层析纸

边为1厘米，在起始线7厘米处画一直线作为溶剂前沿线[3]。

见图5。

2、点样。

取内径约0.5mm的毛细管三小段，分别插入试样溶液中，借毛细虹吸现象吸取溶液少

许，在A上点甘氨酸溶液，B上点未知液，C上点亮氨酸溶液，样点的直径约2,3mm，如

溶液太稀，第一次点样，吹干后，再点第二、第三次，每次都要点在同一位置上。

3、展开:

将30毫升展开剂（正丁醇:

甲酸:

水/5:

3:

2）倒入层析缸中，盖上盖子，饱和20分

钟后[4]，再将点好样品的层析纸上端用回形针别住，把层析纸悬挂在层析缸盖的钩上，使层

析纸的底边浸入展开剂0.5厘米，如图9所示。

展开剂到达前沿线后，展开完毕，取出层析

纸，晾干或红外灯下烘干。

4、显色:

将烘干的层析纸，用喷雾器喷洒显色剂（茚三酮溶液），再到红外灯下烘到显色为止[5]。

5、计算各氨基酸的Rf值:

用笔画出斑点，找出斑点的中心距离，并量出起始线至斑点中心的距离，如图6所示。

根据下列公式计算各氨基酸的Rf值，并将纯样品和未知样品的Rf值进行对照，鉴定未液[6]。

图5层析纸的准备图6斑点图9展开1,层析缸2,层析纸3,展开剂

Rf?

起始线至斑点中心的距离

起始线至溶液前沿线的距离

图7层析纸的操作

（五）思考题

1、展开剂的液面高出滤纸上的样点，将会产生什么后果

2、纸色谱为什么要在密闭的容器中进行,

3、根据亮氨酸[（CH3

）2CH2CH（NH2）COOH]与谷氨酸[HOOCCH2CH2CH（NH2）COOH]的结构式判断何者Rf值大?

为什么,

4、纸层析中影响Rf值的因素有哪些,

5、简述薄层色谱的基本原理和主要应用。