WesternBlot详解和常见问题Word文档格式.docx

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western显色的方式要紧有以下几种：

现经常使用的有底物化学发光ECL和底物DAB呈色，体同水平和实验条件的是用第一种方式，目前发表文章一般是用底物化学发光ECL。

只要买现成的试剂盒就行，操作也比较简单，原理如下（二抗用HRP标记）：

反映底物为过氧化物+鲁米诺，如碰到HRP，即发光，可使胶片曝光，就可洗出条带。

一、丙烯酰胺和N，N’-亚甲双丙烯酰胺，应以温热（以利于溶解双丙稀酰胺）的去离子水配制含有29%（w/v）丙稀酰胺和1%（w/v）N，N’-亚甲双丙烯酰胺贮存液丙稀酰胺29g，N，N-亚甲叉双丙稀酰胺1g，加H2O至100ml。

）储于棕色瓶，4℃避光保留。

严格核实PH不得超过，因能够发生脱氨基反映是光催化或碱催化的。

利用期不得超过两个月，隔几个月须从头配制。

如有沉淀，能够过滤。

二、十二烷基硫酸钠SDS溶液:

10%（w/v），1mlH2O去离子水配制，室温保留。

3、分离胶缓冲液:

LTris-HCL:

和48ml1mol/LHCL混合，加水稀释到100ml终体积。

过滤后40C保留。

4、浓缩胶缓冲液:

溶于40mlH2O中，用约48ml1mol/LHCL调至加水稀释到100ml终体积。

这两种缓冲液必需利用Tris碱制备，再用HCL调剂PH值，而不用。

五、TEMED原溶液N，N，N’N’四甲基乙二胺催化过硫酸铵形成自由基而加速两种丙稀酰胺的聚合。

PH太低时，聚合反映受到抑制。

10%（w/v）过硫酸胺溶液。

提供两种丙稀酰胺聚合所必需的自由基。

去离子水配制数ml，临用前配制.

六、SDS-PAGE加样缓冲液:

LTris缓冲液8ml，甘油，10%SDS，巯基乙醇，%溴酚蓝，H2O32ml混匀备用。

按1:

1或1:

2比例与蛋白质样品混合，在滚水终煮3min混匀后再上样，一样为20-25ul，总蛋白量100μg。

7、Tris-甘氨酸电泳缓冲液:

，188g甘氨酸，10gSDS，用蒸馏水溶解至1000ml，得LL甘氨酸电极缓冲液。

临用前稀释10倍。

八、转移缓冲液：

配制1L转移缓冲液，需称取甘氨酸、碱、SDS，并加入200ml甲醇，加水至总量1L。

九、丽春红染液贮存液：

丽春红S2g三氯乙酸30g磺基水杨酸30g加水至100ml历时上述贮存液稀释10倍即成丽春红S利用液。

利用后应予以废弃。

10、脱脂奶粉5%（w/v）。

1一、NaN3%叠氮钠（有毒，戴手套操作），溶于磷酸缓冲盐溶液（PBS）。

1二、Tris缓冲盐溶液（TBS）:

20mmol/LTris/HCL，500mmol/LnaCl。

13、Tween20（15）鼠抗人-MMP-9（16）鼠抗人-TIMP-1。

14、过氧化物酶标记的第二抗体。

1五、NBT（溶于70%二甲基甲酰胺，75mg/ml）。

1六、BCIP（溶于100%二甲基甲酰胺，50mg/ml）。

17、100mmol/LTris-HCL。

1八、100mmol/LNaCl。

1九、50mmol/LTris-HCL，5mmol/LEDTA。

（能够参看分子克隆）

在这要紧列举了一些网站上的有关WesternBlot的英文资料，读者能够依照自己实验室的实际情形进行调整：

WesternBlotPROTOCOL：

一、PreparationofBrainMembraneFractionsforWesternBlot

二、WesternBlotting

3、WesternBlots

4、WesternBlotting

五、GeneralWesternBlotProtocol

六、WesternBlot&

Immunostaining

7、WesternBlotAnalysisforTissue

八、WesternBlotting

九、ECMProtocolsWesternBlot

10、WesternBlottingUsingChemilμminscence

1一、FarWesternBlotting

1二、Enzyme-AssistedImmunoelectroblotitng

13、WesternTroubleShooting

14、TooManyBandsonWesternBlot

Tipsandhintsforthestorageofantibodies

5）实验常见的问题指南

依照问题的类型要紧分成以下几类（以下资料权作参考，请勿盲目仿照！

）：

A.对初学者看什么资料比较好？

解答：

《抗体技术实验指南》和Antibodies（alaboratorymanual，wrotebyEdHarlow，davidlane）两本书不错。

B.做线粒体膜UCP2蛋白的WesternBlot（以下简写成WesternBlot），提取线粒体后冻存（未加蛋白酶抑制剂），用的博士德的一抗，开始还有点痕迹，此刻愈来愈差，上样量已加到120μg，换了个santacloz的一抗仍不行。

是什么缘故？

蛋白酶抑制剂单加PMSF行吗？

疑心是样品问题，可能是：

1，样品不能反复冻融；

2，样品未加蛋白酶抑制剂。

同时，建议检查WesternBlot进程，提高一抗浓度。

关于加蛋白酶抑制剂来讲，一样加PMSF就能够够了，最好能多加几中种蛋白酶抑制剂。

C.细胞水平要做WesternBlot，多少细胞提的蛋白够WesternBlot？

一样地5*106就足够了。

D.同一样品能同时提RNA又提蛋白吗，如此对WesternBlot有无阻碍?

能，没有问题，咱们做过。

E.同一蛋白样品能同时进行两种因子的WesternBlot检测吗？

固然能够，有的乃至能够同时测几十种样品。

F.若是目标蛋白是膜蛋白或是胞浆蛋白，操作需要注意什么？

若是是膜蛋白和胞浆蛋白，所用的去垢剂就要温和得多，这时最好加上NaF去抑制磷酸化酶的活性。

G.我的样品的蛋白含量很低，每微升不到1微克，可是在转膜时常常会发觉只有一部份蛋白转到了膜上，确实是在转膜后染胶发觉有的孔所有的蛋白条带都在，只是颜色变淡了，有什么方法能够解决？

你能够加大上样量，没有问题，还有转移时你能够用减少电流延长时刻，多加5－10％甲醇。

H.想分离的蛋白是分子量260kd的，SDS-PAGE电泳的分离胶浓度多大适合？

积层胶的浓度又该用多少？

这么大分子量的蛋白容易作WesternBlot吗？

260kd的蛋白不行做，分离胶用6％，StackingGel％。

I.若是上样量超载，要用什么方式来增加上样量？

若是需要加大上样量使原先弱的条带能看清楚。

能够浓缩样品，也能够依照你的目标分子量透析掉一部份小分子蛋白。

一样地，超载30％是可不能有问题的。

若是已经超了很多了，而且小分子量的也要，能够考虑加大胶的厚度，能够试试的comb。

J.蛋白变性后能够寄存多久？

－80℃，一两年没有问题。

最关键两条：

不要被蛋白酶水解掉；

不要被细菌消化掉（也是被酶水解了）。

K.我所测定的蛋白分子量是105KD，按理说分离胶应当采纳%，但我所查资料却要求分离胶和浓缩胶均采纳11％的配方，不知为何？

上述您提到的两种凝胶均能够利用，因为105ＫＤ的蛋白在上述两种胶的线性分辨范围内，但需注意条带位置。

L.接下来我预备采纳DAB显色技术，二抗是生物素化的多克隆抗体，三抗是亲和素生物素体系，不知采纳如此的方案后，封锁液是不是要作调整，可否再用5％的脱脂奶粉呢？

仿佛有资料说脱脂奶粉会阻碍亲和素生物素的生成，是吗？

不能利用脱脂奶粉，因为脱脂奶粉中含生物素，用ＢＳＡ代替应该好一点．

M.还有一问题，一样一次上样的蛋白总量是多少，跟目的蛋白的表达量有关系吗？

WesternBlot一样上样30－100微克不等，结果跟目的蛋白的丰度、上样量、一二抗的量和抚育时刻都有关系，也与显色时刻长短有关。

开始摸条件时，为了拿到阳性结果，各个步骤都能够量多一点时刻长一点，固然背景也就出来了。

要拿到好的结果，若是抗体好的话比较容易，抗体不行的话就需要反复地试了，固然有的不适合WesternBlot的如何做也不行。

因此拿到好的结果不容易。

N.做组织样品的western的时候，处置样品有什么窍门吗？

还有，您用过大牛血清做封锁剂吗？

浓度如何？

成效是不是比BSA好一点？

必需进行研磨、匀浆、超声处置，蛋白质溶解度会更好，离心要充分，膜蛋白需用更剧烈的方式抽提，低丰度膜蛋白可能还要分步抽提（超速离心）。

还有一点确实是组织中的蛋白酶活性更强，需要注意抑制蛋白酶的活性（加入ＰＭＳＦ和蛋白酶抑制剂cocktail），封锁剂一样5%脱脂奶粉较经常使用。

若是一抗为多克隆抗体，利用ＢＳＡ也是不错的选择。

O.您是不是能够介绍一下大分子量蛋白200KD，在做western要注意什么呢？

做200kd蛋白的WesternBlot时要注意，分离胶最好选择>

7%的；

剥胶时要警惕；

转移时刻需要相应延长；

要做分子量参照（不然显现杂带不明白如何分析）。

P.有什么方式能够提高上样量？

能够浓缩样品；

增大上样体积来增大上样量。

Q.我要检测的目的蛋白是分子量可能为42kd的膜蛋白，膜蛋白提取可不能够不用到超速离心机，有无直接用低温高速离心机就能够够的提到膜蛋白的方式，42kd的蛋白分子量算不算大？

如是需要提取膜蛋白，（而不是只需要提取膜蛋白），能够用Ripabuffer提取膜蛋白和胞浆蛋白，用那个做WesternBlot就能够够了。

若是是非要只提取膜蛋白就要用到超速离心机。

42kd不算大，也不算小，因此，能够依照一样的转移方式实施。

R.蛋白的上样量有无什么具体的要求？

上样量要依如实验的要求来定，若是要求是定量和半定量的WesternBlot那么上样量要均等，若是只是要定性，那么没有太大的关系，尽可能多上就好了，可是不要超过μg/mm2。

S.一抗，二抗的比例是不是重要？

比较重要，调整好一抗，二抗的比例，能够去掉部份非特异的本底。

T.做细胞信号传导，要做磷酸化某因子WesternBlot，其二抗有何要求？

对二抗无要求，要看你实验条件来选择，一样推荐用HRP标记的二抗。

U.同一公司的另外抗体用那个稀释度做出来成效专门好，因此没做预试，怕费时刻，用什么样的稀释度比较好呢？

我用的ELL+plus试剂盒显色。

转膜留宿，一抗孵育也是留宿的，假设封锁也留宿的话就要四天才看的到结果了。

不同抗体，即便是同一公司的抗体，其最正确的抗体稀释度也是不一样的，需要你实验试探。

我感觉转膜留宿仿佛没有必要吧，转膜的目的也确实是将蛋白转到膜上就行啦，何须浪费时刻呢。

至于具体的转膜时刻，还要看你的目的蛋白分子量的大小；

转膜的设备，是半干式，仍是湿式。

一抗固然能够留宿，若是你想所短WesternBlot时刻的话，能够增高一抗的孵育温度，咱们实验室一样37度，两小时就足够了；

你能够参照抗体说明书。

至于一抗和二抗得稀释度，你能够一抗1：

1500；

二抗1：

20000试试。

另外建议你洗膜时，多洗几回，最好是在封锁；

一抗和二抗后至少是5x5min，跑一张好膜不容易，多尽点心吧，如此可不能浪费你的时刻，只会节省你的时刻！

V.免疫组化和WesternBlot能够用同一种抗体吗？

免疫组化时抗体识别的是未经变性处置的抗原决定簇（又称表位），有些表位是线性的，而有的属于构象型；

线性表位不受蛋白变性的阻碍，天然蛋白和煮后的蛋白都含有；

构象型表位由于受蛋白空间结构限制，煮后变性会消失。

若是你所用的抗体识别的是蛋白上持续的几个氨基酸，也确实是线性表位，那么这种抗体可同时用于免疫组化和Western，而若是抗体识别构象形表位，那么只能用于免疫组化。

一样抗体说明书上都有注明此种抗体识别的氨基酸区间。

（限于单抗）

W.WesternBlot中抗体的重复应用问题

抗体工作溶液一样不主张贮存反复利用，可是如抗体比较宝贵，可反复利用2－3次。

稀释后应在2－3天内利用，4度保留，幸免反复冻融。

X.NC膜\PVDF膜\尼龙膜如何辨别？

尼龙膜是较理想的核酸固相支持物，有多种类型；

硝酸纤维素膜是目前应用最广的一种固相支持物，价钱最廉价；

PVDF膜介于二者之间。

就结合能力而言：

尼龙膜结合DNA和RNA能力可达480－600μg/cm2，可结合短至10bp的核酸片段；

硝酸纤维素膜结合DNA和RNA能力可达80－100μg/cm2，关于200bp的核酸片段结合能力不强；

PVDF膜结合DNA和RNA能力可达125－300μg/cm2。

就温度适应性而言：

尼龙膜经烘烤或紫外线照射后，核酸中的部份嘧啶碱基可与膜上的正电荷结合；

硝酸纤维素膜依托疏水性彼此作用结合DNA，结合不牢固；

PVDF膜结合牢固，耐高温，专门适合于蛋白印迹。

就韧性而言：

尼龙膜较强；

硝酸纤维素膜较脆，易破碎；

PVDF膜较强。

就重复性而言：

尼龙膜可反复用于分子杂交，杂交后，探针分子可经碱变性被洗脱下来；

硝酸纤维素膜不能重复利用；

PVDF膜能够重复利用。

Y.在做WesternBlot时，PBDF膜用甲醇浸泡的目的？

PVDF膜用甲醇泡的目的是为了活化PVDF膜上面的正电基团，使它更易跟带负电的蛋白质结合，做小分子的蛋白转移时多加甲醇也是那个目的。

Z.检测磷酸化的JNK和非磷酸化的JNK能够在同一张膜上吗？

能够。

AA.转膜后经丽春红染色的条带，什么缘故大蛋白分子的一端（即点样空的一侧）的转膜好象不是专门好，什么缘故？

这是正常的，大分子的蛋白转移的慢，你延长转移时刻和电流，大分子一端就会好的多，可是小分子的就有可能会变淡。

BB.我想问您裂解细胞用三去污裂解法，仍是用上样缓冲液？

用上样缓冲液，如此有几个益处，能够提取总蛋白，同时又能够让磷酸化酶失活。

CC.采纳tanksystem有什么讲究？

建议低电压，长时刻，（一样tankSystem用衡压好点），如28V14－16hrs。

DD.做HSPWESTEN定量，一样的抗体免疫组化能做出，而WESTEN却不能？

这多半是抗体的问题，要看抗体的说明，是不是能做WesternBlot和IHC。

EE.膜一样要如何处置？

一样用甲醇泡泡就能够够了。

FF.若是是6×

8转印膜，要加多少一抗？

一抗的稀释度是有说明的，依照你的一抗看看就明白了，可是那么大的膜孵育体积一样最少为3－5ml。

GG.上下槽缓冲液有何要求，如何才能达到最正确成效。

无要求。

HH.跑电泳的时候配的胶老是“缩”是什么缘故呢？

是有的成份不对吗？

没什么问题，确实是你胶里的水分被蒸发了。

留宿时拿保鲜膜包起来，在里面加点水维持湿度就能够够了。

若是留宿，胶里的水分被蒸发，采纳保鲜膜包上也能够；

也可能母液（30%聚丙酰胺）有问题，你能够从头配制一份观看；

能够替换的试剂，尽可能换一下，选用好的试剂，幸免找问题麻烦。

脱色液中甲醇的含量太高也会造成胶缩。

II.膜、滤纸、胶大小有何讲究？

若是是用的是半干转，顺序为：

阴极－》滤纸－》胶－》膜－》滤纸。

滤纸的长宽别离比胶小1－2mm，而膜的长宽别离比胶大1－2mm。

绝对禁忌：

上下两层滤纸因为过大而彼此接触，如此会短路，电流可不能通过胶和滤纸。

JJ.蛋白质的分子量跨度专门大，如要分离小21KD，中至66KD，大至170KD，能够一次做好吗？

这么广的散布不行转移，一样建议：

21kd和66kd能够一路转，12％SDS-PAge，湿转36V，3－5hrs就能够够了，能够依照你实验室的体会调剂；

170kd用7%SDS－page，48V10hrs－16hrs。

KK.不能专门好地将大分子量蛋白转移到膜上，转移效率低怎么样解决？

能够考虑：

转移缓冲液中加入20%甲醇（是指终浓度）（优化的转移缓冲液，能够参考《蛋白质技术手册》），因为甲醇可降低蛋白质洗脱效率，但可增加蛋白质和NC膜的结合能力，甲醇能够避免凝胶变形，甲醇对高分子量蛋白质可延长转移时刻；

转移缓冲液加入终浓度%SDS，也是为了增加转移效率；

用优质的转移膜，或利用小孔径的NC膜（微米）；

利用戊二醛交联；

低浓度胶，如低至6％。

太大时还能够考虑用琼脂糖胶；

提高转移电压／电流；

增加转移时刻。

LL.如何选择最适合的蛋白杂交膜？

蛋白质印迹杂交是分子生物学实验中极为经常使用的一门技术。

选择质量上层、合乎要求、方便适用的杂交膜是决定这项实验成败的重要环节。

依照杂交方案、被转移生物大分子的特性和分子大小等等因素，咱们要量文体衣，从杂交膜的材质、孔径和规格上都要做出合理的选择。

硝酸纤维素膜：

硝酸纤维素膜是蛋白印迹实验的标准固相支持物。

在低离子转移缓冲液的环境下，大多数带负电荷的蛋白质会与硝酸纤维素膜发生疏水作用而高亲和力的结合在一路，尽管这其中的机制还不是十分清楚，但由于硝酸纤维素膜的那个特性，而且易于封锁非特异性结合，从而取得了普遍的应用。

在非离子型的去污剂作用下，结合的蛋白还能够被洗脱下来。

依照被转移的蛋白分子量大小，要选择不同孔径的硝酸纤维素膜。

因为随着膜孔径的不断减小，膜对低分子量蛋白的结合就越牢固。

可是膜孔径若是小于，蛋白的转移就很难进行了。

因此，咱们通经常使用μm和μm两种规格的硝酸纤维素膜。

大于20kD的蛋白就能够够用μm的膜，小于20kD的蛋白就要用μm的膜了，若是用μm的膜就会发生“Blowthroμgh”的现象。

从膜的质地上来看，最重要的指标确实是单位面积上能够结合的蛋白的量。

硝酸纤维素膜的结合能力要紧与膜的硝酸纤维素的纯度有关，市场上有些硝酸纤维素膜通常会还有大量的醋酸纤维素，因此降低了蛋白的结合量。

S&

S公司采纳的是100%纯度的硝酸纤维素，保证了最大的蛋白结合量，可达80-150μg/cm2。

由于100%的纯度，因此也大大减少了非特异性的结合，降低杂交背景，无需高严谨度的洗脱步骤。

第二，膜的强度和韧性也是需要考虑的因素。

常规的硝酸纤维素膜比较脆，漂洗一两次就会破损，不能反复利用。

PVDF转移膜：

PVDF是一种高强度、耐侵蚀的物质，一般是用来制造水管的。

PVDF膜能够结合蛋白质，而且能够分离小片段的蛋白质，最初是将它用于蛋白质的序列测定，因为硝酸纤维素膜在Edman试剂中会降解，因此就寻觅了PDVF作为替代品，尽管PDVF膜结合蛋白的效率没有硝酸纤维素膜高，但由于它的稳固、耐侵蚀使它成为蛋白测序理想的用品，一直沿用至今。

PVDF膜与硝酸纤维素膜一样，能够进行各类染色和化学发光检测，也有很广的适用范围。

这种PVDF膜，灵敏度、分辨率和蛋白亲和力在精细工艺下比常规的膜都要高，超级适合于低分子量蛋白的检测。

但PVDF膜在利用之前必需用纯甲醇进行浸泡饱和1-5秒钟。

离子互换型转移膜：

硝酸纤维素和PVDF膜是靠疏水作用结合蛋白的，还有一类膜是依照离子互换的方式结合生物大分子的。

由DEAE（二乙氨乙基）修饰的纤维素制成的DEAE阴离子互换膜一样能够作为蛋白质印迹的固相支持物。

DEAE能够有效的结合阴离子基团，包括那些高于其等电点的蛋白质。

在pH10以下，DEAE基团都能带电荷，在低离子强度的转移液中结合蛋白分子。

其最适的pH环境为5-7。

DEAE膜能够用于蛋白多糖、病毒、酶和血红蛋白的研究。

这种μm孔径的DEAE膜，除能够做WesternBlotting外，还能够用于核酸结合研究。

还有一种离子互换型膜是羧甲基（CM）修饰的纤维素膜，它能够结合蛋白和多肽分子，和其他的一些带正电荷的样品，最适结合pH范围在4-7。

结合的多肽分子能够从CM膜上洗脱下来，用于氨基酸系列分析或微测序。

MM.我用的是可视marker（BIO_RAD），可是电泳总跑不全8条带，请问什么缘故？

如何改善？

胶用过8％，10％，12％，都是如此。

marker是新买的。

一样来讲，是小分子量Marker跑走了，增加胶浓度或减少电泳时刻碰运气。

固然梯度胶也是不错的选择。

NN.用的是RochemolecularBiochemicals公司的由100kd，75kd，45kd，30kd，20kd，10kd组成的marker。

开始做WesternBlot时还能够看到marker，固然也仅能看见其中最多三条带。

用80V进行SDS-PAGE电泳，用恒压10V45min转印的。

前几回做WesternBlot时没有进行丽春红染色，但尽管用了此方式也仅能看到marker有一条大约是30KD的条带显现。

再确实是把70KD和130KD两个目的蛋白同时在一块胶上进行分析，用培育基样品进行分析，没有效间接法，而是直接用融合蛋白C端的V5表位的酶联抗体（Anti-V5-HRP）。

但确实是出不来结果，我很茫然。

谢谢您过给予指点！

一、“我用的是RochemolecularBiochemicals公司的由100kd，75kd，45kd，30kd，20kd，10kd组成的marker。

”有的时候，PrestainedMarker放久了成效就会变差，电泳是条带不清楚，扩散。

可是你的问题可能还有其他的方面的问题，可能是蛋白跟膜结合的不紧密。

转移是多加点甲醇。

二、“前几回做WesternBlot时没有进行丽春红染色，但尽管用了此方式也仅能看到marker有一条大约是30KD的条带显现。

”转移时半干法建议用恒流，你