转基因小鼠在生命科学中的研究进展毕业论文文档格式.docx
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转基因小鼠构建主要过程分为三步:
第一步，明确实验动物在特定专业研究中的利害，根据研究需要建立相应的稳定繁育系统，按实验的动物质量标准进行遗传学、微生物学、饲养管理等方面的标准化。
第二步，利用分子生物学技术制备目的基因，构建基因载体，再用转基因技术将该外源目的基因转入受精卵。
第三步，分析评估含外源基因鼠的优缺点、生理生化特性及预测或解释外源基因在鼠体系统中的表型，用实验动物繁育技术（包括回交、侧交、杂交等）建立生物学性状限定的基因工程动物[6]。
基因工程小鼠实验动物标准化的过程主要包括：
首先，质量控制是标准化的基础，其中遗传、微生物和标准品系的保种育种是质量控制的核心。
遗传质量标准按动物用途，选择各种近交系，利用杂交、回交等技术建立具有稳定遗传背景的小鼠品系，用PCR等技术测定外源基因的整合状况。
微生物质量标准控制按微生物种类限定要求，用剖腹产技术和屏障饲喂技术分别产生无菌（GF）鼠、悉生鼠及SPF鼠。
保种育种是转基因小鼠能保存及推广应用的关键，目前多采用胚胎冷冻保存鼠种或精子冷冻保种技术。
其次，对工程鼠具有的优点和缺陷、生物学功能或疾病模型特性等详细资料登记注册，建立管理信息系统是基因工程鼠推广应用的前提，最后，还得建立并提供相关的繁育技术，如体外授精（IVF）、合子低温保存、胚胎移植、胚胎分割及保姆鼠等辅助繁育技术，这样才能保证基因工程鼠的广泛应用[7]。
2.2构建转基因小鼠的主要技术
2.2.1原核显微注射法
该方法是制作转基因动物应用最广、效果最好的方法，由美国人Cordon所发明。
加州大学医学院ThePingLin博士早在1966年即利用小鼠受精卵原核显微注射技术，系统地研究了微注射不同量外源物质（石蜡油、牛Y一球蛋白溶液）对小鼠胚胎受体移植后的分裂、发育的影响程度，并预见该技术用于研究小鼠或其它种类哺乳动物胚胎分化及遗传效应具有潜在价值[8]。
直到1980年，随着分子生物学技术的迅速发展，Gordon等[1]首先用受精卵原核注射法,将疱疹病毒基因SV40DNA段和PBR32DNA段分别注射到小鼠原核期的胚胎中,获得了相应的转基因小鼠后，该项技术在建立人类疾病动物模型，加速哺乳动物育种进程、研究真核生物（主要是哺乳动物）基因表达调控机制，以及在哺乳动物特异组织（如血液、乳腺）系统生产人的药用蛋白等方面，展示了广阔的应用前景。
该方法通过将外源基因或体外构建的目的基因在显微操作仪下用极细的微吸管直接注射到处于原核期的受精卵原核中，再将注射后的受精卵体外培养数小时后移植到母畜体，从其后代中获得转基因动物。
通过该方法可以把较大片段的重组DNA注入原核，获得的转基因动物能有效地表达外源基因，是获得转基因动物最可靠的方法。
Palmiter等[4]人于1982年首次采用该技术成功地将人的生长激素基因，导入小鼠受精卵的雄原核中，并获得整合及表达该外源DNA的超级转基因“硕鼠”后，新型“硕鼠”比普通对照小鼠生长速度快2-4倍，体型大一倍，开创了显微注射技术用于培育转基因哺乳动物的里程碑。
随后，Hammer等[5]又应用该方法相继获得了转基因兔、转基因绵羊、转基因猪，Roschlau、Ebert等[9]利用该技术获得转基因牛及转基因山羊。
此外，采用该项技术，除了培育转基因哺乳动物之外，朱作言等人于1986年育成了转基因鱼及转基因鸡[10]，这也间接证明显微注射方法在培育转基因动物上的广阔前景。
但该法成本较高、转基因效率较低，只能在受精卵的原核期进行转基因操作，而且导入的外源基因为单位点、多拷贝整合，这样的整合方式容易导致外源基因首尾相连，给整合位点的克隆带来困难，不利于研究基因的结构、功能及表达调控，同时，该方法只能使DNA量增加，不能删除或在某个位点修饰，而且整合有较大的随机性，也不能定点整合。
当外源基因被注入到原核后，可以插入到受体染色体基因组任何一个的部位，完全随机，基因的表达和遗传稳定性得不到保证[11]。
2.2.2体细胞核移植法
哺乳动物体细胞核移植研究的蓬勃发展始于“Dolly”羊的诞生。
1997年，英国Roslin研究所的Wilmut等[12]利用成年绵羊乳腺上皮细胞作为核供体，成功获得了体细胞克隆绵羊“Dolly”，拉开了动物体细胞克隆的帷幕。
同时，相对其他哺乳动物而言，小鼠由于其繁殖周期短、材料来源比较容易，成为重要的模式实验动物。
如今，已经利用卵丘细胞、雄性小鼠尾尖细胞、ES细胞、卵泡上皮细胞、尾尖成纤维细胞、转基因ES细胞、未成熟支持细胞、颗粒细胞、胎儿成纤维细胞、未成熟神经细胞和已分化的神经细胞以及10.5d胚胎的原生殖细胞等多种细胞成功克隆了小鼠，并且把核移植技术和胚胎干细胞技术相结合也获得了来源于T-淋巴细胞、B-淋巴细胞和嗅觉神经元的克隆小鼠，另外小鼠的再克隆研究也获得了成功，得到了第6代再克隆小鼠[13]。
伴随克隆技术的不断发展，利用携带外源基因的培养细胞进行核移植的方法逐步建立。
该技术主要包括两个步骤:
首先，将外源基因插入体外培养的动物体细胞染色体的特定位点。
然后，筛选出阳性克隆，通过特定的移植手段（常用的有：
“Honolulu”法、连续核移植法、电融合方法、二倍体-四倍体嵌合体法）[14]将阳性克隆移植到去除细胞核的卵细胞中，产生重构胚胎，再将重构胚胎移植到动物母体中，从其后代获得携带目的基因的个体。
优点：
减少受体动物的数目，不需要受体母畜承担非转基因胚胎，表现出强大的生命力；
事先在细胞中进行基因转移和对阳性细胞的筛选，简化了转基因动物生产的许多环节，节约了人力。
但目前，该技术还不成熟，很多技术细节还有待完善和提高。
2.2.3反转录病毒载体法
该方法主要利用反转录病毒LRs（长末端重复序列）区域具有转录启动子活性这一特点，将外源基因插入反转录病毒的基因组中，病毒感染寄主细胞后，外源基因就被整合到受体基因组中。
具体方法是在动物早期胚胎的培养液中加入载体病毒，或将胚胎与病毒细胞共培养，还可以把载体病毒注入囊胚腔中获得转基因动物。
1974年，Jaenishch等[3]将SV40病毒DNA注入小鼠胚腔中，获得了体有SV40DNA整合的转基因小鼠。
1975年，Jaenish用小鼠（Moloney）白血病毒（MoMLV）作为载体，将外源基因导入小鼠胚腔中，发现病毒转染的小鼠胚胎可以发育成携带病毒基因的小鼠，MoMLV可在成年小鼠体重新被激活，使小鼠发生白血病。
1998年，Bremel等将逆转录病毒直接注入卵母细胞中获得了转基因牛。
体细胞核移植技术是研究细胞核-质关系的重要手段[15]。
由于小鼠是重要的模式动物,其遗传背景相对较清楚，因此具有更加重要的意义。
该方法是目前应用较成功的一种转基因方法，操作简单，能有效将目的基因以单拷贝形式插入宿主染色体，基因表达效率较高。
但该法成功率较低，产生的转基因动物多为嵌合体，病毒载体构建复杂，转入的外源基因大小收到限制，容易发生转入病毒自身基因的复制表达。
2.2.4胚胎干细胞介导法
经过20多年的发展,动物转基因技术在其多样性和实用性方面均取得了显著的进步。
尤其是随着近几年发展的几项新技术,使转基因动物的研究发生了历史性的飞跃。
通过生殖干细胞介导的转基因技术、对胚胎干细胞以及体细胞等进行基因打靶的定点整合转基因技术、RNA干扰介导的基因沉默技术以及诱导多能干细胞（iPS）技术，大大提高了转基因动物制备效率,使基因表达的精确调控成为现实。
胚胎干细胞（ES细胞）是指囊胚期的细胞团中尚未进行分化的细胞，这种细胞具有类似癌细胞的无限繁殖和高度分化潜能，将目的基因转入ES细胞后将其重新导入囊胚或对转入外源基因的ES细胞进行克隆，可培育出转基因个体[16]。
1986年，Roberoton等利用携带neo基因的逆转录病毒载体转化小鼠的ES细胞，将转化后的ES细胞注入小鼠的囊胚中，获得了有neo基因表达的转基因小鼠。
此后，Piedrahita等于1988年从猪胚胎中获得了干细胞克隆系，Stirce和Srtethenko等1996年获得了牛的胚胎干细胞，为转基因在动物上的定点整合开创了新的领域。
利用该方法，外源基因的整合率较高，但产生的转基因动物均为嵌合体，不易建立ES细胞系[17]。
所以，目前其应用受到限制。
2.2.5精子载体法
精子载体法是一种直接用精子作为外源DNA载体的基因转移方法，将精子直接与外源DNA混合培养，利用共孵育法、电击法、脂质体法等方法促进外源DNA与动物精子结合使外源基因进入精子头部，精子与卵子结合后能直接发育成转基因动物，但外源基因的整合率比较低。
1989年，Lavitrano等[18]首次报道用精子作为载体进行转基因获得了转基因小鼠。
十年后，Anthony等[19]改进了这种方法，他先用去垢剂、冻融或冻干等损伤小鼠精子的外膜，使外源DNA可穿过外膜，吸附于膜，接触到高密度的精子DNA，然后将精子注入MII期的小鼠卵子中，获得表达外源基因的胚胎，再将桑葚胚或囊胚移至假孕母鼠的子宫，从其后代群体中获得携带外源基因的小鼠。
该方法利用精子的自然属性，克服了人为机械操作给胚胎造成的损伤，整合率较高，成本较低，但转基因效果不稳定，无法早期验证修饰事件。
2.2.6电脉冲法
电脉冲法又称电穿孔法，是将供体DNA与受体细胞充分混匀，在外界的高电压短脉冲下改变细胞膜结构，使细胞膜产生瞬间可逆性电穿孔，从而使一定大小的DNA可以通过细胞膜，运送到细胞核。
目前，在动物中电脉冲法主要用来转化胚胎干细胞。
2.2.7其他方法
除上述几种常用的转基因方法外，人们为了一些特殊需要还探索出一些其他方法，如畸胎细胞介导法、受体介导法、染色体片段显微注射法、高效微弹法等，但这些方法均因不太成熟而未被广泛使用。
3转基因小鼠应用
3.1人类疾病小鼠模型
近年来，随着分子遗传学和转基因技术的不断发展和完善，转基因小鼠与生命科学研究的关系越来越密切，比如利用转基因技术构建的转基因小鼠作为疾病模型，在疾病机理研究还是在药物筛选方面都比传统的动物模型更省时、省力。
许多种转基因小鼠模型的不断建立，已经为神秘的生命科学研究提供了十分便捷的研究平台。
3.1.1肿瘤疾病模型
该技术在肿瘤研究中主要用于创建转基因的肿瘤小鼠模型。
转基因小鼠技术创立后，即被应用于肿瘤研究。
目前，用于肿瘤血管形成的转基因鼠模型主要有三种:
一是RIP一Tag转基因鼠，系胰岛B细胞肿瘤，由癌基因SV4诱导，受胰岛素基因调控区控制；
二是BPVI.69转基因鼠，系皮肤纤维肉瘤，由乳头状瘤病毒基因组诱导；
三是K14-HPV16转基因鼠，系表皮鳞癌，源于基底角质细胞，主要表达人乳头状瘤病毒16型癌基因，由角蛋白14基因调控区控制。
这些模型能很好地模拟体的生理、病理环境，与所要研究肿瘤的发生过程具有很好的一致性，而且可模拟部分癌前病变。
癌前病变的研究已经成为当今研究的一个热点，阐明癌变前期各种瘤基因、抑瘤基因相互作用的分子机制无疑对肿瘤的预防和治疗均会产生重要的促进作用，并成为研究各种肿瘤发生机制的有力手段。
3.1.2药物筛选与新药评价的模型
新研发的药品在用于临床之前首先要进行动物试验，因此一定的动物模型是必需的，但许多疾病没有适当的动物模型来进行药效的评价。
如乙型肝炎的自然宿主只有人类和灵长类动物，而灵长类动物来源有限，价格昂贵。
而利用转基因动物用于药物筛选，避免了传统的动物模型与人类相似的疾病致病原因而机理不尽相同的缺点，其结果准确、经济，试验次数少，试验时间大大缩短，现已成为人们试图进行药物“快速筛选”的一种手段。
目前，已经培育出较多的转基因动物用于药物筛选研究，并已在抗糖尿病药物、抗肿瘤药物、抗艾滋病病毒药物、抗肝炎病毒药物、肾脏疾病药物的筛选中取得突破性进展。
其中糖尿病模型db/db转基因小鼠就是一个很典型的例子。
现在不但有人用这样的转基因小鼠进行药效评价，还用来进行疫苗效果的观察。
3.1.3病毒性病症模型
近年，虽然医学有了很大的进步，但病毒性疾病对于人类健康的威胁从没有减弱，其中乙型肝炎是目前流行广泛、危害严重的病毒性传染病。
由于一般实验动物对乙型肝炎病毒（HBV）不易感，目前发现能够感染HBV的动物只有灵长类，因此使得对HBV致病机理的研究很难用动物实验的方法来进行。
HBV转基因小鼠的建立，为探讨HBV的致病机理提供了有价值的动物模型。
研究发现在转基因小鼠肝细胞乙型肝炎病毒表面抗原（HbsAg）的过度表达和堆积，是导致肝细胞损伤的直接原因。
由于乙型肝炎病毒表面抗原在细胞的堆积可使肝细胞出现肿大、积水并出现“毛玻璃样”变样，最终导致肝脏的炎症、增生。
而且HBV基因的过度表达还可引起肝细胞转化而发生癌变。
这些研究结果使得人们对HBV的致病机理的认识前进了一步。
3.1.4心血管疾病模型
与血压调控有关的如renin一angiotensinogen转基因鼠高血压模型，用于研究RAS（renin一angiotensinogensystem）中各成分致高血压的作用以及相互关系。
与动脉粥样硬化和脂质代谢有关的如LDL受体转基因动物可增强LDL的清除。
而基因敲除鼠如renin一angiotensinogen基因敲除出现低血压转基因鼠，LDL受体或apoE基因敲除鼠则出现高脂血症和动脉粥硬化等。
此外心肌病、心脏肥大、心力衰蝎等转基因鼠模型均对心血管病的病因、发病机制及治疗研究发挥了重要作用。
3.1.5代谢性疾病模型
人类的代谢性疾病的危害越来越引起人们的关注，这种疾病的动物模型过去只能靠自然突变或人工诱导的方法获得。
自然突变的机会极小，人工诱导的方法又不易控制，因此都不能满足日益发展的代谢性疾病研究工作的需要。
例如科学家通过对家族性神经多发性粉样变（familialamyloidoticpolyneuro-Pathy，FAP）转基因小鼠模型的研究结果表明，变异淀粉样蛋白基因表达从胚胎期就可见到，而变异淀粉样蛋白沉着则发生于青春期，以后随着年龄的增加，沉着量逐渐加大，这就为FAP的机制研究莫定的基础。
3.1.6遗传疾病模型
在人类遗传病的研究中，适当的动物模型对研究基因突变在遗传病中的作用是必不可少的。
转基因动物在遗传病的研究中具有重要的应用价值，被认为是遗传学研究中继连锁分析、体细胞遗传和基因克隆技术之后的第四代技术。
用转基因动物的方法构建人类遗传病的模型可为遗传病研究提供理想的动物模型，为深人研究遗传病的发病机理以及基因治疗创造了前所未有的条件。
3.1.7药物毒理模型
在毒理学研究中，化学物质对基因的损伤作用是一个研究热点。
现在已经建立了研究化学毒物对DNA损害作用的转基因动物模型。
如LacZ基因转基因小鼠就是一个很好的例子。
这种转基因小鼠模型不但在毒理学研究中，而且在DNA损伤、瘤变以及多种疾病的治疗和正常老化的研究中都有重要应用价值。
3.2基因表达调控、基因功能及发育调控作用的研究
近些年转基因小鼠模型在发育生物学、神经生物学等它基础生物科学的研究中也有了长足的进步。
3.2.1Hoxgene（同源异形盒基因）
同源异形盒基因（Homeoboxgene）是一类发育调控基因，自1954年Gehring的实验室和Seott的实验室同时发现同源异形盒基因以来（MeGinnistal，1984；
Seottetal，1984），关于同源异形盒基因在动物胚胎发育中表达的研究已有很大进展，但这类基因在成年哺乳动物生殖系统中表达的研究却较少[20]。
国外曾报道有些同源异形盒基因在哺乳动物雄性生殖组织中表达，如Hox、POU和Pax等基因族的一些成员（Lindseyetal,1996；
Eddyetal，1993；
Andersenetal，1993），孤儿同源异形盒基因Pem（Lindseyetal,1996），以及Gtx（Komuroetal，1993）等基因的转录本出现在成年大鼠和小鼠精子细胞分化前的生精细胞，或睾丸、附睾的体细胞中，表明同源异形盒基因可能在哺乳动物精子发生过程中有调控作用。
但关于同源异形盒基因在精子细胞分化为精子过程中的表达及其调控作用迄今未见报道。
而在当今发育及生殖生物学研究领域里，哺乳动物精子发生和成熟中，精子细胞分化为精子的分子机制和遗传控制，一直是人们关注的热点之一。
3.2.2疾病基因
基因敲除是指通过DNA分子的同源重组，特异性地在基因组的某个位点引人预定的突变，获得基因型发生了改变的小鼠，以研究目的基因的体功能或相关疾病的致病机制。
20世纪80年代初，随着基因敲除技术的出现，为研究基因的功能和表达调控及人类多种疾病的分子机制开辟了新途径。
1987年，Capecchi在小鼠胚胎干细胞中实现了次黄嘌呤一鸟嘌呤磷酸核糖转移酶基因Hprt的首例定向敲除[21]。
到目前为止，通过基因敲除技术，已建立起近千种的基因敲除鼠模型，而以各种疾病相关基因的敲除鼠模型的研究为著。
这些疾病模型在探讨人类各种疾病的发病机制、疾病诊断、预防及基因治疗等方面有重大意义。
3.2.3学习与记忆基因
1992年9月2日，美国普林斯顿大学38岁的华裔科学家钱卓公布了一项震惊世界的研究成果———利用基因工程的方法，培育出世界首批“聪明鼠”[22]。
这标志着大脑基因遗传工程取得了突破性的进展,意味着人类可以借此孕育高智商的婴儿，同时也有助于研制治疗与年龄有关的记忆力丧失及老年痴呆症的药物。
钱卓等将老鼠的“NMDA神经未梢”的一部分进行了基因改造。
NMDA神经末梢由多种次单位组成。
其中之一被称为NR2B次单位，包括人类在的所有哺乳动物都有。
NR2B可以引导生产一种神经蛋白质，这种蛋白质有助于大脑的联想力,辨识两种事物之间的关系，如门铃声与送食物之间的关系。
NR2B次单位常见于年幼动物身上,而另一种NR2A次单位常见于年老动物身上,故幼者比老者更容易学习。
钱卓等研制出一种拥有充当制造NR2B次单位蓝图的额外基因的老鼠，并在这些额外基因前面插入DNA（脱氧核糖核酸）序列，使这些基因只在适当组织，尤其是前脑与海马趾中活化。
海马趾是一种与记忆力有关的脑部组织的一部分。
然后对这些经基因改造后的老鼠进行测试:
其一，必须记忆一个隐藏在乳白色水中的平台位置；
其二，辨识新奇物体的能力。
结果是经基因改造鼠一直优于正常鼠,既提高了智力，又增强了记忆。
钱卓认为，包括人类在的所有哺乳类动物，甚至鸟类,在性成熟之后，记忆力与学习能力都会下降,这是因为决定大脑活动的NR2B基因变得不活跃的缘故。
在决定智商的NR2B这个基因遗传上,人类与老鼠的相似性达到98%。
因此，钱卓的这一成果的重大意义在于，可以提高人类的智商,给某些病人带来新生。
如，借用遗传工程技术控制NR2B，把胚胎植入人体；
通过基因疗法，把神经蛋白注射到大脑里，以提高大脑的学习与记忆能力；
利用复制NR2B胚胎的生物技术研制药物，用于治疗先天心智迟纯的儿童和患有老年痴呆等症的病人[23]。
3.3转基因动物生物反应器研制
转基因动物生物反应器是指将具某种重要应用价值的生物活性蛋白基因导入动物受精卵或早期胚胎，培育转基因动物，使外源基因在动物的特定组织高效表达，再从这些组织的分泌液、浸出液或血清中分离提取目的基因产物。
目前，应用比较成熟生物反应器只要是乳腺生物反应器，用于生产多肽药物、蛋白质疫苗、酶类等。
动物乳腺生物反应器（MammaryBioreactor）是一种利用动物转基因技术在乳腺细胞中表达多肽药物、工业酶、疫苗和抗体等蛋白的技术[24,25]。
该技术具有低投入高产出的特点，其效率是利用以大肠杆菌和动物细胞培养技术的100倍，是一种非常有潜力的高新技术。
是目前应用最为广泛的一类生物反应器，通过基因工程的方法改造乳腺的功能有利于我们进一步研究乳腺癌的机制，提高乳汁的营养成分，甚至可以合成药物。
1987年，Gordon等[1]首次报道在小鼠的乳腺中表达了人的组织纤溶酶原激活剂（TPA）基因。
另外，具有抗病毒、抗肿瘤和免疫调节等多种功能的干扰素（（IFN）、白细胞介素（IL）、肿瘤坏死因子（TNF）等细胞因子早在20世纪80年代及90年代初期已被克隆并在小鼠乳腺中得到表达。
另一种用于肾性贫血、再生障碍性贫血、感染性贫血的细胞因子—人促红细胞生成素（humanerythro-protein,EPO）转基因小鼠已构建成功，乳汁中EPO含量达0.5ug/ml。
EPO能刺激人的红系造血干细胞的增殖分化，调节和维持血液红细胞的生理水平，在医学上具有重要医疗价值[26,27]。
目前国外主要用CHO细胞表达制备，一旦EPO能在大型哺乳动物乳腺中生产，其经济效益将不可估量。
我国的转基因动物乳腺生物反应器研究的起步也较早。
国不少单位相继开展与动物乳腺生物反应器相关的探索和研究，目前己获得表达20余种外源基因的转基因小鼠、兔、绵羊和山羊。
4转基因小鼠技术发展前景
4.1转基因小鼠技术发展中的一些问题
在短短30多年年中的研究，转基因小鼠技术对生物医学研究的冲击是无法估量的。
但其作为实验动物科学的新领域，在我国的发展仍相对落后，才处于起步阶段，国家或企业的资助也不够，从事该领域研究的实验动物科学家队伍还很小，目前仍需国家重点投资研究。
对于转基因小鼠技术应用研究本身而言，研究含外源基因或产生基因突变的实验小鼠时不仅
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